楊子萍，李大命，劉燕山，楊家新

(1.南京師范大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇省內(nèi)陸水域漁業(yè)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210017)

翹嘴鲌(Culteralburnus)俗稱(chēng)白魚(yú)、翹嘴白絲、大白魚(yú)，隸屬鯉形目(Cypriniformes)、鯉科(Cyprinidae)、鲌亞科(Culterinae)、鲌屬(Culter)，是鲌亞科中最大的一種魚(yú)類(lèi)，廣泛分布于我國(guó)各水系[1]。翹嘴鲌是中國(guó)四大名魚(yú)之一，其生長(zhǎng)迅速、肉味鮮美、肉質(zhì)細(xì)嫩潔白、營(yíng)養(yǎng)豐富、經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高，已成為我國(guó)常見(jiàn)的淡水養(yǎng)殖品種[2-3]。翹嘴鲌為兇猛肉食性魚(yú)類(lèi)，是水域生態(tài)系統(tǒng)中的頂級(jí)消費(fèi)者，能有效控制小型魚(yú)類(lèi)種群數(shù)量，減輕小型魚(yú)類(lèi)對(duì)浮游生物的壓力，在水域生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[4-5]。多年來(lái)，由于環(huán)境污染、酷漁濫捕及棲息地破壞，野生翹嘴鲌資源遭到嚴(yán)重破壞，其種群數(shù)量急劇衰退，個(gè)體小型化、低齡化趨勢(shì)嚴(yán)重，恢復(fù)翹嘴鲌種質(zhì)資源成為亟待解決的問(wèn)題[6-7]。

目前有關(guān)翹嘴鲌的研究主要集中在生長(zhǎng)、繁殖、養(yǎng)殖技術(shù)、資源調(diào)查等方面[8-11]，而有關(guān)翹嘴鲌野生資源遺傳狀況亟待加強(qiáng)研究。遺傳多樣性即基因多樣性，是物種生存和進(jìn)化的基礎(chǔ)，也是評(píng)價(jià)物種資源狀況的重要參數(shù)[12]。動(dòng)物線(xiàn)粒體DNA(mtDNA)作為核外遺傳物質(zhì)，具有分子小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、進(jìn)化快、嚴(yán)格的母系遺傳等特點(diǎn)，已成為群體遺傳學(xué)和分子系統(tǒng)學(xué)研究的重要分子標(biāo)記[13]。其中，細(xì)胞色素b(Cytb)基因是mtDNA的蛋白質(zhì)編碼基因之一，其進(jìn)化速度適中，有通用引物便于擴(kuò)增和測(cè)序，被廣泛應(yīng)用于魚(yú)類(lèi)遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的研究，研究結(jié)果為魚(yú)類(lèi)種質(zhì)資源保護(hù)和管理提供了重要參考[14-16]。

太湖和洪澤湖分別是中國(guó)第三、第四大淡水湖泊，分屬于長(zhǎng)江水系和淮河水系。翹嘴鲌是太湖、洪澤湖常見(jiàn)的魚(yú)類(lèi)和重要的經(jīng)濟(jì)物種，但有關(guān)兩湖泊群體的遺傳結(jié)構(gòu)尚缺乏認(rèn)識(shí)。本研究采集太湖和洪澤湖翹嘴鲌，采用線(xiàn)粒體Cytb基因序列作為分子標(biāo)記，探究太湖和洪澤湖翹嘴鲌群體遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，以期為翹嘴鲌種質(zhì)資源的科學(xué)保護(hù)、合理利用及增殖放流提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

于2021年采用三重刺網(wǎng)在太湖和洪澤湖采集翹嘴鲌樣本，其中太湖(Tai Lake，TL)群體48尾，洪澤湖(Hongze Lake，HZL)群體50尾。經(jīng)測(cè)量和稱(chēng)重，太湖群體的平均體長(zhǎng)和體質(zhì)量分別為36.9 cm和682.3 g，洪澤湖群體的平均體長(zhǎng)和體質(zhì)量分別為34.0 cm和473.2 g。剪取翹嘴鲌肌肉組織置于無(wú)水乙醇中保存，帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.2 DNA提取、PCR擴(kuò)增和測(cè)序

取適量肌肉組織用于提取基因組DNA。采用TaKaRa公司試劑盒提取翹嘴鲌的基因組DNA，再將DNA溶于超純水，置于-20℃保存?zhèn)溆?。采用瓊脂糖凝集電泳檢測(cè)DNA完整性，并測(cè)定DNA的濃度和純度。

Cytb基因擴(kuò)增的引物為L(zhǎng)14724和H15915[17]，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系總體積為50 μL，其中包括2×Taq PCR Master Mix 25 μL，正、反向引物各2 μL (10 μmol/L)，DNA模板2 μL，ddH2O 19 μL。PCR條件：94℃ 4 min；94℃ 40 s，55℃ 40 s，72℃ 90 s，循環(huán)30次；72℃ 10 min。

采用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)合格的PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序引物與擴(kuò)增引物一致。

1.3 序列處理和分析

采用BioEdit 7.0軟件[18]和ClustalX 1.83軟件[19]對(duì)序列進(jìn)行編輯、校對(duì)和多重比對(duì)。采用DNASP 5.0軟件[20]計(jì)算遺傳多樣性參數(shù)：變異位點(diǎn)(Polymorphic sites，S)、單倍型數(shù)目(Haplotype number，N)、單倍型多樣性指數(shù)(Haplotye diversity index，Hd)、核苷酸多樣性指數(shù)(Nucleotide diversity index，Pi)和平均核苷酸差異數(shù)(Average number of nucleotide differences，K)。采用MEGA 7.0軟件[21]統(tǒng)計(jì)序列堿基組成，計(jì)算群體間的Kimura雙參數(shù)遺傳距離，利用鄰接法(Neighbor-joining method，NJ)構(gòu)建單倍型系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。采用Arlequin 3.5軟件[22]進(jìn)行分子方差分析(AMOVA)，計(jì)算群體遺傳變異來(lái)源、變異方差和遺傳分化指數(shù)；同時(shí)進(jìn)行Tajima′s D和Fu′s Fs中性檢驗(yàn)和核苷酸錯(cuò)配分析，推測(cè)群體歷史動(dòng)態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 翹嘴鲌Cyt b序列變異和遺傳多樣性

通過(guò)PCR擴(kuò)增和測(cè)序，獲得98條Cytb基因全序列。結(jié)果顯示，翹嘴鲌Cytb基因序列全長(zhǎng)為1 141 bp。Cytb序列共有29個(gè)變異位點(diǎn)，變異率為2.54%，有單一信息位點(diǎn)11個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)18個(gè)。98條Cytb序列堿基平均含量分別為A(29.3%)、T(26.6%)、C(29.4%)和G(14.7%)，堿基A+T的含量(55.9%)大于C+G的含量(44.1%)，呈現(xiàn)出明顯的堿基組成偏倚性。4種堿基的密碼子使用頻率有明顯差異，第一位點(diǎn)密碼子4種堿基含量近似；第二位點(diǎn)密碼子T含量最大，G含量最??；第三位點(diǎn)密碼子A含量最大，G含量最小(表1)。

表1 Cyt b基因序列堿基組成

98尾翹嘴鲌共定義29種單倍型(H1～H29)，平均Hd和Pi分別為0.923和0.002 74，平均核苷酸差異數(shù)為3.127。太湖和洪澤湖群體Hd分別為0.927和0.816，Pi分別為0.028 5和0.002 20，太湖群體的遺傳多樣性高于洪澤湖群體，但兩者都具有高Hd、低Pi的特點(diǎn)。太湖群體和洪澤湖群體分別有20種和14種單倍型，其中共享單倍型有5種(H1、H2、H4、H6和H24)，其他單倍型則為兩個(gè)群體所獨(dú)有。單倍型H2、H4和H20是群體中的優(yōu)勢(shì)單倍型，個(gè)體數(shù)量分別有10個(gè)、10個(gè)和20個(gè)(表2)。

表2 兩個(gè)翹嘴鲌群體的遺傳多樣性

2.2 群體遺傳結(jié)構(gòu)

分子方差分析結(jié)果顯示，群體間的遺傳變異占比為15.01%，群體內(nèi)的遺傳變異占比為84.99%。兩群體間的遺傳分化系數(shù)為0.150 15，且統(tǒng)計(jì)具有極顯著性差異(P<0.01)，表明兩群體有極顯著的遺傳分化(表3)。

表3 兩個(gè)翹嘴鲌群體的分子方差分析

2.3 單倍型聚類(lèi)分析

采用MEGA 7.0軟件計(jì)算翹嘴鲌單倍型之間的Kimura雙參數(shù)遺傳距離，結(jié)果顯示，單倍型之間的遺傳距離較小，變幅僅為0.000 877～0.007 06，均值為0.003 35。以蒙古鲌(Cultermongolicus，GenBank:AP009060.1)作為外類(lèi)群，采用NJ法構(gòu)建14個(gè)單倍型的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖1)。結(jié)果顯示，所有單倍型聚為一個(gè)大的進(jìn)化支，兩群體的單倍型混雜分布，暗示兩群體間存在一定程度的基因交流，并沒(méi)有形成與地理位置相對(duì)應(yīng)的遺傳結(jié)構(gòu)。

2.4 群體歷史動(dòng)態(tài)

中性檢驗(yàn)結(jié)果顯示(表4)，兩個(gè)群體的Tajima′s D值和Fu′s Fs值均為負(fù)值，但Tajima′s D檢驗(yàn)結(jié)果差異不顯著，F(xiàn)u′s Fs檢驗(yàn)結(jié)果具有顯著性差異(P<0.05)。將2個(gè)群體作為1個(gè)整體進(jìn)行中性檢驗(yàn)，Tajima′s D值和Fu′s Fs值分別為-1.348 72和-16.589 12，且Fu′s Fs檢驗(yàn)結(jié)果具有極顯著性差異(P<0.01)。同時(shí)，核苷酸歧點(diǎn)分布曲線(xiàn)呈典型的單峰型(圖2)，表明翹嘴鲌群體經(jīng)歷過(guò)顯著的群體擴(kuò)張事件。

表4 兩個(gè)翹嘴鲌群體的中性檢驗(yàn)結(jié)果

3 討論

3.1 翹嘴鲌遺傳多樣性

遺傳多樣性是生物進(jìn)化和適應(yīng)環(huán)境的基礎(chǔ)，Hd和Pi是評(píng)價(jià)群體mtDNA變異程度的主要指標(biāo)，Hd和Pi越大，表明群體的遺傳多樣性越豐富[23]。相比較而言，核苷酸多態(tài)性考慮各種mtDNA單倍型在群體中所占的比例，因而更能精確反映群體的mtDNA多態(tài)程度[24]。當(dāng)Pi值在0.001 5～0.004 7時(shí)，表明遺傳多樣性處于較低水平[25]。本研究結(jié)果顯示，太湖群體的Hd和Pi分別為 0.927和0.002 85，洪澤湖群體的Hd和Pi分別為0.816和0.002 20，表明兩個(gè)湖泊翹嘴鲌群體的遺傳多樣性均較低。一方面，受過(guò)度捕撈、環(huán)境污染、棲息地破壞等多種進(jìn)化壓力的影響，翹嘴鲌種群數(shù)量減少和基因多樣性降低[26-28]；另一方面，近年來(lái)開(kāi)展的翹嘴鲌人工增殖放流，使大量放流群體進(jìn)入太湖和洪澤湖，由于近親雜交和遺傳漂變等因素的影響，放流群體通常會(huì)丟失某些位點(diǎn)等位基因，致使遺傳多樣性普遍低于野生群體[29-30]。整體來(lái)看，翹嘴鲌的Hd和Pi分別為0.923和0.002 74。根據(jù)Grant W A S等提出的魚(yú)類(lèi)遺傳多樣性大小標(biāo)準(zhǔn)(Hd:0.5，Pi:0.005)[31]，表明翹嘴鲌遺傳多樣性呈現(xiàn)出高Hd、低Pi的特點(diǎn)。已有研究結(jié)果顯示：6個(gè)湖泊或水庫(kù))(興凱湖、南灣水庫(kù)、太湖、梁子湖、浮橋河水庫(kù)、三溪口水庫(kù))群體(Hd：0.605，Pi：0.001 63)[32]、6個(gè)湖泊(興凱湖、太湖、微山湖、洪澤湖、巢湖、洞庭湖)群體(Hd：0.915 0，Pi：0.002 60)[26]、長(zhǎng)江水系14個(gè)群體(Hd：0.866，Pi：0.003 30)[27]、珠江流域群體(Hd：0.873 6，Pi：0.008 93)[33]及滆湖群體(Hd：0.907，Pi：0.002 4)[34]，表明我國(guó)各水系及地理群體遺傳多樣性均呈現(xiàn)高Hd、低Pi共存現(xiàn)象，也指示翹嘴鲌種質(zhì)資源遺傳多樣性較低是一個(gè)普遍現(xiàn)象[26-28,32-34]。

另外，魚(yú)類(lèi)的遺傳多樣性模式與其進(jìn)化歷史密切相關(guān)，當(dāng)Hd≥0.5、Pi<0.005時(shí)，認(rèn)為是受瓶頸效應(yīng)影響后種群數(shù)量的迅速擴(kuò)張而導(dǎo)致，因核苷酸多樣性的積累時(shí)間比單倍型多樣性更漫長(zhǎng)得多，從而形成高Hd、低Pi模式[31]。通常利用中性檢測(cè)和歧點(diǎn)分布曲線(xiàn)推測(cè)群體的歷史動(dòng)態(tài)，若Fu′s Fs和Tajima′s D檢驗(yàn)結(jié)果為負(fù)值且具有顯著性差異，歧點(diǎn)分布曲線(xiàn)呈單峰型，則說(shuō)明序列中含有比中性進(jìn)化模型更多的核苷酸位點(diǎn)變化，可能預(yù)示種群經(jīng)歷過(guò)一個(gè)擴(kuò)張的歷史[35-36]。本研究結(jié)果顯示，翹嘴鲌?zhí)秃闈珊后w的Fu′s Fs和Tajima′s D中性檢測(cè)結(jié)果均為負(fù)值，F(xiàn)u′s Fs統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)具有極顯著性差異(表4)，且核苷酸歧點(diǎn)分布曲線(xiàn)具有典型的單峰型(圖2)，表明翹嘴鲌?jiān)跉v史上經(jīng)歷過(guò)群體擴(kuò)張事件[28]，形成了高Hd、低Pi的遺傳多樣性模式。

3.2 翹嘴鲌遺傳結(jié)構(gòu)

通常用遺傳分化系數(shù)Fst來(lái)反映各群體間遺傳分化程度，若Fst值在0～0.05之間，表示各群體間不存在分化；若Fst值在0.05～0.15之間，表示各群體間存在中度分化；若Fst值在0.15～0.25之間，表示各群體間存在高度分化[37]。本研究結(jié)果顯示，太湖和洪澤湖群體間的Fst值為0.150 15 (P<0.01)，表明兩群體間有極顯著的高度遺傳分化。從群體單倍型組成來(lái)看，兩群體擁有5個(gè)共享單倍型，太湖和洪澤湖群體分別擁有15個(gè)和9個(gè)特有單倍型，特有單倍型占比為82.8%，共享單倍型占比為17.2%，表明兩群體間基因交流較弱，已經(jīng)出現(xiàn)遺傳分化。已有研究表明，基于線(xiàn)粒體ND2序列的太湖和洪澤湖翹嘴鲌群體間Fst值為0.136 05(P<0.01)，顯示兩群體間有極顯著的中度遺傳分化[27]，與本研究結(jié)果類(lèi)似。一般來(lái)說(shuō)，地理隔離是導(dǎo)致群體間出現(xiàn)遺傳分化的重要因素。太湖屬于長(zhǎng)江水系，洪澤湖屬于淮河水系，因修閘建壩及生態(tài)環(huán)境差異導(dǎo)致群體間基因交流通道受阻,而產(chǎn)生遺傳差異。另外，群體的進(jìn)化歷史也是影響群體遺傳結(jié)構(gòu)的重要因素[38]。研究表明，長(zhǎng)江水系翹嘴鲌擴(kuò)張時(shí)間距今3萬(wàn)～4萬(wàn)年，為更新世晚期，早于最后一次大冰期[27]。本研究結(jié)果顯示翹嘴鲌?jiān)谶M(jìn)化過(guò)程中經(jīng)歷過(guò)顯著的群體擴(kuò)張事件，因此可以推測(cè)，隨著最后一次冰期結(jié)束，氣候變暖，翹嘴鲌可能由其避難所向外擴(kuò)散后發(fā)生重新殖化事件，從而逐漸形成現(xiàn)今的遺傳結(jié)構(gòu)模式。

3.3 翹嘴鲌種質(zhì)資源管理和保護(hù)

本研究采用線(xiàn)粒體Cytb基因序列對(duì)太湖和洪澤湖翹嘴鲌群體遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，可為翹嘴鲌種質(zhì)資源保護(hù)提供參考依據(jù)。研究結(jié)果顯示，翹嘴鲌群體呈現(xiàn)出高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性共存模式，指示翹嘴鲌遺傳多樣性較低，需要采取措施以提高翹嘴鲌遺傳多樣性： 1)控制水體污染，修復(fù)棲息環(huán)境，為翹嘴鲌生存和繁衍提供良好的生態(tài)環(huán)境條件； 2)打擊非法捕撈，限制捕撈強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)翹嘴鲌種群數(shù)量恢復(fù)性增長(zhǎng)； 3)科學(xué)開(kāi)展人工增殖放流，對(duì)放流群體和野生群體遺傳多樣性進(jìn)行評(píng)估，避免人工放流對(duì)野生群體遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)造成不利的影響。從遺傳結(jié)構(gòu)來(lái)看，兩湖泊群體間存在高度遺傳分化，各群體擁有較多的特有單倍型，因此應(yīng)將太湖和洪澤湖翹嘴鲌群體分別進(jìn)行管理和保護(hù)。