翁衛(wèi)東 饒先林 陸峰彬 金 燕 柴可群

中藥清肺通絡(luò)合劑（Qingfeitongluo Mixture，QFTLM）是浙江省立同德醫(yī)院內(nèi)制劑，適用于熱病后期氣陰兩虛兼余毒未清型患者，具有益氣養(yǎng)陰、清肺化痰的功效。以往在治療社區(qū)獲得性肺炎（community-acquired pneumonia，CAP）恢復(fù)期氣陰兩虛兼痰熱型患者中發(fā)現(xiàn)，該方能顯著降低臨床證候積分[1]。為明確其療效作用機(jī)制，本研究從腸道菌群進(jìn)行探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2020 年6 月至2021 年6 月浙江省立同德醫(yī)院感染科氣陰兩虛兼痰熱型CAP 住院患者23 例，其中男11 例，女12 例；年齡23～60（38.26±9.65）歲；病程1～5（3.10±1.29）d。本研究經(jīng)患者知情同意并通過醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（KTSC2021226）。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) （1）CAP 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)符合《中國(guó)成人社區(qū)獲得性肺炎診斷和治療指南（2016 年版）》[2]；（2）CAP 中醫(yī)辨證分型標(biāo)準(zhǔn)參考《社區(qū)獲得性肺炎中醫(yī)診療指南（2018 修訂版）》[3]，氣陰兩虛兼痰熱型主癥：發(fā)熱、咳嗽，無痰或少痰，口干，氣短，乏力，舌紅，苔少或薄，脈細(xì)數(shù)；次癥：咳痰不爽，納差，自汗，盜汗，手足心熱，大便干、尿短赤。具備發(fā)熱、咳嗽及其他主癥或次癥2 項(xiàng)即可診斷；（3）年齡18～60 周歲；（4）體質(zhì)指數(shù)18～25 kg/m2；（5）3 個(gè)月內(nèi)未使用抗生素、益生菌、糖皮質(zhì)激素、質(zhì)子泵抑制劑及中草藥等；（6）無飲酒等特殊嗜好；（7）無嚴(yán)重慢性疾病史。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) （1）新型冠狀病毒感染；（2）流行性感冒；（3）重癥肺炎；（4）使用研究以外的藥物；（5）近期有急性胃腸炎或腹瀉；（6）妊娠或哺乳的婦女；（7）臨床資料不全或自依從性差者。

1.4 分組方法 采用前瞻性臨床對(duì)照研究方法，根據(jù)患者治療方法的不同，將23 例氣陰兩虛兼痰熱型CAP 患者分為兩組：抗菌藥物治療組10 例；抗菌藥物聯(lián)合QFTLM 治療組13 例。收集患者治療前（入院0～1 d）和治療1 周后（入院7～8 d）糞便樣本46 份，其中抗菌藥物組治療前后各10 份，抗菌藥物聯(lián)合QFTLM組治療前后各13 份。

1.5 藥物選擇

1.5.1 抗菌藥物 （1）頭孢噻肟鈉注射液2.0 g 靜脈滴注，每8 h1 次（山東羅欣藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)322037034）聯(lián)合左氧氟沙星片0.5 g 口服，每天1 次（第一制藥北京有限公司，批號(hào)BY075G1）；（2）派拉西林/他唑巴坦注射液4.5 g 靜脈滴注，每8 h1次（瀚暉制藥有限公司，批號(hào)22013111）聯(lián)合左氧氟沙星片0.5 g 口服每天1 次。

1.5.2 QFTLM 由醫(yī)院制劑室制備（備案號(hào)：浙藥制備字Z20200045000，批號(hào)200716、210203、210208、210427、210429、210505），每瓶500 mL（每1 mL 相當(dāng)于飲片0.724 g），口服，1 天2 次，每次125 mL。組方：太子參、南沙參、茯苓各15 g，炒白術(shù)、桑白皮各12 g，蘆根20 g，桔梗6 g，廣地龍9 g，丹參15 g，薏苡仁30 g，冬瓜子12 g，姜半夏9 g，砂仁（后下）5 g，甘草6 g。

1.5.3 合并用藥 體溫≥39.0 ℃可予吲哚美辛肛栓50 mg 塞肛，24 h 不超過100 mg。

1.6 檢驗(yàn)方法 收集患者新鮮糞便約1 g 置于無菌試管中，立刻予-80 ℃冰箱保存，統(tǒng)一冷運(yùn)至北京百邁客生物科技有限公司，經(jīng)DNA 提取、PCR 擴(kuò)增、純化、混樣、PE 文庫(kù)制備，上機(jī)PacBio 平臺(tái)進(jìn)行16S rRNA 測(cè)序（V1-V9 區(qū)），下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過濾、拼接、按97%相似性劃分操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類，根據(jù)聚類結(jié)果，對(duì)每個(gè)OTU 的代表序列做物種注釋，得到對(duì)應(yīng)的物種及豐度信息。通過α 多樣性分析明確樣本內(nèi)物種豐富度和均勻度；通過β 多樣性分析明確組間群落結(jié)構(gòu)差異；通過組間顯著性差異物種分析明確各組特異性物種。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用生物信息學(xué)統(tǒng)計(jì)分析方法，測(cè)序結(jié)果在百邁客生物信息云平臺(tái)（https://international.biocloud.net/zh/dashboard）上完成。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示；α 多樣性分析采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)；β 多樣性分析采用主坐標(biāo)分析（principal coordinates analysis，PCoA）；組間差異顯著性分析采用方差分析和線性判別分析[line discriminant analysis（LDA）effect size，LEfSe]。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)果分析 46 個(gè)樣本共獲得337542條有效序列，平均讀長(zhǎng)1438～1473 bp，共鑒定出320個(gè)OTU，在各分類學(xué)水平共鑒定出10 個(gè)門、18 個(gè)綱、40 個(gè)目、68 個(gè)科、172 個(gè)屬和266 個(gè)種。以樣本稀釋性曲線（Multy samples Rarefaction Curves）（見圖1）判斷各樣本測(cè)序量是否充分，當(dāng)曲線急劇上升表明測(cè)序量不足，反之則表明樣品序列充分。

圖1 樣本稀釋性曲線

2.2 兩組CAP 患者治療前后相對(duì)豐度大于1%的菌群組成 在門水平為厚壁菌門、變形桿菌門、擬桿菌門、疣微菌門和放線菌門；在綱水平為梭菌綱、革蘭陰性菌綱、芽孢桿菌綱、丹毒絲菌綱、擬桿菌綱、γ-變形桿菌綱、疣微菌綱和放線菌綱；在目水平為擬桿菌目、梭菌目、單胞菌目、腸桿菌目、乳桿菌目、丹毒絲菌目和顫螺菌目；在科水平為擬桿菌科、乳球菌科、腸桿菌科、韋榮球菌科、艾克曼菌科、毛螺菌科、喜熱菌科、鏈球菌科、丹毒絲菌科和腸球菌科；在屬水平為擬桿菌屬、糞桿菌屬、埃希氏菌屬、罕見小球菌屬、巨單胞菌屬、艾克曼菌屬、梭菌屬、鏈球菌屬和腸球菌屬。

2.3 腸道菌群多樣性分析

2.3.1 α 多樣性分析 α 多樣性指數(shù)差異柱狀圖（見圖2），抗菌藥物組治療前后Ace 指數(shù)分別為（96.40±9.56）比（63.33±7.56）（P<0.05）（見圖2a），PD_whole_tree 指數(shù)分別為（6.43±0.56）比（4.63±0.55）（P<0.05）（見圖2b）；抗菌藥物聯(lián)合QFTLM 組治療前后Shannon 指數(shù)分別為（3.82±0.27）比（2.79±0.40）（P<0.05）（見圖2c）。提示兩組治療后α 多樣性較治療前明顯減少。

圖2 α 多樣性指數(shù)差異柱狀圖

2.3.2 β 多樣性分析 PCoA 分析圖（見圖3）中未見樣本顯著分離，采用Weight UniFrac 計(jì)算法第一主成分（The first principal component，PC1）貢獻(xiàn)率為30.74%。提示組間β 多樣性差異不顯著。

圖3 PCoA 分析圖

2.4 腸道菌群差異顯著性分析

2.4.1 兩組治療前后腸道菌群相對(duì)豐度的方差分析

組間方差分析柱狀圖（見圖4），其中梭菌綱的相對(duì)豐度抗菌藥物組治療前后分別為（0.48±0.24）比（0.17±0.14）（P<0.01）；抗菌藥物聯(lián)合QFTLM 組治療前后分別為（0.42±0.20）比（0.17±0.15）（P<0.05）。提示兩組治療后梭菌綱的相對(duì)豐度較治療前顯著減少。

圖4 組間方差分析柱狀圖

2.4.2 兩組治療前后顯著性差異物種分析 LDA 值分布柱狀圖（見圖5），抗菌藥物組治療前顯著性差異物種為厚壁菌門、梭菌綱、梭菌目和瘤胃球菌屬，治療后為鏈球菌科、鏈球菌屬和唾液鏈球菌種（見圖5a）；抗菌藥物聯(lián)合QFTLM 組治療前顯著性差異物種為梭菌綱、梭菌目、瘤胃球菌科和毛螺菌科，治療后為腸球菌科、腸球菌屬、鳥腸球菌種和多形擬桿菌種（見圖5b）。提示兩組治療前顯著性差異物種均為梭菌而治療后出現(xiàn)不同變化。

圖5 LDA 值分布柱狀圖

3 討論

CAP 是常見病、多發(fā)病，是患者死亡的常見病因[4]?！澳c-肺軸”概念的提出[5-6]，為研究CAP 提供了新的思路?！澳c-肺軸”是指肺與腸共用一個(gè)黏膜免疫系統(tǒng)，通過其間的微生物對(duì)機(jī)體免疫產(chǎn)生相互作用和影響。腸道菌群作為其間雙向交流的重要物質(zhì)，影響著呼吸系統(tǒng)的免疫功能和疾病的預(yù)后[7-8]。CAP 相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，致病微生物通過與呼吸道靶細(xì)胞的受體結(jié)合進(jìn)入人體引發(fā)肺部炎癥，也與消化道具有相同受體的靶細(xì)胞結(jié)合破壞腸道菌群，導(dǎo)致細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物進(jìn)入循環(huán)而激活全身炎癥反應(yīng)[9]?？咕幬锸侵委烠AP 的常用手段，但細(xì)菌耐藥和腸道菌群失調(diào)等問題，嚴(yán)重降低了其臨床療效[10-11]。中藥具有調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)和抗感染等多種作用[12-14]，中西醫(yī)結(jié)合可以取長(zhǎng)補(bǔ)短提高臨床療效[15]。

CAP 多屬中醫(yī)“風(fēng)溫肺熱病”范疇，常由外邪侵襲，肺衛(wèi)受邪或正氣虧虛，抗邪無力，致風(fēng)熱邪毒襲肺或風(fēng)寒之邪入里化熱，煉津?yàn)樘?，痰熱壅肺，肺失宣降。因熱邪極易耗氣傷陰，故風(fēng)溫肺熱病早期即可見氣陰兩虛兼痰熱證候。中醫(yī)認(rèn)為，肺與大腸相表里、脾與肺是母子相生關(guān)系，從辨證論治的整體觀出發(fā)，中醫(yī)治療肺病不局限于肺，常從脾胃腸入手，在清肺化痰等驅(qū)邪基礎(chǔ)上聯(lián)合健脾益氣養(yǎng)陰等治療方法。針對(duì)風(fēng)溫肺熱病的特點(diǎn)，中醫(yī)強(qiáng)調(diào)應(yīng)盡早益氣養(yǎng)陰以保存陰津、顧護(hù)正氣。QFTLM 基于上述理論組方，方中太子參補(bǔ)肺脾之氣，南沙參補(bǔ)肺胃之陰，茯苓、白術(shù)、米仁健脾化濕，桑白皮、桔梗清瀉肺火、祛痰平喘，姜半夏燥濕化痰、降逆止咳，蘆根清熱生津、祛痰排膿，冬瓜子清肺化痰、利濕排膿，丹參、地龍涼血散瘀、活血通絡(luò)，砂仁化濕和胃，甘草調(diào)和諸藥。本研究選擇氣陰兩虛兼痰熱型CAP 患者為研究對(duì)象，與以往在熱病后期使用QFTLM 不同，本研究在CAP早期即與抗菌藥物聯(lián)合使用，與單用抗菌藥物治療的患者比較腸道菌群多樣性的變化，以明確QFTLM對(duì)腸道菌群的影響。研究結(jié)果顯示，氣陰兩虛兼痰熱型CAP 患者經(jīng)抗菌藥物治療1 周，腸道菌群α 多樣性明顯減少，顯著性差異物種由梭菌變?yōu)殒溓蚓FTLM 無法完全改變這種腸道菌群α 多樣性減少，但可將顯著性差物種由梭菌改變?yōu)槟c球菌和多形擬桿菌。腸球菌和多形擬桿菌是腸道中重要的菌群，在正常人體腸道中對(duì)健康有益，腸球菌能產(chǎn)生天然的抗生素起到抑菌作用[16]，多形擬桿菌是降解碳水化合物的優(yōu)秀細(xì)菌，能加快食物中多糖的消化吸收[17]。由此推測(cè)，QFTLM 可能是通過增加腸道中對(duì)人體有益的細(xì)菌和加快食物中碳水化合物的消化吸收來促進(jìn)患者臨床證候積分的改善。