魏家陽，李 麗，王國康，徐英英，曾 哲，羅青平，邵華斌，溫國元，商 雨*，潘茲書

(1.武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430072；2.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽細(xì)菌病防治制劑創(chuàng)制重點實驗室，畜禽病原微生物學(xué)湖北重點實驗室，湖北武漢 430064)

新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)是一種以禽類作為宿主的RNA病毒，其基因組為單股、負(fù)鏈、不分節(jié)段的RNA[1]。NDV按照毒力可以分為強(qiáng)毒株、中等毒力毒株和弱毒株。弱毒力毒株可在家禽體內(nèi)有限復(fù)制，并能刺激系統(tǒng)免疫反應(yīng)，可開發(fā)為活疫苗應(yīng)用于新城疫的防控。隨著反向遺傳學(xué)技術(shù)的發(fā)展，體外操作NDV的基因組很容易實現(xiàn)，NDV被開發(fā)成載體應(yīng)用于基因工程疫苗的研究。以NDV為載體開發(fā)基因工程疫苗有很多優(yōu)勢：①安全性高，NDV在宿主的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)復(fù)制，且病毒的生活周期中不會出現(xiàn)DNA，因此，病毒的基因組與宿主基因組重組的概率極低；②生產(chǎn)成本低，NDV可在雞胚內(nèi)增殖很高的滴度；③免疫方式多樣，可以采用滴鼻、點眼、噴霧和飲水等多種方式免疫；④免疫保護(hù)效果好，NDV可以刺激機(jī)體產(chǎn)生多種免疫反應(yīng)，包括體液免疫、細(xì)胞免疫和黏膜免疫；⑤遺傳穩(wěn)定性好，多個研究表明外源基因的插入不影響NDV的穩(wěn)定性，而且多代次傳代后的病毒能很好地表達(dá)外源基因。因此，在NDV反向遺傳學(xué)平臺被建立以來，大量的基因工程疫苗被研究和評估[2-3]。另外，由于NDV具有嚴(yán)格的宿主限制性，能夠進(jìn)入大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞(包括人類細(xì)胞)以及腫瘤細(xì)胞，但不能在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，同時哺乳動物(包括人類)不存在針對NDV的預(yù)先免疫，因此，NDV可應(yīng)用于預(yù)防哺乳動物傳染病或治療人類的相關(guān)疾病[4]。

常用于疫苗載體的NDV包含LaSota、Clone-30和TS09-C等弱毒株[5-7]。以NDV中等毒力毒株BC株和弱毒株LaSota株為載體，構(gòu)建表達(dá)人副流感病毒3型(Human parainfluenza virus type 3,HPIV3)HN蛋白的重組新城疫病毒NDV-BC/HN和NDV-LS/HN；感染DF-1細(xì)胞24 h，其中NDV-BC/HN的HPIV3HN mRNA表達(dá)水平明顯高于NDV-LS/HN或野生型HPIV3；動物試驗結(jié)果顯示，NDV-BC /HN免疫效果較好，誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體水平高于NDV-LS/HN組[8]。以上結(jié)果表明，中等毒力的NDV為載體構(gòu)建的重組NDV可以快速和高效表達(dá)外源蛋白，刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫反應(yīng)。另外，隨著外源基因的插入，病毒基因組的增大，病毒的復(fù)制效率降低，以弱毒株為載體的重組病毒感染能力進(jìn)一步下降，從而影響到免疫效果[9]。因此，為了提高NDV載體疫苗的免疫效果，可以嘗試更多以中等毒力NDV為基礎(chǔ)的載體疫苗的研發(fā)。

本研究以NDV Mukteswar中等毒力株為研究對象，構(gòu)建了該毒株的反向遺傳學(xué)操作平臺并拯救出了Mukteswar株病毒，對該病毒的生物學(xué)特性進(jìn)行了測定。NDV Mukteswar株反向遺傳學(xué)平臺的建立，可為研制高效表達(dá)外源病原體免疫蛋白的新城疫載體疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 病毒基因組提取試劑盒，Axygen公司產(chǎn)品；2×Phanta Max Master Mix (Dye Plus)、2×RapidTaqMaster Mix、反轉(zhuǎn)錄試劑盒，南京諾唯贊生物科技股份有限公司產(chǎn)品；DpnI、In-Fusion HD Cloning Kit，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；膠回收試劑盒和質(zhì)粒抽提試劑盒，美國Omega公司產(chǎn)品；無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒、胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基，賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司產(chǎn)品；FITC標(biāo)記的羊抗雞IgG抗體，北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 儀器設(shè)備 PCR儀，美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)，上海勤翔科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，武漢市方正儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；雞胚孵化機(jī)，山東德州利民孵化機(jī)研制中心產(chǎn)品；CO2培養(yǎng)箱，美國SHEL-LAB公司產(chǎn)品；倒置熒光顯微鏡，日本Olympus公司產(chǎn)品。

1.1.3 細(xì)胞、病毒和質(zhì)粒、雞胚 大腸埃希氏菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；BHK-21細(xì)胞、重組牛痘病毒(vTF7-3)、NDVMukteswar株尿囊液、pACNR-T7載體，輔助質(zhì)粒pcDNA-L、pVAX-NP、pVAX-P質(zhì)粒，由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽細(xì)菌病防治制劑創(chuàng)制重點實驗室構(gòu)建并保存；SPF雞胚購自北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 NDV Mukteswar株基因組的提取和cDNA的制備 取200 μL NDV Mukteswar株病毒尿囊液，按照病毒基因組提取試劑盒說明書進(jìn)行病毒RNA提取，提取的RNA用30 μL無RNA酶水洗脫。再按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的步驟，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，凍存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 NDV Mukteswar株全長cDNA克隆的構(gòu)建 以NCBI上公布的NDV Mukteswar株的序列(GenBank登錄號為：JF950509.1)為參考，設(shè)計9對引物(A1-F&A1-R～A9-F&A9-R)(表1)，相鄰的擴(kuò)增片段間設(shè)計有30 bp～50 bp的重疊序列，第1個片段的上游引物和第9個片段的下游引物帶有15bp的載體錨定序列。以Mukteswar株cDNA為模板，擴(kuò)增9個小片段A1-A9，以A1、A2和A3的PCR回收產(chǎn)物為模板，A1-F和A3-R為引物，通過Overlap PCR的方法獲取融合片段B1，融合片段B2和B3以相同的方法獲得。另設(shè)計了一對引物(V-T7F，V-T7R)用于載體線性化。首先通過In-Fusion無縫克隆的方式，將融合片段克隆至pACNR-T7中，獲得質(zhì)粒pACNR-B1，經(jīng)酶切鑒定和測序正確后，依次將融合片段B2和B3插入載體質(zhì)粒中，最終獲得全長克隆cDNA質(zhì)粒pAC-Mukteswar(圖1)。

圖1 NDVMukteswar株感染性克隆的構(gòu)建策略

表1 構(gòu)建過程中所用的引物

1.2.3 Mukteswar株病毒的拯救 將生長狀態(tài)良好的BHK-21細(xì)胞傳代至6孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時，感染0.01 MOI的表達(dá)T7 RNA聚合酶重組牛痘病毒。感染2 h后，將pAC-Mukteswar質(zhì)粒與3個輔助質(zhì)粒(pVAX-NP、pVAX-P和pcDNA-L)按照質(zhì)量比例4∶1∶1∶2共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，轉(zhuǎn)染6 h后，PBS洗滌細(xì)胞2次，加入含有0.01 g/mL雙抗和0.2 μg/mL TPCK-胰酶的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)96 h～120 h，收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，反復(fù)凍融3次，用0.22 μm孔徑的濾器過濾，接種9日齡～10日齡SPF雞胚，每枚200 μL，培養(yǎng)4 d～5 d，收集雞胚尿囊液。測定其血凝(Hemagglutinin，HA)效價，對HA陽性樣品進(jìn)行RT-PCR檢測及測序鑒定。鑒定正確的病毒尿囊液命名為rMukteswar。在SPF雞胚上傳3代后，分裝保存于-80℃。

1.2.4 間接免疫熒光檢測 將BHK-21細(xì)胞傳至96孔板，待細(xì)胞密度達(dá)到約80%時，接種病毒尿囊液。感染72 h后棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌3次，以40 mL/L多聚甲醛固定細(xì)胞30 min；用PBS洗滌3次，5 mL/L Triton X-100 (PBS配置) 處理室溫20 min，PBS洗3次；用30 g/L BSA封閉細(xì)胞1 h，封閉后用PBS洗3次；以NDV陽性血清為一抗，以FITC標(biāo)記的羊抗雞IgG抗體為二抗進(jìn)行間接免疫熒光試驗，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.2.5 病毒生物學(xué)特性的鑒定

1.2.5.1 雞胚半數(shù)感染量(EID50) 將rMukteswar和野生Mukteswar株病毒尿囊液進(jìn)行10倍梯度稀釋，10-6～10-9稀釋度分別接種3枚9日齡SPF雞胚，每枚0.1 mL，培養(yǎng)4 d，收集雞胚尿囊液。測定其血凝效價。記錄結(jié)果，根據(jù)Reed-Maench方法計算病毒的EID50。

1.2.5.2 50%細(xì)胞感染量(TCID50) 將重組rMukteswar和野生Mukteswar株病毒尿囊液進(jìn)行10倍梯度稀釋，每個稀釋度接種BHK-21細(xì)胞(96孔板)，設(shè)置3個重復(fù)孔，0.1 mL/每孔。37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)120 h后，通過間接免疫熒光試驗判定病毒感染情況，記錄結(jié)果，根據(jù)Reed-Maench方法計算病毒的滴度。

1.2.5.3 生長曲線 將重組rMukteswar和野生Mukteswar株以0.01 MOI接種于鋪有BHK-21細(xì)胞的12孔板中，于感染后12、24、36、48、60、72、84、96 h收取細(xì)胞培養(yǎng)上清，測定其TCID50，繪制病毒的生長曲線。

1.2.5.4 最小致死劑量的平均致死時間(MDT) 將病毒液進(jìn)行10倍梯度稀釋，10-7、10-8、10-9、10-10、10-11共5個稀釋度各接種5枚9日齡雞胚，0.1 mL/枚。37℃培養(yǎng)，連續(xù)觀察7 d，記錄各個雞胚的死亡時間。7 d后，將所有活胚冷卻，檢測HA效價，HA大于27判定為陽性，否則判定為陰性。按照公式計算最小致死量的平均致死時間。

MDT=(在x小時死亡胚數(shù))×x小時+(在y小時死亡胚數(shù))×y小時/死亡總胚數(shù)

1.2.5.5 1日齡雛雞的腦內(nèi)致病指數(shù)(ICPI) 將重組rMukteswar和野生Mukteswar株病毒尿囊液用滅菌生理鹽水稀釋，分別以顱內(nèi)接種的方式接種10只1日齡SPF雛雞，每只50 μL。另取10只接種50 μL滅菌生理鹽水作為對照，每天觀察記錄雞群健康情況，并對試驗雞進(jìn)行評定：正常的記0分，發(fā)病的記1分，死亡的記2分，連續(xù)觀察8 d，最后按公式求出ICPI。

2 結(jié)果

2.1 NDV Mukteswar株全長質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

通過RT-PCR獲得Mukteswar株基因組的9個片段(圖2)，用重疊PCR獲得3個融合片段B1、B2、B3(圖3)。用In-Fusion克隆方式，將3個融合片段依次克隆至pACNR-T7載體質(zhì)粒中，獲得全長質(zhì)粒pAC-Mukteswar，用限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ進(jìn)行酶切鑒定(圖4)，酶切條帶與預(yù)期大小11 797 bp、3 857 bp和2 162 bp相符。將酶切鑒定結(jié)果正確的質(zhì)粒送往公司測序，結(jié)果序列正確，證明全長質(zhì)粒pAC-Mukteswar構(gòu)建成功。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1～9.Mukteswar株基因組片段

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000；1～3.融合片段B1～B3

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 15 000；1～2.pAC-Mukteswar質(zhì)粒

2.2 rMukteswar株全長質(zhì)粒的拯救與鑒定

將構(gòu)建成功的Mukteswar株全長質(zhì)粒pAC-Mukteswar與實驗室構(gòu)建保存的輔助質(zhì)粒pVAX-NP、pVAX-P和pcDNA-L共轉(zhuǎn)染至BHK-21細(xì)胞，培養(yǎng)4 d后，反復(fù)凍融3次，接種9日齡SPF雞胚，培養(yǎng)4 d～5 d，選擇HA陽性的尿囊液進(jìn)行病毒RNA的提取，RT-PCR檢測及測序分析均與預(yù)期相符，表明rMukteswar拯救成功。將鑒定正確的病毒感染BHK-21細(xì)胞后，利用間接免疫熒光檢測病毒(圖5)，感染病毒的BHK-21細(xì)胞可以觀察到綠色熒光，對照組未檢測到熒光信號。

A.rMukteswar感染的BHK-21細(xì)胞；B.陰性對照

2.3 rMukteswar株病毒的生物學(xué)特性

為了比較rMukteswar株病毒與野毒株的生物學(xué)特性與毒力差異，對兩株病毒的雞胚增殖滴度、細(xì)胞生長曲線和毒力進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示rMukteswar株病毒在雞胚中增殖的病毒含量為109.63EID50/mL(表2)，感染BHK-21細(xì)胞后在72 h達(dá)到平臺期，滴度為107.63TCID50/mL(圖6)，與野毒株的增殖特性相似。毒力指標(biāo)檢測結(jié)果顯示rMukteswar株的MDT為56 h，略大于野毒株，ICPI為1.42，符合中等毒力的特征。

表2 rMukteswar株病毒的特性與毒力指標(biāo)

圖6 rMukteswar株在BHK-21細(xì)胞的生長曲線

3 討論

NDV作為一種安全高效的病毒載體，可開發(fā)成用于動物疫病防控的多聯(lián)多價基因工程疫苗。目前應(yīng)用于載體開發(fā)的NDV多為弱毒力毒株，如LaSota、TS09-C等。由于外源基因的插入，病毒基因組的增大，在感染細(xì)胞內(nèi)基因組的復(fù)制效率降低。以弱毒株為載體表達(dá)外源基因，將導(dǎo)致病毒的毒力會進(jìn)一步降低，最終影響免疫效果。另外，NDV特異性母源抗體(maternal derived antibody，MDA)的存在會降低新城疫載體疫苗的效力，研究表明，新城疫疫苗對含有MDA的商業(yè)雞的免疫效果較差[10]。為了克服病毒毒力下降和MDA干擾導(dǎo)致的免疫效果不佳的問題，學(xué)者們探索了不同的解決方案，包括構(gòu)建嵌合病毒、增加免疫劑量、多次免疫、利用細(xì)胞因子刺激恢復(fù)B細(xì)胞的免疫應(yīng)答，或者使用復(fù)制能力更強(qiáng)的疫苗株[11-12]。NDV中等毒力毒株復(fù)制能力較強(qiáng)，可引起禽類全身感染，通常比低毒力毒株具有更強(qiáng)的免疫原性[13]。本研究以NDV中等毒力株Mukteswar株作為研究對象，構(gòu)建其反向遺傳操作平臺，將為后續(xù)開發(fā)更高效的基因工程疫苗奠定基礎(chǔ)。

Mukteswar株作為中等毒力活疫苗，在國內(nèi)廣泛應(yīng)用，可在接種后3 d內(nèi)迅速產(chǎn)生保護(hù)作用，并可維持1年以上的免疫保護(hù)[14]，表明Mukteswar株是開發(fā)基因工程疫苗的理想載體。本研究首先構(gòu)建rMukteswar株的基因組cDNA克隆pAC-Mukteswar，并將其與3個輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到預(yù)感染vTF7-3的BHK-21細(xì)胞，成功獲得子代重組病毒rMukteswar。重組病毒rMukteswar株與親本Mukteswar株具有相似的粒徑大小、形態(tài)結(jié)構(gòu)、雞胚增殖滴度和生長曲線。MDT和ICPI測定結(jié)果表明重組病毒rMukteswar株與親本Mukteswar株對雞胚和雛雞的致病性無顯著差異，且均屬于中等毒力毒株的范疇。

綜上所述，本研究利用反向遺傳操作技術(shù)建立了新城疫中等毒力疫苗株Mukteswar的反向操作系統(tǒng)，后期可將rMukteswar株開發(fā)為減毒活疫苗以及表達(dá)外源病原體免疫原性蛋白的疫苗載體，以期獲得外源蛋白高效率的表達(dá)系統(tǒng)，提高NDV載體疫苗的免疫原性和保護(hù)效果，為安全高效的NDV載體疫苗的研發(fā)和廣泛應(yīng)用提供支撐。