劉小琬，許 輝，王 寒，岳雙明，周遠(yuǎn)成

（1.四川水利職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川 成都 611200；2.四川省畜牧科學(xué)研究院畜禽生物制品四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都610066，3.畜科生物工程有限公司四川省動物生物制品工程技術(shù)研究中心，四川 成都 610200）

ASFV 感染以肺水腫、發(fā)燒、皮膚發(fā)紺、網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)出血為主要特征，死亡率高達(dá)100%，嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)，世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為法定上報(bào)動物疫病之一，是我國一類動物疫?。?］。非洲豬瘟的傳播史已逾一個(gè)世紀(jì)，1921年非洲東部肯尼亞最早報(bào)道ASF，20世紀(jì)50年代傳入歐洲、葡萄牙、西班牙等國，開始了在西歐的流行［2］。20世紀(jì)70年代傳入巴西等歐美地區(qū)，2007年ASFV叩響了亞洲的大門，俄羅斯、格魯吉亞相繼暴發(fā)疫情。我國于2018 年8 月在沈陽首次報(bào)道ASFV，截至2022 年7 月，我國已累計(jì)報(bào)道192起，撲殺生豬共計(jì)120多萬頭，目前沒有再出現(xiàn)區(qū)域性暴發(fā)流行。疫情暴發(fā)初期，我國生豬養(yǎng)殖存欄量急劇下降，豬肉曾一度供不應(yīng)求，從而導(dǎo)致生豬和豬肉產(chǎn)品價(jià)格上漲幅度過大［4］。盡管全世界對ASFV 疫苗研究已有幾十年，但還沒有一個(gè)疫苗批準(zhǔn)上市，因此，了解ASFV主要保護(hù)性抗原結(jié)構(gòu)及其疫苗的研究進(jìn)展，對于防控ASF疫情具有十分重要的意義。

1 非洲豬瘟病毒的病原學(xué)特征

1.1 結(jié)構(gòu)特點(diǎn) ASFV是非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬的唯一成員，也是目前已知的唯一蟲媒大型DNA 囊膜病毒。病毒粒子呈正二十面體對稱結(jié)構(gòu)，直徑約200 nm，長度為170～190 kb，有160～175個(gè)開放閱讀框（ORFs），可編碼150～200 種蛋白質(zhì)，包括多種結(jié)構(gòu)蛋白及參與DNA復(fù)制、修復(fù)、轉(zhuǎn)錄的酶和因子等，其表達(dá)受時(shí)間調(diào)控。

1.2 ASFV 的病毒蛋白 ASFV 的開放閱讀框可編碼病毒不同抗原表位，其中結(jié)構(gòu)蛋白有pp220、p30、p54、p72、A104R 和CD2v 等，非結(jié)構(gòu)蛋白有F334L、K196R 和NP419L，未知功能蛋白有B602L、C44L、Cp312R和K205R。其中p54、K205R、A104R 和B602L 這4 種蛋白產(chǎn)生的抗體具有更強(qiáng)、更持久的抗體滴度。ASFV 可在主動脈內(nèi)皮細(xì)胞及巨噬細(xì)胞中復(fù)制，通過胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞，前期有試驗(yàn)研究表明，p30、p54、pp62、p72 及CD2v蛋白有助于病毒的快速吸附和入侵。

p30 蛋白是ASFV 重要的結(jié)構(gòu)蛋白，由CP204L 基因所編碼，相對分子量為30 ku，是ASFV 早期表達(dá)的內(nèi)膜蛋白，在感染早期可檢測到表達(dá)，并持續(xù)存在于整個(gè)感染周期。因其有較強(qiáng)的抗原性和免疫原性，可刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，常用于血清學(xué)診斷。周改靜等［4］利用原核表達(dá)p30蛋白建立了阻斷ELISA檢測方法，對208份血清樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果與Ingenasa 公司試劑盒檢測的結(jié)果一致。

p54 蛋白是由E183L 編碼的ASFV 的另一個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，分子量約為25 ku，在其N 端附近有一個(gè)潛在的跨膜區(qū)域和Gly-Gly-X 氨基酸序列，對病毒形態(tài)的形成非常重要，對包膜前體聚集及病毒粒子組裝轉(zhuǎn)運(yùn)有很重要的作用。p54蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體能夠抑制ASFV 附著到易感細(xì)胞中，感染后最早一個(gè)星期就能檢測，并能在血液中持續(xù)數(shù)周，也常被應(yīng)用于ASFV的血清學(xué)診斷中。

p72 蛋白是病毒二十面體衣殼的主要成分，由B646L基因編碼，分子量大小約為73.2 kDa，抗原性及免疫原性強(qiáng)而穩(wěn)定，產(chǎn)生的抗體可阻斷ASFV與巨噬細(xì)胞的結(jié)合。在病毒感染末期能檢測到p72 蛋白表達(dá)，它與病毒的吸附、入侵有關(guān)，p72 的表達(dá)是病毒復(fù)制的標(biāo)志，廣泛應(yīng)用于病毒檢測方法的建立。周遠(yuǎn)成等［5］利用真核表達(dá)載體及輔助蛋白B602L 基因協(xié)同表達(dá)p72 蛋白，重組腺病毒感染細(xì)胞后可以同步表達(dá)非洲豬瘟p72、B602L蛋白，將該重組腺病毒接種實(shí)驗(yàn)動物，可刺激實(shí)驗(yàn)動物產(chǎn)生特異性抗體，為今后建立特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好和結(jié)合能力高的ASFV 血清學(xué)診斷方法奠定了良好的基礎(chǔ)。

CD2v 蛋白是由EP402R 基因編碼，具有跨膜結(jié)構(gòu)的糖蛋白，類似于T 淋巴細(xì)胞表面的黏附受體CD2，是唯一已知的細(xì)胞CD2 的同源物，主要參與細(xì)胞間的黏附、毒性增強(qiáng)以及免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)過程，與ASFV的組織趨向性、免疫逃避機(jī)制等密切相關(guān)，在ASFV 感染的發(fā)病機(jī)制中可能有一定的作用，屬于晚期表達(dá)蛋白。CD2v蛋白可破壞淋巴細(xì)胞功能，影響機(jī)體對病毒感染后的清除，并阻礙機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)作用。

1.3 傳播途徑 ASF在一個(gè)世紀(jì)前就已出現(xiàn)，在全球經(jīng)濟(jì)一體化的趨勢下，已導(dǎo)致全球60多個(gè)國家流行。ASFV 是一類可經(jīng)蟲媒傳播的病毒，在軟蜱中可存活數(shù)月至數(shù)年，帶毒的軟蜱通過叮咬家豬使病毒得以擴(kuò)散，可感染家豬和野豬。發(fā)病動物的分泌物、排泄物、組織及被污染的飼料、飲水、泔水、車輛等也可傳播病毒，可經(jīng)由呼吸道、消化道、肌肉等多種途徑感染豬群。我國ASF的暴發(fā)，主要是由于生豬調(diào)運(yùn)頻繁、散養(yǎng)戶過多、基層生物防控意識薄弱及感染豬只副產(chǎn)品的大范圍運(yùn)輸導(dǎo)致的。

1.4 臨床表現(xiàn) ASFV感染豬只后會在淋巴結(jié)中大量繁殖，擴(kuò)散后形成病毒血癥，并在肺臟、腎臟、腸道等器官中進(jìn)一步復(fù)制，從而引起嚴(yán)重的病理損傷，導(dǎo)致血管通透性增加，引起臟器嚴(yán)重出血。尤其是高毒力株感染后，最急性ASF的癥狀表現(xiàn)為病豬發(fā)熱，成堆擁擠在一起，往往無明顯癥狀就突然倒地死亡；急性ASF的臨床癥狀表現(xiàn)為高熱稽留，共濟(jì)失調(diào)，四肢發(fā)紺，多臟器出血，充血性脾腫大，肺臟水腫，淋巴細(xì)胞減少癥和血小板減少癥等［6］。低毒力株一般病死率低，臨床癥狀不明顯，呈持續(xù)性感染，表現(xiàn)為妊娠母豬流產(chǎn)，逐漸消瘦、跛行，關(guān)節(jié)腫大和皮膚潰瘍等，并會長期排毒［7］。

1.5 致病機(jī)制 ASFV 主要侵襲宿主的單核-巨噬細(xì)胞，感染過程非常復(fù)雜，影響因素眾多，還依賴多個(gè)細(xì)胞因子［8］。前期研究證實(shí)，ASFV進(jìn)入細(xì)胞的內(nèi)吞途徑主要由網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)和發(fā)動蛋白介導(dǎo)。除此之外，ASFV 也能通過大胞飲的方式進(jìn)入細(xì)胞，這主要是依賴細(xì)胞膜局部的不穩(wěn)定性來實(shí)現(xiàn)［9］。ASFV 進(jìn)入細(xì)胞后，ASFV 顆粒從早期的內(nèi)吞體移動到晚期的內(nèi)吞體，并依賴內(nèi)吞體內(nèi)的酸性環(huán)境完成脫殼。ASFV感染會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)膽固醇向“病毒工廠”富集，這可能對ASFV 的膜融合和病毒復(fù)制起到至關(guān)重要的作用。ASFV病毒粒子的組裝涉及依賴微管的波形蛋白的重排，病毒粒子成熟后，依靠微管蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜，并通過出芽方式從細(xì)胞中釋放［10］。

2 非洲豬瘟疫苗的研究進(jìn)展

ASF 流行100 多年，目前還沒有一種成熟的疫苗可以防控，因該病毒具有強(qiáng)大而復(fù)雜的免疫逃逸機(jī)制，主要保護(hù)性抗原尚未完全明確，病毒基因型多且易變異，所以關(guān)于ASF疫苗使用的爭議從未間斷，尤其是在疫苗研發(fā)評估、臨床應(yīng)用方面需謹(jǐn)慎。即便道路坎坷，學(xué)者們?nèi)栽跒锳SFV疫苗的研制不斷努力，并取得一定的成效，目前主要研究的是滅活疫苗、減毒活疫苗、亞單位疫苗。

2.1 滅活疫苗 滅活疫苗是目前技術(shù)已經(jīng)很成熟的一種傳統(tǒng)疫苗研制方法，通過細(xì)胞培養(yǎng)出大量的病毒，經(jīng)過一系列化學(xué)或物理方式使病毒喪失致病性，同時(shí)保持病毒抗原顆粒的完整性，從而刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體。關(guān)于ASFV滅活疫苗的最新研究是在2014年進(jìn)行的，用新型現(xiàn)代佐劑對其進(jìn)行了安全性測試，但是這些方法并沒有讓接種豬群得到有效保護(hù)。Estefania等［11］在低溫下用低濃度的二乙烯亞胺（BEI）滅活病毒，聯(lián)合新的強(qiáng)效佐劑，通過皮內(nèi)、肌內(nèi)同時(shí)雙重接種，4周后用相同劑量和注射方式進(jìn)行增強(qiáng)免疫，接種6 周后肌肉注射強(qiáng)毒株攻毒，結(jié)果所有動物均有ASF的臨床癥狀和病理表現(xiàn)，說明采用滅活疫苗沒有對ASFV攻擊產(chǎn)生有效保護(hù)。ASF滅活疫苗采用了各種新型的保護(hù)佐劑，迄今為止研究結(jié)果顯示ASF滅活疫苗無法提供有效保護(hù)，可能是由于病毒表面蛋白差異性很大，不是所有的抗原在失活后還保留完整結(jié)構(gòu)，因此影響了免疫效果，也表明細(xì)胞免疫在預(yù)防ASFV 中的重要性。而要產(chǎn)生細(xì)胞反應(yīng)，宿主細(xì)胞中必然有大量的病毒復(fù)制，這為減毒活疫苗的有效性提供了理論基礎(chǔ)。

2.2 減毒活疫苗

2.2.1 傳統(tǒng)減毒活疫苗 減毒活疫苗毒性明顯減少，既保持了原有的抗原性，又誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生強(qiáng)烈持久的免疫應(yīng)答，但因其存在毒力返強(qiáng)及病毒變異的問題，極大地限制了該類疫苗的應(yīng)用。葡萄牙在1962 年啟動了非洲豬瘟弱毒疫苗田間試驗(yàn)，結(jié)果出現(xiàn)母豬流產(chǎn)、皮膚壞死、關(guān)節(jié)炎、肺部損傷等慢性感染現(xiàn)象［12-13］。利用從軟蜱或者慢性感染豬只體內(nèi)分離到的天然弱毒株（OURT88/3和NH/P68）而制備的減毒活疫苗（LAV），在接種豬只后可以對同源毒株產(chǎn)生很好的免疫保護(hù)，不同的免疫途徑、接種劑量、攻毒株會產(chǎn)生不同的保護(hù)率［14］。通過非敏感細(xì)胞Vero細(xì)胞連續(xù)傳110代致弱的LAV，在免疫豬群后，其體內(nèi)復(fù)制能力降低，毒力逐步喪失，毒力基因的表達(dá)能力明顯下降，不能抵抗親本毒株的攻擊，也就不能提供有效的保護(hù)。

2.2.2 基因工程減毒活疫苗 ASF減毒活疫苗具有毒株特異性，傳統(tǒng)天然弱毒及人工培養(yǎng)弱化制備的LAV，其免疫效果差異巨大，包括殘余毒力、病毒血癥和亞臨床癥狀等，因此越來越多的學(xué)者開始研究基因缺失弱毒苗，認(rèn)為其安全性及可靠性更高。張艷艷等［15］以SY18 為親本株構(gòu)建了ASFV MGF 和CD2v 基因缺失疫苗候選株，并對其安全性和免疫保護(hù)效果進(jìn)行了特性研究，結(jié)果顯示，該雙基因缺失株能夠抵抗親本強(qiáng)毒株SY18株的攻擊。Elisabeth 等［16］用Ba71 ASFV 毒株基因缺失苗（缺失CD2基因）免疫豬只，能激活免疫系統(tǒng)并產(chǎn)生較強(qiáng)的抗體水平，有效抵抗親本毒株Ba71 和異源E75 毒株（兩種基因型Ⅰ株）的致命攻擊。這些結(jié)果為將來研發(fā)ASFV交叉保護(hù)疫苗開辟了新途徑，表明基于CD2v 的減毒活疫苗具有較大的開發(fā)前景，這對于在病毒流行和多種毒株傳播地區(qū)的ASFV 防控至關(guān)重要。目前ASFV重組致弱活疫苗主要集中于敲除TK、9GL、UK、EP402R、NL、MCF 360/55 基因，可以讓病毒毒力減弱且兼具較好的免疫原性。備受關(guān)注的哈獸研的非洲豬瘟7 基因缺失減毒活疫苗（ASFV-7GD）已開展相關(guān)臨床試驗(yàn)，若能通過安全性和免疫原性檢測，同時(shí)找到穩(wěn)定的生產(chǎn)細(xì)胞系，有可能成為首個(gè)商品化ASF疫苗。

2.3 亞單位疫苗 傳統(tǒng)亞單位疫苗是將可控蛋白質(zhì)分解或水解后純化，進(jìn)而篩選出具有免疫活性的小分子片段制備成疫苗。因沒有病毒核酸，克服了傳統(tǒng)減毒活疫苗滅活不完全、毒力返強(qiáng)等問題，安全性更好，但保護(hù)效力相對較弱。利用桿狀病毒、牛痘病毒、腺病毒、新城疫病毒、偽狂犬病毒作為病毒載體，能刺激細(xì)胞免疫，提供更優(yōu)秀的免疫保護(hù)效率，布局該技術(shù)路徑的包括普萊柯生物股份、中牧股份等企業(yè)。ASFV的CD2v 不是強(qiáng)免疫原性抗原，因此需接種較大劑量的蛋白質(zhì)才能誘導(dǎo)產(chǎn)生較高的抗體水平。用桿狀病毒表達(dá)的p54/p30 融合蛋白免疫豬群，可以產(chǎn)生一定量的中和抗體，并在攻毒后改善病程，減少病毒血癥的發(fā)生，同時(shí)保護(hù)豬只免受E75 的致命攻擊。利用桿狀病毒來表達(dá)的CD2v/p54/p30 蛋白，在免疫豬群后能產(chǎn)生中和抗體抵抗強(qiáng)毒株的攻擊，但會出現(xiàn)不同程度的病毒血癥。ASFV 基因組結(jié)構(gòu)龐大復(fù)雜，編碼蛋白多且容易發(fā)生變異，是影響疫苗研發(fā)和免疫效果的重要因素之一。p72 蛋白在體外單獨(dú)表達(dá)時(shí)容易出現(xiàn)錯(cuò)誤折疊，用輔助蛋白B602L 共表達(dá)時(shí)可得到正確折疊構(gòu)象的p72 蛋白［17］。將表達(dá)ASFV B646L、EP153R、EP402R 的抗原重組痘苗病毒免疫豬只后，能夠誘導(dǎo)IFN-γ分泌和T淋巴細(xì)胞增殖分化，但不能誘導(dǎo)機(jī)體體液免疫應(yīng)答［18］。

3 展望

伴隨經(jīng)濟(jì)全球化發(fā)展，跨地域的人員和貿(mào)易流通加快，養(yǎng)殖密度不斷提高，養(yǎng)殖模式越來越多樣化等，給ASF 的防控帶來更加嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，而ASF疫苗的研究歷來是一個(gè)世界性難題，盡管各國科學(xué)家們進(jìn)行了各種不同的嘗試，但由于其基因組結(jié)構(gòu)復(fù)雜，免疫逃避機(jī)制尚未研究透徹，至今仍無商業(yè)化的疫苗上市，給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來了嚴(yán)重的損失和威脅。隨著生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，以及對ASFV發(fā)病機(jī)制、免疫逃逸機(jī)制等的深入研究，相信在不久的將來，安全、可控的ASF疫苗定會成功問世。