林 欣，區(qū)又君，溫久福，徐淑玉，李加兒

(1.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧 大連 116000；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300；3.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室茂名分中心，廣東 茂名 525000；4.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院,上海 201306)

四指馬鲅(Eleutheronematetradactylum)，隸屬于鯔形目(Mugiliformes)、馬鲅亞目(Polynemoidei)、馬鲅科(Polynemidae)、四指馬鲅屬(Eleutheronema)，俗稱馬友魚、午筍、鯉后等[1]，是熱帶、亞熱帶和溫帶海域的中上層魚類，主要分布在印度—西太平洋、波斯灣、新幾內(nèi)亞、澳大利亞、印度、越南、東南亞和中國海域[2-4]。四指馬鲅為廣鹽性溯河洄游型魚類，幼魚多棲息于河口，成魚則多見于沿海水域的淺泥底，具有生長速度快、肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)價值高、抗病力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中具有非常高的商業(yè)價值[5]。2012年至2015年，區(qū)又君等[6]成功完成四指馬鲅規(guī)模化的全人工繁育技術(shù)研究，并在沿海地區(qū)進(jìn)行推廣，使之成為我國海水魚類養(yǎng)殖的重要品種。

溶解氧(Dissolved oxygen，DO)是重要的水環(huán)境因子之一，對魚類的生長和存活具有重要的影響。當(dāng)處于低氧環(huán)境下，魚類自身的生理和生化狀態(tài)會發(fā)生改變，體現(xiàn)在生長、發(fā)育、繁殖、行為代謝、抗氧化等多個方面。而為了應(yīng)對水中溶解氧的變化，魚類也在逐步適應(yīng)并做出各種反應(yīng)及建立機(jī)制，通過一系列的生理和行為變化來適應(yīng)氧環(huán)境的變化。

低氧可使魚體代謝速率降低、攝食能力受到限制、消化吸收率下降等，從而影響魚體的生長和抗逆性[7-9]；魚體內(nèi)分泌功能紊亂，從而導(dǎo)致魚體在產(chǎn)卵期的受精卵品質(zhì)下降；幼魚成活率降低，兩性比例失衡[10]。目前，低氧脅迫逐漸成為魚類生理學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。從有關(guān)低氧脅迫對魚類影響的研究發(fā)現(xiàn)，低氧水環(huán)境會影響魚類鰓器官的功能，低氧脅迫后，鯽(Carassiusauratus)鰓小片之間的空隙完全被細(xì)胞團(tuán)(ILCM)填充，增加了其與水接觸部分的表面積[11-12]，而且為清除體內(nèi)產(chǎn)生的大量活性氧自由基，鯽的血清、肌肉和鰓組織中抗氧化酶活力均升高[13]。鰓呼吸表面積增加現(xiàn)象，同樣也出現(xiàn)在魴鲌雜交種F3和西伯利亞鱘(Acipenserbaerii)幼魚中[14-17]。卵形鯧鲹(Trachinotusovatus)鰓小片細(xì)胞表面舒張和抬升，同時毛細(xì)血管中的血細(xì)胞數(shù)量顯著增加[18]。許氏平鲉(Sebastesschlegelii)鰓組織形態(tài)出現(xiàn)鰓小片基質(zhì)肥大、增生、末端膨大和上皮細(xì)胞水腫等組織病變情況[19]。同樣，隨著水中溶解氧含量的降低，虹鱒(Oncorhynchusmykiss)鰓小片肥大、增生、末端膨大的比例增加[20]。水體環(huán)境多變，為適應(yīng)水體的溶解氧濃度變化，不同魚類建立了不同的適應(yīng)機(jī)制[21-22]。但目前未見關(guān)于低氧對四指馬鲅鰓和肝臟組織形態(tài)變化影響的研究報道。作為魚類氣體交換的關(guān)鍵部位，在受到環(huán)境脅迫后，魚類鰓器官往往容易受到影響并被損傷[23-24]；肝臟作為重要的代謝器官，其結(jié)構(gòu)變化與機(jī)體生理狀態(tài)密切相關(guān)。因此，本研究采用組織石蠟切片及掃描電鏡技術(shù)，觀察、比較了低氧脅迫條件下四指馬鲅幼魚鰓適應(yīng)性的變化特征、肝臟組織損傷情況，以及鰓和肝組織對低氧環(huán)境的適應(yīng)性及其組織結(jié)構(gòu)的變化機(jī)制，旨在為四指馬鲅的苗種培育和養(yǎng)殖生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)樣品為中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所——廣東省中山科技成果轉(zhuǎn)化基地自繁自育的四指馬鲅幼魚，平均全長為4.31 cm， 體質(zhì)量為0.79 g。試驗(yàn)開始前，暫養(yǎng)一周，養(yǎng)殖水溫為28℃，水體鹽度為4。在此過程中，每天換水一次，換水量為暫養(yǎng)水體的1/3；24 h不間斷充氣增氧，保持水中溶解氧濃度在6 mg/L 以上。每天9：00、18：00 各投喂 1 次，投喂1 h 后及時清除殘餌和糞便，試驗(yàn)前停飼1 d。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計

采用YSIProODO光學(xué)溶解氧測量儀(使用前用碘量法校正)測定水體的溶解氧濃度。試驗(yàn)設(shè)置低氧脅迫、常規(guī)培育對照2個試驗(yàn)組，每組3個重復(fù)，共6個水槽(規(guī)格30 cm×30 cm×45 cm，實(shí)際水體27 L)。隨機(jī)選取體色正常、體格健壯、活力好的四指馬鲅幼魚，每個水槽放置試驗(yàn)幼魚10尾。低氧脅迫組溶解氧濃度設(shè)計參考與四指馬鲅同屬鯔形目的鯔(Mugilcephalus)的資料：溫度對鯔幼魚的窒息點(diǎn)和窒息時間影響顯著，溫度越低，窒息點(diǎn)越低，當(dāng)16℃時，鯔的窒息點(diǎn)最低，為 0.49 mg/L；在 32℃時，鯔的窒息點(diǎn)最高,為 0.75 mg/L[25]。同時參考具有與四指馬鲅類似習(xí)性的黃鰭鯛的資料：黃鰭鯛幼魚在23℃時的窒息點(diǎn)為1.81 mg/L，29℃為4.2 mg/L[26]。并在正式試驗(yàn)前，做預(yù)備試驗(yàn)，在28℃靜水密閉時，觀察到四指馬鲅在2 mg/L時偶有浮頭現(xiàn)象，80 min出現(xiàn)死亡，120 min死亡過半。因此，本試驗(yàn)低氧脅迫組溶解氧濃度取2 mg/L，并且試驗(yàn)期間通過關(guān)閉水槽流水、向水槽內(nèi)充入氮?dú)?，使水中氧氣快速溢出而降低水體溶解氧濃度。當(dāng)水體溶解氧濃度為(1.90±0.12) mg/L 時，將四指馬鲅幼魚放入水槽，并用保鮮膜封閉水槽，在試驗(yàn)過程中通過調(diào)節(jié)氧氣進(jìn)氣閥，使水槽內(nèi)水體溶解氧溶度維持在2.0 mg/L，進(jìn)行120 min低氧脅迫試驗(yàn)。對照組則不間斷充氣增氧，保持水中溶解氧在6 mg/L 以上。

1.2.2 樣品采集與處理

在試驗(yàn)2 h后，從每個水槽取4尾魚，逐尾剖取鰓和肝臟，分別放入2 mL離心管中并分別用4%多聚甲醛溶液固定和電鏡固定液固定。

組織切片制作：將固定好的樣品以流水沖洗12 h，用50%～100%乙醇進(jìn)行梯度脫水(50%乙醇2 h、70%乙醇4 h、80%乙醇2 h、85%乙醇2 h、95%乙醇45 min×2次、100%乙醇45 min×2次)，再用二甲苯進(jìn)行透明(1/2無水乙醇+1/2二甲苯的混合液1 h、二甲苯15 min×2次)，浸蠟(石蠟2 h×2次)，用石蠟進(jìn)行包埋，切片，采用蘇木精—伊紅(HE)進(jìn)行染色，中性樹脂封片。

透射電鏡制備：透射電鏡樣本在電鏡固定液固定后用0.1 mol/L磷酸緩沖液PB(pH 7.4)漂洗3次，每次15 min；采用1%鋨酸溶液避光、室溫固定2 h，0.1 mol/L磷酸緩沖液漂洗3次，每次15 min；30%-50%-70%-80%-95%-100%梯度乙醇溶液逐級脫水，每次20 min；100%丙酮2次，每次15 min，再次脫水；用丙酮和812包埋劑滲透包埋，包埋板60℃聚合48 h；超薄切片機(jī)切片；150目方華膜銅網(wǎng)撈片；2%醋酸鈾和100%乙醇溶液避光染色，70%乙醇清洗，超純水清洗；2.6%枸櫞酸鉛溶液避二氧化碳染色，超純水清洗；干燥，透射電子顯微鏡(HT7800)下觀察并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Excel和SPSS 26軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，所得數(shù)據(jù)用平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用單因素方差分析對溶解氧變化的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行組間顯著性分析，將在不同溶解氧濃度下的數(shù)據(jù)進(jìn)行LSD多重比較，以P<0.05作為差異顯著的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 低氧脅迫下四指馬鲅幼魚的狀態(tài)

在溶解氧濃度2 mg/L、低氧脅迫時間120 min的試驗(yàn)過程中，四指馬鲅幼魚狀態(tài)表現(xiàn)為游動時失去平衡，短暫恢復(fù)后又再次失去平衡，偶爾躍出水面，重復(fù)上述狀態(tài)后逐漸在游動時不能保持平衡，側(cè)翻靜臥缸底并大口呼吸，鰓蓋張合不連續(xù)，魚體基本靜止，咧鰓后死亡。而對照組幼魚無任何應(yīng)激反應(yīng)，游動狀態(tài)正常。

2.2 低氧脅迫下四指馬鲅幼魚鰓組織顯微結(jié)構(gòu)的變化

圖1和表1為低氧脅迫下四指馬鲅幼魚鰓組織顯微結(jié)構(gòu)及鰓小片的變化。對照組四指馬鲅幼魚鰓絲上的鰓小片整體排列緊密，完整對稱地分布于鰓絲兩側(cè)；橢圓形的線粒體豐富細(xì)胞位于鰓小片基部與鰓絲相連之處，著色較深；扁平狀上皮細(xì)胞規(guī)則排列；血細(xì)胞均勻分布于鰓絲血竇之中，整體結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為正常的生理形態(tài)。與對照組相比，低氧組四指馬鲅幼魚鰓組織中鰓絲內(nèi)血竇收縮，血細(xì)胞數(shù)量增多且分布不均，血細(xì)胞在鰓絲末端堆積而使鰓絲末端膨大；鰓小片部分呈彎曲不規(guī)則排列，且長度變長、直徑變小，鰓小片之間間隔變大；有鰓絲斷裂現(xiàn)象；線粒體豐富細(xì)胞體積變小，著色較淺；上皮細(xì)胞整體被拉長，部分上皮細(xì)胞腫脹凸起，甚至破裂；整體形態(tài)偏離正常的生理形態(tài)。結(jié)果表明，低氧脅迫對四指馬鲅幼魚鰓組織顯微結(jié)構(gòu)造成了一定程度的氧化損傷。

表1 低氧脅迫下四指馬鲅幼魚鰓小片的變化

注：a、c為對照組(400X)；b、d為2 mg/L低氧組(400X)；GL：鰓絲；SL：鰓小片；BC：血細(xì)胞；PVC：扁平上皮細(xì)胞；MRC：線粒體豐富細(xì)胞；SC：柱細(xì)胞；▲：腫脹；★：破裂。

2.3 低氧脅迫下四指馬鲅幼魚鰓組織超微結(jié)構(gòu)的變化

圖2為四指馬鲅幼魚鰓組織超微結(jié)構(gòu)的變化。在透射電鏡下，可以觀察到對照組(a、c、e)四指馬鲅幼魚的鰓小片有兩層單層呼吸上皮細(xì)胞，兩層單層呼吸上皮細(xì)胞間形成腔隙結(jié)構(gòu)，柱細(xì)胞分布在腔隙間并起支持作用，使其形成大片空隙，而形成毛細(xì)血管腔，腔內(nèi)分布有血細(xì)胞。鰓小片基部分布有內(nèi)凹開口的線粒體豐富細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)分布大量的線粒體和排泄小泡。低氧組(b、d、f)四指馬鲅幼魚的鰓組織在低氧脅迫前的上皮細(xì)胞表面呈褶皺狀，脅迫后變平滑；空泡現(xiàn)象加劇；線粒體豐富細(xì)胞的頂隱窩由內(nèi)凹變?yōu)槠秸?；線粒體豐富細(xì)胞內(nèi)線粒體形態(tài)由橢圓形變?yōu)閳A形。結(jié)果表明，低氧脅迫導(dǎo)致四指馬鲅幼魚鰓組織超微結(jié)構(gòu)中線粒體豐富細(xì)胞以及上皮細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生變化。

注：a、c、e為對照組； b、d、f為2 mg/L低氧組；EP.上皮細(xì)胞；M.線粒體；MRC.線粒體豐富細(xì)胞；BC.血細(xì)胞；★.頂隱窩；Pc:柱細(xì)胞;N:細(xì)胞核。

2.4 低氧脅迫下四指馬鲅幼魚肝組織顯微結(jié)構(gòu)的變化

圖3為低氧脅迫下四指馬鲅幼魚肝組織顯微結(jié)構(gòu)的變化。對照組中四指馬鲅幼魚肝組織中，肝小板和肝血竇沿中央靜脈呈放射狀相間排列；肝細(xì)胞多為單核，細(xì)胞核大而圓，位于細(xì)胞中間且著色較深；細(xì)胞之間邊界明顯，部分出現(xiàn)因糖原溶解而形成的空泡；整體結(jié)構(gòu)清晰，表現(xiàn)為正常形態(tài)。與對照組相比，低氧組四指馬鲅幼魚肝組織中肝細(xì)胞空泡消失，細(xì)胞邊界模糊且形狀不規(guī)則，細(xì)胞核變大，細(xì)胞胞質(zhì)減少；細(xì)胞排列散亂，細(xì)胞核著色較深，部分細(xì)胞的細(xì)胞核偏離中央、位于一側(cè)；肝小板結(jié)構(gòu)不清晰，肝血竇間隙增大，血細(xì)胞數(shù)目增加；局部出現(xiàn)肝細(xì)胞壞死，肝細(xì)胞融合現(xiàn)象；中央靜脈的橫切面呈不規(guī)則形狀且內(nèi)部充滿血細(xì)胞。結(jié)果表明，低氧脅迫對四指馬鲅幼魚肝組織顯微結(jié)構(gòu)中肝細(xì)胞形態(tài)以及血竇分布造成了一定程度的影響。

注：a、c為對照組(400X)；b、d為2 m/L溶氧組(400X)；BV：血管；BC：血細(xì)胞；HC：肝細(xì)胞；HN：肝細(xì)胞核；HS：肝血竇；★：肝細(xì)胞融合；▲肝細(xì)胞壞死。

3 討論

3.1 低氧脅迫對四指馬鲅幼魚鰓組織學(xué)結(jié)構(gòu)變化的影響

對于大多數(shù)水生動物尤其是魚類而言，鰓是主要的呼吸器官，同時具有攝取食物、排泄氨氮等代謝廢棄物、調(diào)節(jié)滲透壓等生理機(jī)能。本研究發(fā)現(xiàn)，四指馬鲅幼魚在低氧脅迫后，出現(xiàn)鰓組織器官上皮細(xì)胞腫脹凸起、抬升以及部分上皮細(xì)胞破裂，由扁平狀變?yōu)樗笮渭叭切?，鰓絲末端充血腫脹，血細(xì)胞數(shù)量增多，以及血竇收縮等病理現(xiàn)象。這些變化均表明，在2 mg/L溶解氧濃度下的低氧脅迫造成了四指馬鲅幼魚鰓器官組織學(xué)損傷，與低氧脅迫下卵形鯧鲹(Trachinotusovatus)鰓器官上皮出現(xiàn)了腫脹和抬升、鰓小片中血細(xì)胞數(shù)量增加等試驗(yàn)結(jié)果[18]一致。低氧脅迫環(huán)境下，四指馬鲅鰓器官供氧不足，因而具有運(yùn)輸氧氣功能的血細(xì)胞數(shù)量增多，上皮細(xì)胞抬升以增加其與水接觸面積，從而獲得氧氣。此外，低氧脅迫組四指馬鲅幼魚的鰓小片直徑變短、長度延長、鰓間隔增加，這與莫桑比克羅非魚(Oreochromismossambicus) 在低氧脅迫后鰓絲的長度和鰓小片的面積均增加[27]、魴鲌雜交種 F3低氧脅迫24 h后鰓小片急劇伸長和鰓小片間距增加[14]等一致。低氧環(huán)境下鰓小片需要通過過濾更多的水而獲得氧氣，而鰓小片的形態(tài)變化擴(kuò)大了其與水體的接觸面積，使呼吸表面積增加、水血屏障距離縮短，從而有利于氣體交換[28]，進(jìn)而有利于四指馬鲅在低氧環(huán)境中存活。

3.2 低氧脅迫對四指馬鲅幼魚鰓組織超微結(jié)構(gòu)的影響

上皮細(xì)胞與柱細(xì)胞及毛細(xì)血管之間有一層較厚的基膜，形成特殊的水血屏障雙層結(jié)構(gòu)，是鰓絲進(jìn)行氣體交換時隔離內(nèi)環(huán)境和外部水環(huán)境的重要結(jié)構(gòu)。有學(xué)者認(rèn)為上皮細(xì)胞表面褶皺微嵴，易被黏液覆蓋，不利于增加氣體交換面積[29]，而本研究中四指馬鲅上皮細(xì)胞表面由褶皺狀(對照組)變平滑(低氧脅迫組)，這可能是為了增大細(xì)胞呼吸面積，提高氣體交換率，從而有利于四指馬鲅在低氧環(huán)境中存活。魚類鰓器官的調(diào)節(jié)滲透壓以及離子平衡主要由線粒體豐富細(xì)胞完成。本研究發(fā)現(xiàn)，急性低氧脅迫120 min后，線粒體豐富細(xì)胞頂隱窩同樣由內(nèi)凹變?yōu)槠秸?，胞?nèi)線粒體形態(tài)由橢圓形變?yōu)閳A形，體積增大，與星麗魚 (Astronotusocellatus)和虹鱒低氧脅迫后線粒體豐富細(xì)胞開口變大[30]、卵形鯧鲹急性低氧脅迫 6 h后鰓器官線粒體豐富細(xì)胞的形態(tài)變化及數(shù)量增加[18]等結(jié)果一致。這可能是在低氧脅迫下，水環(huán)境中氧氣含量不足，而四指馬鲅機(jī)體的正常代謝仍然需要相同甚至更多的能量，因此其通過改變線粒體的形態(tài)，以更加充分地利用氧氣。研究結(jié)果表明，四指馬鲅幼魚為適應(yīng)水體低氧環(huán)境，會通過改變線粒體豐富細(xì)胞以及上皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，以提高其對水體中氣體的利用率。

3.3 低氧脅迫對四指馬鲅幼魚肝組織學(xué)結(jié)構(gòu)變化的影響

肝臟是魚類最大的消化腺，也是比較重要的代謝器官之一，主要分泌物為膽汁，可促進(jìn)脂肪分解與吸收，同時又參與多種物質(zhì)的合成、存儲、代謝以及轉(zhuǎn)化。肝臟細(xì)胞內(nèi)含有多種內(nèi)含物，例如糖原、色素和脂滴等，其含量與機(jī)體生理狀態(tài)具有密切的關(guān)系[31]。大量研究表明，低氧會影響魚類肝臟的生理功能及肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)。本研究中，低氧脅迫后四指馬鲅幼魚肝臟中空泡減少、肝細(xì)胞染色加深，與低氧脅迫后軍曹魚(Rachycentroncanadum)的肝細(xì)胞間排列散亂、肝組織空泡化現(xiàn)象加劇等結(jié)果不同。四指馬鲅低氧脅迫后肝臟的空泡減少，可能是為適應(yīng)缺氧環(huán)境，而減少耗氧量，降低糖原分解效率；肝細(xì)胞染色加深可能是因?yàn)樗闹格R鲅幼魚為抵御低氧環(huán)境而調(diào)節(jié)自身抗氧化系統(tǒng)，合成抗氧化酶類物質(zhì)。四指馬鲅幼魚肝細(xì)胞細(xì)胞核偏移、部分溶解壞死、肝血竇間隙增大、中央靜脈橫切面呈現(xiàn)不規(guī)則形狀且內(nèi)部充滿血細(xì)胞等現(xiàn)象，與低氧脅迫后卵形鯧鲹肝臟的肝細(xì)胞紊亂、肝細(xì)胞間的血竇擴(kuò)大、肝細(xì)胞融合、肝細(xì)胞間膽管立方上皮細(xì)胞數(shù)量減少、體積增大等結(jié)果[22]一致。肝細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化及部分溶解壞死，皆為病理現(xiàn)象，表明2 mg/L溶解氧濃度使四指馬鲅幼魚肝臟組織受到嚴(yán)重的氧化損傷。

4 結(jié)論

四指馬鲅幼魚鰓器官組織學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，通過鰓小片延長、鰓間隔間距增加、上皮細(xì)胞抬升拉長，以擴(kuò)大呼吸表面積；肝組織空泡的減少降低了耗氧量，從而增強(qiáng)其低氧適應(yīng)能力。鰓小片上皮細(xì)胞腫脹和破裂、部分肝細(xì)胞溶解壞死等病理現(xiàn)象表明，在短時間的急性低氧脅迫下，四指馬鲅幼魚的鰓組織和肝臟組織均出現(xiàn)一定程度的氧化損傷。因此在養(yǎng)殖過程中，應(yīng)注意監(jiān)測水體溶解氧濃度，預(yù)防暴發(fā)性缺氧損傷，減少實(shí)際生產(chǎn)中因水體溶解氧突變而帶來的經(jīng)濟(jì)損失。