蔣 飛 ，戴習林

(1.上海市水產研究所，上海市水產技術推廣站，上海 200433；2.上海海洋大學，水產科學國家級實驗教學示范中心，農業(yè)部淡水水產種質資源重點實驗室，水產動物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 201306)

羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)，俗稱泰國蝦或馬來西亞大蝦等，原產于東南亞、南亞和西太平洋島嶼，在我國有兩大主要產區(qū)，包括兩廣地區(qū)和江浙滬一帶。因其營養(yǎng)豐富、體型較大、生長速度快，抗病能力強，羅氏沼蝦已成為我國主要的淡水養(yǎng)殖蝦類[1]。雖然人工育苗技術的突破和養(yǎng)殖技術的提升提高了羅氏沼蝦的養(yǎng)殖產量，但是近年來羅氏沼蝦的種質退化現(xiàn)象日益凸顯，影響了我國羅氏沼蝦養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。因此，需要開展不同地區(qū)羅氏沼蝦種群的遺傳多樣性分析，以更好地指導羅氏沼蝦養(yǎng)殖生產。

近年來，國內外關于羅氏沼蝦在細胞遺傳學、生化遺傳學以及分子遺傳學等方面的研究都已有報道[2-5]。線粒體脫氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid，DNA)具有結構簡單、分子量小、呈母系遺傳、進化速度快等優(yōu)點，在水產動物群體遺傳學和系統(tǒng)進化研究中已得到廣泛應用，其中COⅠ基因長度適宜、進化速率適中且遺傳信息量較大，也常被用于種群分析[6-8]。本實驗擬通過線粒體COⅠ基因序列分析，對上海選育群體(SC)、浙江養(yǎng)殖群體(ZJ)和泰國野生群體(TL)進行遺傳多樣性分析，以期在線粒體水平上了解羅氏沼蝦的遺傳背景，為羅氏沼蝦遺傳改良和可持續(xù)健康發(fā)展提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

上海選育群體(SC)：2014年7月采自上海申漕特種水產開發(fā)公司養(yǎng)殖基地(上海漕涇鎮(zhèn))。浙江養(yǎng)殖群體(ZJ)來源于2014年7月浙江南太湖種業(yè)有限公司。泰國野生群體(TL)采自2014年7月泰國天然水域中。

上海選育群體(SC)和浙江養(yǎng)殖群體(ZJ)各隨機采樣90尾，泰國野生群體(TL)隨機采樣雌、雄各15尾，所有樣本浸泡于無水乙醇中，帶回實驗室，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA提取并檢測

從3個羅氏沼蝦群體中分別隨機選取10個樣本，共計30個樣本，羅氏沼蝦基因組DNA的提取主要參考Moore D D等[9]的方法并稍作改進。采用蛋白酶K裂解液消化、酚-氯仿法抽提并純化DNA、-20℃無水乙醇沉淀的方法提取肌肉組織中的DNA，TE緩沖液稀釋后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3 PCR擴增和序列測定

COⅠ基因片段擴增引物為COⅠ-F(5′-ATTGTCACTGCCCACGCATT-3′ )、COⅠ-R(5′-TGTTGGTAGAGGATCGGGTC-3′ )。所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR擴增產物經1.0% EB-瓊脂糖凝膠電泳檢測驗證，結果符合測序要求，由生工生物工程(上海)股份有限公司進行純化和測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

將測得的序列用BioEdit 7.0.5.2進行序列比對，并輔以人工校對，去除兩端冗余序列；用DNSP 5.1軟件計算群體遺傳變異參數(shù)：單倍型數(shù)量(Number of haplotypes)、單倍型多樣性指數(shù)(Haplotype diversity index,Hd)、核苷酸多樣性指數(shù)(Nucleotide diversity index，π)和平均核苷酸差異數(shù)(Average number of nucleotide differences，K)；用Arlequin 3.1軟件統(tǒng)計分子多態(tài)性指數(shù)，并對群體遺傳變異進行分子方差分析(Analysis of molecular variance，AMOVA)和遺傳分化系數(shù)(Fixation index statistics，F(xiàn)st)檢驗。用MEGA 5.0軟件中的Kimura雙參數(shù)模型計算各群體內和群體間遺傳距離，并基于遺傳距離構建群體間的分子系統(tǒng)進化樹。

2 結果與分析

2.1 羅氏沼蝦線粒體COⅠ序列特征

對測得的序列采用BioEdit軟件進行比對分析，去除兩端多余序列，得到458 bp有效長度的序列，并對其進一步分析。在458 bp COⅠ基因序列中，共檢測到8個變異位點，并且全部單堿基突變，無堿基顛換，群體間的堿基差異較小。MEGA 5.0軟件分析顯示，所有樣本序列的A、T、C和G堿基含量的平均值分別為26.3%、28.1%、26.1%和19.6%，A+T的含量為54.4%，高于G+C的含量45.7%。3個羅氏沼蝦群體中共有4種單倍型，SC群體、ZJ群體和TL群體的基因型種類分別為1、2和3種。

2.2 羅氏沼蝦遺傳多樣性

對3個羅氏沼蝦群體的遺傳多樣性進行分析(表1)，結果顯示群體SC、ZJ和TL的單倍型多樣性指數(shù)(Hd)依次為0、0.356和0.733；核苷酸多樣性指數(shù)最高的是ZJ群體(π=0.005)，其次是TL群體(π=0.002)，SC群體最低(π=0)。對3個群體的遺傳多樣性進行Tajima′s D中性檢驗，結果范圍為0～1.337，3個群體Tajima′s D 的P值均大于0.05，差異不顯著，說明COⅠ基因序列核苷酸的變化符合中性突變假說。

2.3 羅氏沼蝦群體遺傳分化與遺傳距離

用Arlequin 3.1軟件進行AMOVA分析，3個羅氏沼蝦群體的遺傳變異結構和變異來源見表2。AMOVA的分析結果表明，在羅氏沼蝦3個群體的遺傳結構差異中，有74.5%遺傳差異來源于群體間，25.5%遺傳差異來源于群體內。群體間的遺傳變異明顯高于群體內的遺傳變異。

表2 3個羅氏沼蝦群體間和群體內的分子方差分析(AMOVA)

3個群體間的遺傳分化指數(shù)(Fst)和遺傳距離結果如表3所示，SC群體與TL群體遺傳分化指數(shù)最高(Fst=0.925)，其次是ZJ群體與TL群體(Fst=0.687)，SC群體與ZJ群體的遺傳分化指數(shù)最低(Fst=0.111)；SC群體與ZJ群體的遺傳距離較近，約為0.003，而與TL群體的遺傳距離較遠，約為0.013。

表3 3個羅氏沼蝦群體間遺傳分化指數(shù)和群體遺傳距離

2.4 基于COⅠ基因序列的羅氏沼蝦分子系統(tǒng)樹

根據(jù)COⅠ基因序列，從GenBank中下載與羅氏沼蝦同屬不同種的日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense，Mn)(登錄號：FM958077)作為外群，采用NJ法和UPMGA法構建系統(tǒng)進化樹。由圖1可知，2種方法構建的系統(tǒng)進化樹趨于一致，沼蝦屬的2個種聚為兩大支：日本沼蝦的遺傳距離與羅氏沼蝦3個群體均明顯偏遠，單獨聚為一支；SC群體與ZJ群體遺傳距離最近，首先聚在一起成為一小支，然后再與TL群體聚為另一支。

注：SC、ZJ、TL分別是來自上海、浙江、泰國的羅氏沼蝦；Mn為日本沼蝦。

3 討論

3.1 羅氏沼蝦線粒體COⅠ序列變異分析

線粒體DNA作為核外遺傳物質，普遍存在于真核細胞中，由于具有結構簡單、進化速度快、母系遺傳、變異性大、核苷酸替代率高等優(yōu)點[8,10]，其已經成為物種鑒定、系統(tǒng)發(fā)育以及種群遺傳等研究中一種有效的分子標記[11]。mtDNA序列分析是DNA多態(tài)性分析技術中重要的方法之一，不論是群體還是個體，任何的遺傳變異或者多態(tài)都是DNA序列的差異，mtDNA序列分析可以檢測到堿基的插入、缺少和替換等變異信息，從而在分子水平上檢測個體、群體及種間的多態(tài)及遺傳差異[12]。COⅠ基因作為mtDNA的主要分子標記之一，適用于種、亞種及地理種群間的系統(tǒng)關系研究[13]。COⅠ序列在蝦類的分子系統(tǒng)學中被廣泛應用，如Carini G等[14]和 Vassilios K等[15]分別研究了澳洲沼蝦(M.australien)的遺傳結構和不同地理種群的歐洲龍蝦(Homarusgammarus)的系統(tǒng)進化關系。

本研究初步分析了3個羅氏沼蝦群體線粒體COⅠ序列的差異，共檢測出8個變異位點、4個單倍型。變異位點和單倍型數(shù)量少可能是由于各群體樣品檢測數(shù)量偏低或COⅠ基因序列無法將其很好地區(qū)分開。但是TL群體的單倍型數(shù)量(3個)分別高于SC群體(1個)和ZJ群體(2個)的單倍型數(shù)量，這至少可以說明浙江養(yǎng)殖群體和上海選育群體因長期的人工養(yǎng)殖和選育，導致其遺傳多樣性較野生群體有所降低。堿基組成分析表明，A+T的平均含量(54.4%)高于G+C的平均含量(45.7%)，這與許多研究者在其他蝦蟹類線粒體基因中檢測到的結果類似，如姜虎成等[16]研究發(fā)現(xiàn)，淮河水系日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)A+T的含量(59.0%)高于G+C含量(41.0%)；葛家春等[17]研究發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)G+C含量(37.6%)低于A+T的含量(62.4%)。

3.2 羅氏沼蝦的遺傳變異分析

當采用線粒體DNA研究群體遺傳多樣性時，核苷酸多樣性指數(shù)(π)和單倍型多樣性指數(shù)(Hd)均是衡量群體遺傳多樣性的2個重要指標[18]。有些群體通過變異積累了單倍型的多態(tài)性，而并不能積累核苷酸序列的多樣化[19]。本研究結果表明，TL群體的單倍型多樣性指數(shù)較高(Hd=0.733)，但其核苷酸多樣性指數(shù)(π=0.002)明顯偏低，說明TL群體可能是由少量個體擴增形成的一個小種群。SC群體和ZJ群體的Hd值和π值均較低，造成這一現(xiàn)象的主要原因可能是這兩個群體在長期人工養(yǎng)殖和選育過程中發(fā)生了遺傳漂變(Genetic drift)、近交(Inbreeding)或奠基者效應(Founder effect)[20-21]。

群體間遺傳分化系數(shù)(Fst)經常用于衡量群體間基因分化的程度[22]，F(xiàn)st值的大小與群體遺傳分化水平符合正相關關系。在0～1的范圍內，F(xiàn)st值為0～0.05屬于遺傳分化微弱；Fst值在0.05～0.15之間屬于中度遺傳分化；Fst值為0.15～0.25屬于高度遺傳分化；Fst值在0.25以上屬于極高度遺傳分化[23]。本研究中，SC群體與ZJ群體(Fst=0.111)屬于中度遺傳分化；SC群體與TL群體(Fst=0.925)、ZJ群體與TL群體(Fst=0.687)都屬于極高度遺傳分化，由此證明長期閉鎖選育和人工養(yǎng)殖對羅氏沼蝦的遺傳結構都產生了影響。

3.3 羅氏沼蝦群體間遺傳距離和系統(tǒng)發(fā)育分析

Hebert P D N等[24]曾經對動物界的11門13 320個物種的線粒體COⅠ基因進行序列比較分析，得出物種內的遺傳距離大部分小于0.010，很少有大于0.020的結論；本研究中，根據(jù)羅氏沼蝦3個不同群體的遺傳距離和系統(tǒng)進化樹可以看出，基于線粒體COⅠ基因序列的3個羅氏沼蝦群體間的種內遺傳距離為0.003～0.013，與其研究結果一致。SC群體與ZJ群體遺傳距離最小,為0.003，親緣關系較近。SC群體和ZJ群體與TL群體的遺傳距離分別為0.013和0.011，遺傳距離相對較大，親緣關系也較遠?；谶z傳距離構建的NJ和UPMGA系統(tǒng)進化樹趨于一致，SC群體首先與ZJ群體聚在一起成為一小支，然后再與TL群體聚為另一支，結果表明3個群體的遺傳距離進化關系與聚類關系類似。產生這樣結果的原因可能是SC群體和ZJ群體的遺傳背景相似，而與TL群體遺傳背景差異較大，亦或是SC群體、ZJ群體與TL群體存在養(yǎng)殖地理環(huán)境的差異。

鑒于本研究是從一個線粒體基因對羅氏沼蝦3個不同群體的遺傳多樣性進行評估，且樣本量有限，因此上述結果只可作初步參考，而后期有必要增加檢測樣本數(shù)量，同時將從其他多個線粒體基因并配合核DNA遺傳分析，以期得到更全面和客觀的結果。