倫玉瀟，李桂梅,2,3*，單 虎,2,3

(1.青島農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，山東青島 266109；2.山東省新獸藥創(chuàng)制協(xié)同創(chuàng)新中心，山東青島 266109；3.山東省獸藥診斷試劑工程技術研究中心，山東青島 266109)

非洲豬瘟(African swine fever,ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的豬的一種急性、高度接觸性、出血性傳染病。目前尚無有效安全的ASF疫苗。ASFV雙囊膜結構能適應多種不良環(huán)境，感染ASFV的豬可通過分泌物、排泄物等污染環(huán)境，健康豬接觸被污染的環(huán)境可被感染[1]。自然條件下隱性感染ASFV的豬臨床癥狀不明顯，只能從血液和組織中檢測到ASFV，這種隱性感染可造成更大范圍病原傳播[2]。

ASFV基因組可編碼150個～200個蛋白質(zhì)，大多與病毒復制、組裝、細胞凋亡、免疫功能、炎癥反應等有關[3]。p54是ASFV編碼的主要結構蛋白之一，在病毒的吸附和侵入過程起重要作用，病毒進入機體后可產(chǎn)生針對該蛋白的抗體，抗體檢測陽性即代表存在ASFV感染[4]。p54蛋白有很強的保守性，是良好的ASF血清學診斷靶點[5]。p54蛋白建立的血清學試驗方法靈敏性為98%，特異性為97%[6]。健康豬的血清中不存在ASFV特異性抗體，通過特異性抗體檢測可篩查出感染ASFV的豬。感染ASFV NH/P68弱毒株后用ELISA在感染早期即可檢測到針對p54蛋白的IgG抗體反應，在感染后14 d～39 d期間p54抗體均維持在較高水平[7]。藍思白2號(LS-2)豬在經(jīng)過ASFV強毒攻擊后約有80%存活,存活豬自感染的第12天起體內(nèi)的p54抗體水平較高，普通豬感染后10 d內(nèi)死亡且體內(nèi)p54抗體水平較低或陰性[8]。p54抗體水平越高，代表機體產(chǎn)生的免疫性越強。因此，p54抗體適于篩查ASFV感染后存活豬或無癥狀感染豬的檢測靶標。

用原核或真核表達系統(tǒng)表達的ASFV重組抗原已成為用活病毒或滅活病毒的抗體檢測的重要替代方法。原核表達系統(tǒng)具有成本低、用時短、適于大規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)勢。pCold TF載體上的TF標簽作為分子伴侶，有助于肽鏈的正確折疊，并提高蛋白的可溶性。本研究用pCold TF載體表達具有可溶性的ASFV p54重組截短蛋白，探究該蛋白作為包被抗原應用于ASFV抗體檢測的可能性，為開發(fā)ASFV抗體檢測方法奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、載體和主要試劑 pCold TF載體、滅活的ASFV陽性血清，由青島農(nóng)業(yè)大學預防獸醫(yī)學重點實驗室保存；大腸埃希氏菌感受態(tài)細胞BL21和DH5α、DNA標準 DL 1 000、限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ和PstⅠ、2×Premix ExTaqDNA聚合酶、MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0試劑盒、人鼻病毒(Human rhinovirus,HRV) 3C Protease試劑盒、PVDF膜，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；IPTG、磷酸鹽緩沖液(PBS)、DNA回收試劑盒、蛋白分子質(zhì)量標準(11 ku～180 ku)、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、4×蛋白上樣緩沖液，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；HRP標記的山羊抗豬IgG(H+L)、HRP標記的山羊抗小鼠IgG(H+L)，艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司產(chǎn)品；質(zhì)粒小提試劑盒，天根生化科技有限公司產(chǎn)品；His標簽蛋白純化試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒，北京康為世紀生物科技有限公司產(chǎn)品；ASFV p54單抗(小鼠)，美國GeneTex公司產(chǎn)品；蛋白分子質(zhì)量標準(10 ku～180 ku)，山東思科捷生物技術有限公司產(chǎn)品；考馬斯亮藍染色液、蛋白分子質(zhì)量標準(15 ku～130 ku)、蛋白分子質(zhì)量標準(10 ku～250 ku)，生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 儀器和設備 電子天平，上海精天電子儀器有限公司產(chǎn)品；瓊脂糖水平電泳槽，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；PCR擴增儀、電泳儀、小型垂直電泳槽、小型轉(zhuǎn)印槽，美國伯樂公司產(chǎn)品；光凝膠成像系統(tǒng)，上海勤翔科學儀器有限公司產(chǎn)品；超速低溫離心機、電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設備有限公司產(chǎn)品；超聲波細胞破碎儀，上海狄昊實業(yè)發(fā)展有限公司產(chǎn)品；脫色搖床，江蘇其林貝爾儀器制造有限公司產(chǎn)品；紫外分光光度計，上海美譜達儀器有限公司產(chǎn)品；超低溫冰箱，青島海爾股份有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒pCold TF-p54的構建 根據(jù)GenBank收錄的ASFV p54基因片段(Sequence ID：KJ380910.1)，找到51-183位氨基酸相對應的基因序列，交由中美泰和生物技術有限公司合成。以合成的基因為模板并結合pCold TF載體上的酶切位點EcoRⅠ和PstⅠ設計引物以擴增帶有酶切位點的截短p54基因片段，并通過瓊脂糖凝膠電泳驗證條帶大小。

上游和下游引物序列分別為:p54-F：5′-TAGAATTCCTATTCTCTTCAAGAAAG-3′(下劃線處為EcoRⅠ酶切位點)；p54-R:5′-TACTGCAGTTACAAGGAGTTTTCTAGG-3′(下劃線處為PstⅠ酶切位點)。引物交由青島派森諾基因科技有限公司合成。PCR擴增體系如下：12.5 μL 2×Premix ExTaqDNA聚合酶，0.5 μL p54-F，0.5 μL p54-R，1 μL 模板，10.5 μL ddH2O。PCR擴增程序為：95℃ 10 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，共35個循環(huán)； 72℃終延伸 10 min。膠回收PCR產(chǎn)物，經(jīng)EcoRⅠ和PstⅠ雙酶切后連入pCold TF載體，轉(zhuǎn)化至大腸埃希氏菌感受態(tài)細胞DH5α中。進行菌液PCR驗證，取陽性克隆菌的菌液送青島派森諾基因科技有限公司測序。測序結果進行blast比對。

1.2.2 p54重組截短蛋白的可溶性表達 將測序結果正確的陽性克隆菌的菌液擴大培養(yǎng)后用質(zhì)粒小提試劑盒提取重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化到大腸埃希氏菌感受態(tài)細胞BL21中。再次經(jīng)菌液PCR驗證后挑取陽性克隆菌落擴大培養(yǎng)。次日以3∶100轉(zhuǎn)接入50 mL含Amp的LB培養(yǎng)液中，于37℃搖床中培養(yǎng)至OD600 nm值為0.6左右時分到各個培養(yǎng)管中，保持每管菌液量相同。根據(jù)菌液體積加入1 mol/L IPTG使IPTG終濃度為1 mmol/L，16℃誘導24 h，同時將轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞BL21中的pCold TF空載體菌作為相同誘導條件下的對照，并設置不加入IPTG的未誘導菌液作為陰性對照。24 h后留取30 μL誘導后的重組菌液用于SDS-PAGE上樣，將剩下的菌液置于冰浴中超聲破碎至菌液由渾濁變?yōu)槌吻?。離心后分離出上清液，再用同等體積預冷的PBS重懸沉淀。在各個未誘導及誘導后的樣品中各加入4×蛋白上樣緩沖液后煮沸，根據(jù)SDS-PAGE凝膠電泳確定蛋白是否可溶性表達。

1.2.3 IPTG誘導濃度與誘導時間的優(yōu)化 參考用pCold TF載體表達蛋白的已發(fā)表文獻，可知誘導表達時多選用16℃。因此，將16℃作為誘導溫度，在這個基礎上優(yōu)化了IPTG添加濃度及誘導時間。取適量重組菌過夜活化后，隔天進一步擴大培養(yǎng)，當OD600 nm值為0.6左右時將重組菌液分到各個培養(yǎng)管中，使每管含有相同體積的菌液。之后依次分別加入不同體積的1 mol/L IPTG使得IPTG終濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2 mmol/L，16℃誘導24 h。最后根據(jù)SDS-PAGE凝膠電泳及考馬斯亮藍染色的結果判斷p54重組截短蛋白的表達情況，從而可篩選出最優(yōu)的IPTG添加濃度。

按照篩選出的最優(yōu)IPTG誘導濃度添加IPTG后，將重組菌液置于16℃下分別誘導3、6、9、12、21、24 h。最后根據(jù)SDS-PAGE凝膠電泳結果篩選出最優(yōu)的IPTG誘導表達時間。

1.2.4 p54重組截短蛋白的純化 根據(jù)篩選出的最優(yōu)IPTG誘導濃度和最佳誘導時間，重新誘導重組菌液，離心后收集菌體沉淀。用適量預冷的無菌PBS重懸菌體沉淀，于冰浴下超聲破碎，離心后收集上清液。隨后依照His標簽蛋白純化試劑盒說明書純化上清液中的p54重組截短蛋白，同時對咪唑洗脫液所用咪唑的濃度設置了40 mmol/L和50 mmol/L兩個梯度，以探究在節(jié)約試劑的同時獲得較純p54重組截短蛋白的簡易方法。收集純化過程中的流穿液、洗滌液及洗脫液，通過SDS-PAGE凝膠電泳和考馬斯亮藍染色結果判斷p54重組截短蛋白的純化效果及條帶的純度，并用BCA蛋白定量試劑盒對純化后的p54重組截短蛋白定量。

1.2.5 切除p54重組截短蛋白的TF標簽及切除后的純化 TF標簽的分子質(zhì)量較大(52 ku)，可能阻礙抗體對p54截短蛋白的識別，為此需將蛋白標簽切除。先根據(jù)HRV 3C Protease試劑盒的說明構建蛋白標簽切除體系，并對HRV 3C Protease的用量進行摸索。向50 μg純化的p54重組截短蛋白中分別加入2.5、1、0.5 μL HRV 3C Protease后，均加入10 μL HRV 3C Cleavage buffer，并用ddH2O補齊至100 μL。4℃反應16 h后，借助SDS-PAGE凝膠電泳，輔以考馬斯亮藍染色判斷TF標簽的切除效果。同時用His標簽蛋白純化試劑盒將無標簽的p54截短蛋白從構建的切除體系中純化出來，即收集流穿液。結合SDS-PAGE凝膠電泳結果判斷純化效果。

1.2.6 標簽蛋白對p54重組截短蛋白反應原性的影響 用Western blot驗證TF標簽的有無對于p54單抗識別p54截短蛋白的影響。將經(jīng)IPTG誘導后的空載體菌作為陰性對照，連同IPTG誘導后的p54重組截短蛋白及標簽切除后的p54截短蛋白一起經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，用50 g/L脫脂奶粉室溫封閉2 h。選擇 ASFV p54單抗(1∶5 000)作為一抗，4℃過夜孵育。隔天加入HRP-山羊抗鼠IgG(1∶6 000)作為二抗，室溫孵育1 h，ECL顯色。

1.2.7 p54重組截短蛋白的反應原性鑒定 為了驗證原核表達的p54重組截短蛋白是否可應用于ASFV抗體的檢測，借助Western blot檢驗該蛋白能否被ASFV抗體陽性豬血清所識別。將IPTG誘導的空載體菌作為陰性對照，連同純化后的p54重組截短蛋白一起經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，用50 g/L脫脂奶粉室溫封閉2 h。加入滅活的ASFV抗體陽性豬血清(1∶200)，4℃過夜孵育。隔天加入HRP-山羊抗豬IgG(1∶2 000)，室溫孵育1 h，ECL顯色。

2 結果

2.1 截短的p54基因PCR擴增

截短的p54基因的PCR擴增結果與預期相符，大小為421 bp(圖1)。將測序結果在NCBI上Blast比對后，結果顯示，測序序列與GenBank上ASFV p54基因序列的同源性為99%，且翻譯后的氨基酸序列一致，證實了重組質(zhì)粒pCold TF-p54構建成功。

M.DNA標準DL 1 000；1.樣品

2.2 p54重組截短蛋白的可溶性表達

因pCold-TF載體上所帶的TF及His標簽的融合表達，最終獲得的p54重組截短蛋白的預計大小要在截短p54基因編碼的蛋白大小的基礎上再加52 ku。空載體菌不表達p54重組截短蛋白，而重組菌則表達該蛋白，蛋白的分子質(zhì)量約為76 ku，與預期相符。比較第5和第6泳道發(fā)現(xiàn)相比于沉淀，p54重組截短蛋白更多地分布在菌液裂解后的上清中(圖2)，從而證實了該蛋白的可溶性表達。

2.3 IPTG誘導濃度與誘導時間的優(yōu)化

加入IPTG后p54重組截短蛋白的表達顯著增強。通過各個泳道中重組蛋白的表達量可知，當IPTG在重組菌菌液中的終濃度為1 mmol/L(圖3)，誘導9 h(圖4)時，獲得的p54重組截短蛋白產(chǎn)量最高。

M.蛋白分子質(zhì)量標準(11 ku～180 ku);1～7.IPTG誘導終濃度分別是0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L的重組菌

M.蛋白分子質(zhì)量標準(15 ku～130 ku)；1.未加IPTG的空載體菌；2.加IPTG誘導的空載體菌；3.未加IPTG的重組菌；4～9.加IPTG后分別誘導3、6、9、12、21、24 h的重組菌

2.4 p54重組截短蛋白的純化

SDS-PAGE的結果表明低濃度40 mmol/L及50 mmol/L咪唑洗脫液即可洗脫p54重組截短蛋白，且50 mmol/L的咪唑洗脫液洗脫的蛋白純度較好(圖5)，從而在節(jié)約試劑的同時也簡化了對p54重組截短蛋白的純化。

M.蛋白分子質(zhì)量標準(10 ku～180 ku)；1～2.流穿液；3～5.洗滌液； 6～7.40 mmol/L咪唑洗脫液；8～9.50 mmol/L咪唑洗脫液；10～14.500 mmol/L咪唑洗脫液

2.5 切除p54重組截短蛋白的TF標簽及切除后的純化

2～4泳道的條帶分布表明用2.5、1.0、0.5 μL HRV 3C Protease切除50 μg p54重組截短蛋白，4℃作用16 h的條件下HRV 3C Protease的用量不影響重組蛋白的標簽切除效果，因為此時大部分蛋白的標簽均可被切除。結合第5泳道的條帶可知52 ku的條帶是切除的TF及與其相連的His標簽，而22 ku的條帶是HRV 3C Protease。切除的52 ku的條帶較粗，這是因為當TF過表達時可抑制包涵體形成，促使蛋白可溶性表達。第7泳道的條帶是純化后的p54截短蛋白，52 ku及22 ku這兩種雜蛋白已被純化去除(圖6)。這是因為所用的HRV 3C Protease的N末端有6×HN(經(jīng)修飾的His)標簽，因此也可用His標簽蛋白純化試劑盒純化，收集的流穿液即為無標簽的p54截短蛋白。證實p54重組截短蛋白上的標簽可被切除并可通過純化去除，最終獲得無標簽的、高純度的p54截短蛋白。

2.6 標簽蛋白對p54重組截短蛋白反應原性的影響

第1泳道中經(jīng)IPTG誘導的空載體菌表達的蛋白及第2泳道中切除的TF及His標簽不能與ASFV p54單抗結合。而第2和3泳道的76 ku處有明顯條帶，表明帶標簽的p54重組截短蛋白能被ASFV p54單抗識別。第2泳道中24 ku處的條帶說明ASFV p54單抗也可識別無標簽的p54截短蛋白，但不如76 ku處的條帶明顯(圖7)。同時結合第4泳道，無標簽的p54截短蛋白的量要比未切除標簽的p54重組截短蛋白的量多(圖6)，且被切除的His標簽一般不影響蛋白的功能，因此可推測TF標簽的表達參與加強抗體對p54蛋白的識別，第3泳道的條帶也可以證明這一點(圖7)。結合以上分析，圖7結果證明了原核表達的p54重組截短蛋白及無標簽的p54截短蛋白能與特異性抗體結合，具有反應原性，且TF標簽的表達有助于抗體對p54截短蛋白的識別，因此建議使用帶標簽的p54重組截短蛋白。

M.蛋白分子質(zhì)量標準(10 ku～250 ku)；1.加IPTG誘導后純化的p54重組截短蛋白；2～4.分別由2.5、1.0、0.5 μL HRV 3C Protease切除50 μg p54重組截短蛋白；5.HRV 3C Protease試劑盒提供帶有TF標簽的對照融合蛋白切除后標簽；6.由HRV 3C Protease試劑盒提供的未切除標簽的對照融合蛋白；7.純化出的無標簽p54截短蛋白

M.蛋白分子質(zhì)量標準(10 ku～250 ku)；1.加IPTG誘導后的空載體菌；2.0.5 μL HRV 3C Protease切除50 μg p54重組截短蛋白；3.加IPTG誘導后純化的p54重組截短蛋白

2.7 p54重組截短蛋白的反應原性鑒定

第2泳道的76 ku位置處有明顯條帶(圖8)，說明p54重組截短蛋白能被ASFV抗體陽性血清所成功識別，證實了其具有良好的反應原性，可用于血清學抗體檢測。

M.蛋白分子質(zhì)量標準(11 ku～180 ku)；1.加IPTG誘導后的空載體菌；2.加IPTG誘導后純化的p54重組截短蛋白

3 討論

本研究采用的pCold TF載體是一種帶有His標簽及Trigger Factor(TF)可溶性標簽的冷休克表達載體，這類載體帶有cspA(冷休克蛋白A)啟動子及相關元件，使得低溫條件下更利于目的蛋白的表達，同時抑制其他細胞蛋白質(zhì)的表達。實際應用pCold TF載體表達目的蛋白時，多選擇15℃或16℃誘導蛋白的表達[9-10]。本研究結果顯示在16℃誘導時，p54重組截短蛋白的表達效果良好。TF標簽是一種大腸埃希氏菌的具有核糖體結合位點的分子伴侶，促進新生肽鏈的共翻譯正確折疊，也可游離于胞質(zhì)內(nèi)輔助翻譯后肽鏈的折疊，從而利于蛋白的可溶性表達[11]。圖2顯示原核表達的p54重組截短蛋白具有可溶性，這與TF標簽的分子伴侶作用有關。先前研究表明p54蛋白的前50個aa中無B細胞表位，且其中大多為疏水性aa[12]。有研究在篩選p54蛋白的B細胞表位時，用ELISA鑒定出p54蛋白的64-70 aa、75-85 aa、103-115 aa為免疫顯性區(qū)域，能與ASFV陽性血清劇烈反應[13]。因此，理論上去除前50個aa的p54蛋白具有與ASFV陽性血清結合的能力。本研究結果證實了原核表達的p54重組截短蛋白可與ASFV陽性血清反應，具有反應原性。

pCold TF載體上的TF標簽序列與多克隆位點區(qū)之間有HRV 3C Protease切割位點，可去除TF及與其相連的His標簽蛋白。TF標簽的缺失表達會加強蛋白的聚集，不利于其天然構象的形成，而TF標簽的過表達則有助于有聚集傾向的蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ苄缘鞍譡14]。這為借助pCold TF載體實現(xiàn)外源蛋白的高效率原核表達提供了理論基礎。本文的研究結果證實p54重組截短蛋白上的TF標簽并不影響抗體對于p54蛋白的識別,這可能是由于TF標簽的表達促進了p54蛋白天然構象的形成，從而利于對p54蛋白的識別。另一方面，切除標簽并純化的過程會造成蛋白丟失。綜上所述，不建議對p54重組截短蛋白進行TF標簽的切除。pCold TF載體在表達兼具可溶性與反應原性的外源蛋白方面具有獨特優(yōu)勢，值得重視該載體在原核表達蛋白方面的實際應用。

ASFV的p54蛋白在ASFV免疫學檢測方法中得到廣泛應用。如基于p54蛋白單克隆抗體建立了雙抗體夾心ELISA及膠體金免疫層析試紙條以檢測ASFV抗原[15]。此外，用截短的p54蛋白制成的熒光免疫層析試紙條有助于更直觀地檢測ASFV抗體[16]。還有研究發(fā)現(xiàn)并驗證了ASFV p54蛋白中一處非常保守的抗原位點，基于該位點制備單抗并建立了檢測ASFV抗體的競爭ELISA法，該方法的特異性可高達100%[17]。利用可識別p54蛋白C端蛋白序列的p54單抗建立了競爭性ELISA方法，其檢測靈敏度可達到92.5%，特異性可達到98.9%[18]。結合雙重組病毒蛋白p30和p54的雙量子點微球探針可以超靈敏地定量檢測血清中的ASFV抗體 ，抗體在血清稀釋度為1∶1000～1∶64000范圍內(nèi)都可被檢測到，且整個抗體篩查試驗可在25 min內(nèi)完成[19]。ASFV免疫學檢測方法的建立需要包被抗原或抗體具有可溶性及與相應抗體或抗原結合的能力，本研究表達的p54重組截短蛋白可滿足上述要求。

p54蛋白還被應用于疫苗開發(fā)中。構建的融合ASFV p54蛋白-豬Ig重鏈的重組釀酒酵母表達載體疫苗可誘導產(chǎn)生黏膜免疫[20]。用表達ASFV p54和豬IL21融合蛋白的重組植物乳桿菌作為口服疫苗可誘導機體產(chǎn)生細胞和體液免疫[21]。新型細胞穿透肽Z12與ASFV p54和p30蛋白融合后作為亞單位疫苗免疫小鼠后，小鼠的血清在體外中和了超過85%的ASFV[22]。也有多個研究表明pCold TF載體表達的重組蛋白具有免疫原性，可刺激小鼠產(chǎn)生抗血清，抗體效價較高且獲得的抗血清與相應抗原間可以發(fā)生特異性結合[23-24]。本文因著重于研究pCold TF載體表達的p54重組截短蛋白作為包被抗原使用的可能，并未對其免疫原性進行驗證。但不可否認，p54蛋白是誘導機體產(chǎn)生保護性免疫反應的重要免疫原。

本研究用原核表達系統(tǒng)可獲得兼具可溶性和反應原性的p54重組截短蛋白，可用于檢測ASFV抗體使用。且用原核表達系統(tǒng)極大地縮短了獲得p54重組截短蛋白的時間，利于基于此蛋白研制的ASFV抗體檢測試劑盒的大規(guī)模生產(chǎn)。