吳曉傲，劉婉葶，單栢強，馮壽華，馮曉慧，魏 澍，吳洪濤，張 飛，沈國順，陳澤良，劉金玲*

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧沈陽 110866；2.遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，遼寧沈陽 110164)

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)能夠引起豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)，是目前危害養(yǎng)豬業(yè)的主要病毒性傳染病。感染豬耳部發(fā)紺呈紫色，又稱“豬藍(lán)耳病”，首次報道于20世紀(jì)80年代，可感染不同年齡段的豬群，以妊娠母豬和初生仔豬最易感[1]。PRRSV分為基因Ⅰ型和基因Ⅱ型2個基因型，歐洲Lelystad virus 和美洲的VR2332分別是2個基因型的代表毒株。雖然2個基因型的基因組結(jié)構(gòu)相似，但它們的核苷酸有著明顯差異[2]。PRRSV的基因組片段大約15 kb，5′端有帽子結(jié)構(gòu)以及非編碼區(qū)(UTR)，3′端有poly(A)尾巴和UTR。從5′端到3′端有8個開放閱讀框(ORFs)，分別是編碼非結(jié)構(gòu)蛋白的ORF1a和ORF1b，編碼結(jié)構(gòu)蛋白的ORF2-ORF7。其中GP2-GP5編碼4種囊膜蛋白，ORF6編碼非糖基化的M蛋白，ORF7編碼N蛋白。GP5由ORF5編碼，是一種由200個氨基酸組成的高度糖基化蛋白，具有很強的免疫原性，能夠誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生。GP5與M蛋白形成異源二聚體，作用到唾液酸受體(Sn)，參與PRRSV對豬肺泡巨噬細(xì)胞的吸附與入侵[3]。因此，GP5常作為PRRSV新型疫苗的后選蛋白應(yīng)用于PRRSV防控等研究中。NSP2是PRRSV粒子中由ORF1a編碼的最易變異的最大非結(jié)構(gòu)蛋白，參與病毒的復(fù)制過程[4]。2006年，幾乎遍布全國各養(yǎng)豬場的“豬高熱病”，就是PRRSV 的NSP2基因有30個不連續(xù)氨基酸的缺失，演變成高致病性PRRSV，導(dǎo)致較高的生豬死亡率，給養(yǎng)豬業(yè)造了巨大的經(jīng)濟損失[5]。NSP9和NSP10是PRRSV粒子中由ORF1b自身酶分割多聚蛋白pp1ab后形成的非結(jié)構(gòu)蛋白，NSP9是PRRSV唯一的RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp)，PRRSV NSP10含有NTPase/RNA解旋酶活性。研究發(fā)現(xiàn)，HP-PRRSV NSP9和NSP10與病毒的毒力相關(guān)，并且與病毒的復(fù)制具有十分緊密的聯(lián)系，二者協(xié)同作用能夠促進(jìn)PRRSV的轉(zhuǎn)錄復(fù)制[6-7]。

PRRSV可經(jīng)口、空氣、接觸及流產(chǎn)母豬的子宮內(nèi)容物等多種途徑感染易感豬，在病豬的鼻腔、糞便和尿液中均可檢測到該病毒，因此有效的切斷PRRSV的傳播途徑徹底根治PRRS面臨的重要問題。為了降低PRRSV的傳入風(fēng)險，養(yǎng)殖企業(yè)采取嚴(yán)格的防控措施以增強豬場的生物安全性。然而，在全進(jìn)全出的豬場中仍然經(jīng)常發(fā)生PRRSV的感染，并且某些生物安全措施如在豬場的建筑物附近開口處放置防鳥網(wǎng)，并不能阻止小型嚙齒類、昆蟲等進(jìn)入豬場。相關(guān)研究表明鼠、禽、蚊子和蠅能夠攜帶PRRSV并能從其糞便中分離出PRRSV，使其成為PRRSV的新傳播者或攜帶者[8]。因此，小型嚙齒類、昆蟲類等環(huán)境生物能否在豬群中傳播PRRSV需要進(jìn)一步的研究。為了初步評估環(huán)境中動物媒介傳播PRRSV的潛在風(fēng)險以及傳播病原的分子生物學(xué)特點，本研究捕獲豬場家鼠，收集小鼠糞便，提取RNA反轉(zhuǎn)錄后采用PCR方法，檢測NSP10、ORF9、NSP5 和NSP2等PRRSV目的基因，測序后采用生物信息學(xué)軟件分析鼠源和來源于同一豬場感染豬PRRSV NSP2、ORF5、NSP9和NSP10基因的遺傳特性，從易感和非易感動物角度深入了解PRRSV的傳播特性，為PRRSV的綜合防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑及儀器設(shè)備 Trizol reagent試劑盒、2×TaqPlus Master Mix，諾唯贊工程(南京)有限公司產(chǎn)品；氯仿、無水乙醇，全式金(北京)生物有限公司產(chǎn)品；Hank's溶液，普洛恩(天津)科技有限公司產(chǎn)品；DEPC處理水、瓊脂糖，電泳液，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR047A)，Takara寶生物有限公司產(chǎn)品；PCR儀，賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品；凝膠成像儀APLEGEN CA94107，Gel公司產(chǎn)品；電泳儀，美國伯樂公司產(chǎn)品。

1.1.2 樣品 豬場豬源PRRSV陽性(RPV，CSFV和PCV陰性)病料、豬場家鼠腸道糞便，由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院保存。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 NSP9、NSP10特異性引物參照文獻(xiàn)[9]，用Primer 5.0軟件參考NCBI GenBank登陸的PRRSV基因序列，設(shè)計NSP2、ORF5特異性引物、ORF5、NSP9、NSP10的套式引物，并送往鴻訊生物(蘇州)有限公司合成。

1.2.2 豬場豬源和鼠源PRRSV RNA基因組的提取、反轉(zhuǎn)錄及目的基因擴增 將收集的家鼠腸道糞便樣經(jīng)Hank’s浸泡后取上清200 μL，小鼠的組織臟器和豬場豬源PRRSV陽性的豬淋巴組織各約0.528 g和2.016 g用液氮研磨成粉沫后分別置于1.5 mL除酶離心管，按照Trizol reagent試劑盒說明書提取樣品RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。參考R211-01/02反轉(zhuǎn)錄酶說明書將模板RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行PRRSVNSP2、ORF5、NSP9、NSP10基因的PCR擴增。再分別取第一次PCR產(chǎn)物1 μL為模板，采用二次PCR方法或套式PCR擴增PRRSVNSP2、ORF5、NSP9和NSP10基因。取5 μL擴增產(chǎn)物，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后用凝膠成像系統(tǒng)檢測PRRSV目的條帶，對PRRSV的PCR陽性產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司測序。

1.2.3 豬場豬源和鼠源PRRSV主要基因生物信息學(xué)分析 將測序獲得的鼠源、豬場豬源PRRSVNSP2、ORF5、NSP9和NSP10基因序列與GenBank中登錄的PRRSV毒株的相應(yīng)基因，采用MEGA 5.0生物軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，使用DNASTAR等生物軟件分析氨基酸位點的變異情況。

1.2.4 豬場豬源和鼠源PRRSV主要差異基因編碼蛋白的三維結(jié)構(gòu)及理化特點分析 結(jié)合1.2.3的分析結(jié)果對豬源和鼠源PRRSV變異較大的差異基因用Interpro(https://www.ebi.ac.uk/interpro/)進(jìn)一步分析氨基酸序列，并提交序列至Swiss-Model服務(wù)器預(yù)測蛋白三級結(jié)構(gòu)，以Swiss-Model從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(www.rcsb.org)獲取適宜的晶體結(jié)構(gòu)作為模板，結(jié)合Visual Molecular Dynamics 1.9.3軟件展示和比較鼠源和豬源PRRSV主要差異蛋白的三維結(jié)構(gòu)，通過計算蛋白結(jié)構(gòu)域氨基酸組成的均方根偏差(Root-Mean-Square Deviation,RMSD)值評估結(jié)構(gòu)的相似性，當(dāng)2>RMSD>0，說明兩個蛋白的結(jié)構(gòu)相似。采用Protscale(https://web.expasy.org/)軟件評估鼠源和豬源PRRSV主要差異蛋白的疏水性、親水性以及功能性氨基酸的特點。

2 結(jié)果

2.1 豬場豬源和鼠源 PRRSV目的基因RT-PCR擴增結(jié)果

豬場豬源PRRSV陽性樣本的NSP2、ORF5、NSP9、NSP10基因的RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，分別在250、385、2025、1404 bp出現(xiàn)目的片段，與預(yù)期片段大小一致(圖1)。鼠源腸道糞便以及糞便樣本PRRSVNSP2、ORF5、NSP9、NSP10基因二次和套式PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示分別在250、258、529、498 bp出現(xiàn)目的片段，與預(yù)期片段大小一致(圖2)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;A.1～2.豬源PRRSV NSP2和ORF5基因片段;3.空白對照;4.豬源PRRSV NSP10基因片段;5.空白對照。B.1.空白對照；2～3.豬源PRRSV NSP9基因片段

A.M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000; 1.鼠糞便源PRRSV NSP2基因片段；2.鼠腸道糞便源PRRSV NSP2基因片段；3.空白對照; B.M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000;1.鼠糞便源PRRSV ORF5基因片段；2.鼠腸道糞便源PRRSV ORF5基因片段；3.空白對照;C.1～3.鼠糞便源PRRSV NSP9基因片段；4～5.鼠腸道糞便源PRRSV NSP9基因片段；6.空白對照;D.1.鼠源糞便PRRSV NSP10基因片段；2.空白對照；3～4.正常鼠糞便

2.2 豬場豬源和鼠源PRRSV基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果

鼠源和豬場豬源PRRSV基因與GenBank登陸的PRRSV代表株進(jìn)行遺傳進(jìn)化樹分析(圖3)，鼠源與豬源PRRSV NSP2、ORF5、NSP9和NSP10基因均為美洲基因型分支，與高致病性GDZQ、FZA06等毒株屬于同一分支群，親緣關(guān)系較近。而EuroPRRSV和Lelystad virus成獨立分支群為歐洲基因型分支。

2.3 豬場豬源和鼠源 PRRSV基因氨基酸序列位點比較結(jié)果

鼠源、豬源以及其他PRRSV代表株基因編碼的氨基酸序列比對結(jié)果顯示，與其他PRRSV代表株相比，鼠源PRRSV NSP2基因第486位發(fā)生486Leu→ILe替換，第487位氨基酸缺失，豬源PRRSV NSP2基因與其他PRRSV代表株相比第486、487位氨基酸缺失(圖3A)；鼠源PRRSV ORF5基因第36位氨基酸缺失，第27-28、30-35、101位發(fā)生27Val→Ala、28Leu→Ala、30Asn→Thr、31Ala→Pro、32Ser→Ile、33Asn→Ala、34Asn→Phe、35Asn→Phe、101Tyr→Phe替換；豬源PRRSV ORF5基因與FZ06、JXA1、GD、HUN4、JXWn06株氨基酸序列一致，無缺失替換(圖3B)；鼠源PRRSV NSP9基因與豬源以及其他PRRSV代表株NSP9相比第151位氨基酸缺失；144-146位氨基酸發(fā)生144Leu→Lys、145His→Leu和146Cys→Tyr 的替換(圖4C)；鼠源PRRSV NSP10基因第120位氨基酸缺失，第115-117、123、131、133位發(fā)生115Gln→Leu、116Trp→Pro、117Thr→Asp、123Thr→Ser、131Glu→Gly、133Asn→Asp替換，第269位有一個Pro氨基酸的插入；豬源PRRSV NSP10基因與其他PRRSV代表株相比第204、216位發(fā)生204Arg→His、216Trp→Arg替換(圖4D)。

A～D.鼠源和豬場豬源PRRSV NSP2、ORF5、NSP9和NSP10基因與其他PRRSV代表株進(jìn)化樹分析

A.PRRSV NSP2基因氨基酸序列比對結(jié)果；B.PRRSV ORF5基因氨基酸序列比對結(jié)果；C.PRRSV NSP9基因氨基酸序列比對結(jié)果；D.PRRSV NSP10基因氨基酸序列比對結(jié)果

2.4 豬場豬源和鼠源PRRSV NSP10蛋白3D結(jié)構(gòu)組成及無規(guī)則卷曲環(huán)差異分析

結(jié)合氨基酸分析的結(jié)果，選擇變異差異比較大的PRRSV NSP10利用SWISS-MODEL模擬構(gòu)建豬源和鼠源PRRSV NSP10蛋白的3D結(jié)構(gòu)進(jìn)行差異分析。結(jié)果顯示豬場豬源和鼠源PRRSV NSP10蛋白均包含4個β折疊片和5個α螺旋(圖5)，經(jīng)VMD1.9.3計算2個PRRSV NSP10蛋白整體碳骨架的RMSD值是1.67<2，表明豬場豬源和鼠源 PRRSV NSP10蛋白具有相似的三級結(jié)構(gòu)(圖5B，5C)。但115-133位氨基酸形成的蛋白質(zhì)無規(guī)則卷曲環(huán)區(qū)域，其碳骨架的RMSD值是3.32>2，提示氨基酸變異位點使二者在該結(jié)構(gòu)區(qū)域存在較大的差異，圖5A)。

A.鼠源和豬源PRRSV NSP10蛋白無規(guī)則卷曲；B-C.鼠源和豬源PRRSV NSP10蛋白α螺旋和β折疊片

2.5 豬場豬源和鼠源PRRSV NSP10蛋白3D結(jié)構(gòu)域特點比較

Interpro對NSP10序列進(jìn)一步分析的結(jié)果顯示豬場豬源和鼠源的PRRSV NSP10蛋白由腺苷三磷酸酶和解旋酶2個結(jié)構(gòu)域以及2個非酶結(jié)構(gòu)域組成(圖6)，非酶結(jié)構(gòu)域通常具有調(diào)節(jié)Heli的功能。豬場豬源和鼠源PRRSV NSP10蛋白的Gln252、Pro151、Gly152、Ala153、Gly154、Lys155、Thr156、His157分別構(gòu)成了相應(yīng)蛋白的ATP結(jié)合位點，其中兩者間151-157位氨基酸的RMSD值為0.094<2，位點225-229氨基酸組成DEAD樣Helix超級RNA解旋酶結(jié)構(gòu)域，其兩者間RMSD值是0.49<2，表明該部分結(jié)構(gòu)域具有相似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，有著較高的相似度(圖6B，6C)。但是二者間的Gln252骨架原子Cα的原子距離是0.664 nm，表明豬源和鼠源PRRSV NSP10蛋白的Gln252存在較大的位置差異(圖6A)。

A-B.鼠源和豬源PRRSV NSP10 ATP結(jié)合位點；C.鼠源和豬源PRRSV NSP10蛋白解旋酶蛋白結(jié)構(gòu)

2.6 豬場豬源和鼠源PRRSV NSP10蛋白親疏水性特點

豬場豬源和鼠源PRRSV NSP10蛋白總平均親水性系數(shù)分別為0.047和0.043，屬于疏水蛋白，表明二者具有相同的親疏水性組成(圖7)。

A～B.鼠源PRRSV NSP10蛋白親疏水性；C～D.豬源PRRSV NSP10蛋白親疏水性

3 討論

PRRSV具有高變異、多樣性的特點。變異產(chǎn)生的PRRSV變異株會改變病毒的生物學(xué)特性，也極易造成PRRS的大面積暴發(fā)。2006年4月我國各地養(yǎng)豬場廣泛出現(xiàn)的高致病性豬藍(lán)耳病變異毒株、2010年白俄羅斯出現(xiàn)的“麗娜”基因Ⅲ型新型變異PRRSV毒株，均導(dǎo)致了40%的仔豬發(fā)熱死亡[10-11]。此外，在PRRSV傳播途徑的相關(guān)研究中表明，PRRSV的自然感染宿主豬、帶毒豬、公豬精液和污染器具均可傳播PRRSV。并且，三帶喙庫蚊也可傳播或攜帶PRRSV，其他在動物體內(nèi)還發(fā)現(xiàn)了PRRSV[12]。本研究以此為切入點，針對來源于豬場家鼠和同一豬場感染豬的PRRSV基因開展遺傳特征分析，初步探討小型嚙齒類媒介動物在PRRSV傳播中的特點和作用，為初步評價環(huán)境中動物性生物媒介機械傳播PRRSV的潛在風(fēng)險提供依據(jù)，這對提高動物健康水平具有重要的現(xiàn)實意義。

從PRRSV的起源分析，感染鼠類的小鼠乳酸脫氫酶病毒(Llactic dehydrogenase virus，LDV) 突變后成為LDV變異體，感染野豬后成為PRRSV的前體，經(jīng)過若干年的進(jìn)化成為能夠感染豬的PRRSV，因此PRRSV有可能在鼠類體內(nèi)復(fù)制[13]?；诖它c推測，不同物種PRRSV細(xì)胞特異性受體的情況，表明不同物種的唾液酸受體(Sn)和CD163受體沒有嚴(yán)格的宿主特異性，而且豬Sn與人和鼠Sn的同源性分別為78 %和69 %，說明鼠Sn和人Sn具備結(jié)合PRRSV的能力，進(jìn)一步證實了不同物種Sn具有介導(dǎo)PRRSV進(jìn)入細(xì)胞的可能性[14]。結(jié)合上述研究，本試驗捕捉了豬場家鼠，在其腸道糞便中檢測到了PRRSV的基因。測序分析結(jié)果顯示，從進(jìn)化樹的關(guān)系來看來源于家鼠的PRRSV與來源于豬的PRRSV同屬美洲群分支，且與高致病性PRRSV毒株同源關(guān)系最近。但來源于家鼠的PRRSV NSP2、ORF5、NSP9、NSP10基因與來源于同一豬場感染豬的PRRSV以及其他PRRSV代表株氨基酸之間存在不同程度的變異，有多個氨基酸位點的替換和缺失。初步認(rèn)為PRRSV雖然與鼠乳酸脫氫酶病毒(LDV)具有較近的遺傳關(guān)系，但在長期進(jìn)化的過程中鼠并沒有成為PRRSV的感染宿主，所以PRRSV在家鼠非易感宿主體內(nèi)復(fù)制過程中產(chǎn)生了不同程度的變異，當(dāng)然也不能排除PCR擴增過程中的錯配現(xiàn)象。另外，本研究對豬場PRRSV陽性的豬淋巴組織采用RT-PCR方法分別擴增出了PRRSV的NSP2、ORF5、NSP9、NSP10基因，然而卻采用套式PCR從鼠腸道糞便中檢測到了PRRSVNSP2、ORF5、NSP9、NSP10基因。套式PCR本身是一種特異性高、靈敏性好的檢測方法，檢測病毒量可達(dá)到ng，比常規(guī)PCR靈敏度高100倍[15]。綜上一步說明，雖然鼠Sn和豬Sn具有較高的同源性，但家鼠不是PRRSV的生物宿主，PRRSV在非豬宿主體內(nèi)增殖復(fù)制力有限，導(dǎo)致病毒載量不高。

蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)是在二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上按照一定的空間結(jié)構(gòu)進(jìn)一步盤繞折疊形成的特征三維結(jié)構(gòu)。本研究對來源于家鼠和同一豬場感染豬樣本中PRRSV兩者之間變異較多的NSP10基因所編碼蛋白的理化特性和三維結(jié)構(gòu)進(jìn)一步分析，結(jié)果顯示來源于家鼠和豬的PRRSV NSP10 3D結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)域在組成上具有非常高的相似性。但位于Loop環(huán)的115-133位氨基酸的RMSD值是3.32，由此說明豬源和鼠源PRRSV NSP10蛋白的Loop區(qū)存在較大的結(jié)構(gòu)組成差異，并且兩者ATP結(jié)合位點的Gln252氨基酸的骨架原子Cα的原子距離是6.64?，表明來源于家鼠和豬的PRRSV NSP10蛋白ATP區(qū)的Gln252間也存在較大的空間位置差異。Loop環(huán)突變是某些疾病早期診斷的重要指標(biāo)，而Gln252是組成ATP結(jié)合位點的主要氨基酸[16]，這些差異是否會影響Gln252參與ATP的合成以及PRRSV生物學(xué)特性仍需要進(jìn)一步研究。

任何生命都編碼解旋酶，而編碼解旋酶的基因具有相同起源。解旋酶與許多生物代謝過程有關(guān)，細(xì)胞可通過調(diào)控解旋酶來復(fù)制遺傳物質(zhì)，如病原體在細(xì)胞核中的復(fù)制等。PRRSV的NSP10具有解旋酶的特點。鼠、豬的生物內(nèi)環(huán)境對解旋酶是否具有不同的調(diào)控特點，是否可能影響PRRSV 的復(fù)制，這些具體調(diào)控機制還需要后續(xù)進(jìn)一步深入研究。此外，相關(guān)研究表明，HP-PRRSV的致病性和毒力與NSP9、NSP10具有相關(guān)性[17-18]。而在本研究中PRRSV基因序列中NSP9、NSP10的氨基酸存在不同程度的突變，這些突變是否會影響NSP9、NSP10毒力還不清楚，因為我們未曾從家鼠腸道糞便中分離出PRRSV驗證PRRSV致病性的特點，但本研究結(jié)果是對媒介動物攜帶的PRRSV相關(guān)生物學(xué)特性研究的進(jìn)一步補充。此外，課題組對多種媒介動物源PRRSV基因的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，來源于其他物種的PRRSV基因的突變主要集中于結(jié)構(gòu)域的功能位點(數(shù)據(jù)整理中，未發(fā)表)。家鼠雖然不是PRRSV的天然感染宿主，但家鼠能夠攜帶PRRSV，PRRSV在家鼠體內(nèi)產(chǎn)生的基因、氨基酸的突變、缺失是否會使PRRSV的生物學(xué)特性發(fā)生改變，并且這種PRRSV基因在自然環(huán)境、媒介動物體內(nèi)的變異一旦整合鼠類等小型嚙齒動物攜帶并傳播病原的特性，是否會給公共衛(wèi)生安全帶來潛在危害，是值得進(jìn)一步思考的問題。