楊 陽，周協(xié)琛，李 濤，李 炎，曹俊陽，趙 蕊

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，黑龍江大慶 163319)

潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis，UC)是一種癥狀極為隱匿且容易復(fù)發(fā)的炎癥性腸道疾病，臨床治愈難度大[1]。UC可分為急性發(fā)病和慢性緩解兩個(gè)時(shí)期。UC在急性期可使患者腹部出現(xiàn)強(qiáng)烈疼痛感并伴隨反復(fù)腹瀉及便血現(xiàn)象[2]。目前臨床治療UC的藥物主要包括氨基水楊酸鹽、硫嘌呤及鈣調(diào)磷酸酶抑制劑等[3]。但對于大部分患者而言，常規(guī)療法并不能夠完全控制疾病且往往存在不耐受、原發(fā)性無反應(yīng)等問題，因此需要進(jìn)一步研發(fā)以實(shí)現(xiàn)對UC的充分治療。在臨床研究過程中，理想的UC動(dòng)物模型對于闡明UC的病因、發(fā)病機(jī)制以及開發(fā)有效治療藥物至關(guān)重要。目前，研究人員已開發(fā)出化學(xué)誘導(dǎo)、自發(fā)突變、過繼性T細(xì)胞轉(zhuǎn)移、微生物誘發(fā)等多種建立UC動(dòng)物模型的方法[4]。其中化學(xué)誘導(dǎo)疾病模型因其造模成本低、可控性好等多種優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用。

葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate，DSS)是化學(xué)誘導(dǎo)方法中最常使用的試劑。在建模過程中，給予DSS的動(dòng)物表現(xiàn)出體重減輕、腹瀉、直腸出血的跡象且病灶部位與人類相似，因而可模擬UC的臨床過程[5]。DSS誘導(dǎo)UC模型的有效性取決于多個(gè)因素，包括DSS濃度、給藥的持續(xù)時(shí)間和頻率、DSS的分子質(zhì)量、動(dòng)物的品系等[6]。通過調(diào)整給藥濃度和給藥頻率，DSS可對小鼠、SD大鼠、兔、豬等多種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物建立急性、慢性和復(fù)發(fā)性腸道炎癥模型[7]。C57BL/6、Balb/c等近交系小鼠因遺傳背景穩(wěn)定且對DSS敏感，常用于建立UC模型。但近交系小鼠存在體重小、生長速度緩慢、生活力弱的缺點(diǎn)[8]。昆明小鼠是一種源自瑞士白化鼠的外繁殖小鼠品系，在中國各地被廣泛用作實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，具有生長速度快、適應(yīng)力強(qiáng)、抗病性高等優(yōu)點(diǎn)[9]。目前針對昆明小鼠品系建立UC模型的方法尚未見詳細(xì)報(bào)道。本研究用DSS構(gòu)建昆明雄鼠急性UC模型并對DSS的最佳濃度進(jìn)行探索，為UC動(dòng)物模型的建立提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 32只SPF級雄性昆明小鼠，18 g～22 g，4周齡，由長春醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 主要試劑 葡聚糖硫酸鈉，MP公司產(chǎn)品；100 mL/L中性福爾馬林固定液，Solarbio公司產(chǎn)品；二甲苯，阿拉丁公司產(chǎn)品；無水乙醇，天津大茂公司產(chǎn)品；石蠟，Leica公司產(chǎn)品；伊紅、蘇木精，Biosharp公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 H20-MA-T型超純水分離系統(tǒng)，Sartorius公司產(chǎn)品；AL204型精密稱量天平，Mettler Toledo公司產(chǎn)品；RM2235型切片機(jī)，Leica公司產(chǎn)品；DKB-501A型超級恒溫水浴鍋，上海葉拓公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 急性UC模型的制備 SPF級環(huán)境下，給予小鼠充足的糧和水，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，將32只小鼠均分為空白組和30、40、50 g/L DSS組，確保各組小鼠體重平均值基本相同。按照質(zhì)量體積比將DSS添加到高壓蒸氣滅菌的飲用水中至所需的最終濃度。稱取3 g DSS粉末，充分溶解于100 mL無菌水中，即得30 g/L DSS溶液。40 g/L DSS、50 g/L DSS配置方法同上。DSS溶液均現(xiàn)用現(xiàn)配。適應(yīng)期結(jié)束后，各組小鼠按照每只每天5 g糧、每只每天5 mL水的方式定量飼喂，期間對照組自由飲用無菌水，剩余3組設(shè)置不同濃度的DSS水溶液供自由飲用。此外，為保證DSS藥效，需每隔2 d重新配置DSS液。在第7天對所有小鼠斷食處理24 h，并于第8天處死各組小鼠(圖1)。

圖1 DSS誘導(dǎo)小鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎模型示意圖

1.2.2 表觀差異檢測 每天稱量各組小鼠的體重并觀察腹瀉和便血情況。根據(jù)小鼠體質(zhì)量變化情況、腹瀉情況及便血情況這3項(xiàng)指標(biāo)，及時(shí)統(tǒng)計(jì)疾病活動(dòng)指數(shù)(disease active index，DAI)評分。根據(jù)以往文獻(xiàn)對DAI評分規(guī)則進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化[10]。具體評分細(xì)則為：若小鼠體質(zhì)量下降小于1%，無腹瀉，無便血，則每項(xiàng)分值為0分；若小鼠體質(zhì)量下降5%，糞便為軟顆粒，糞便潛血，則每項(xiàng)分值為1分；若小鼠體質(zhì)量下降在5%～10%，糞便為黏附在肛門上非常軟的顆粒，視覺顆粒性出血，則每項(xiàng)分值為2分；若小鼠體質(zhì)量下降在10%～15%，糞便為濕軟、深紅色呈溪流狀的長便，肛周處有血液，則每項(xiàng)給與3分；若小鼠體質(zhì)量下降大于15%，腹瀉，大出血，則每項(xiàng)分值為4分。最終DAI分值=(體質(zhì)量下降分值+腹瀉情況分值+便血情況分值)/ 3。

1.2.3 結(jié)腸病理切片觀察 處死各試驗(yàn)組小鼠，無菌條件下開腹取樣。剪取各組小鼠盲腸至肛門處的腸道組織，測量該腸段長度。每只小鼠取1 cm左右的遠(yuǎn)端結(jié)腸組織并用生理鹽水將內(nèi)容物沖洗干凈，然后依次按照固定、脫水、透明、浸蠟、包埋的程序制備石蠟組織塊，具體操作步驟如下。①固定:事先準(zhǔn)備好100 mL/L福爾馬林溶液，將修剪過的結(jié)腸組織放在其中24 h，然后置于燒杯內(nèi)流水沖洗6 h。②脫水：按照700、800、900、950 mL/L乙醇、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ各級浸泡2 h的方式對結(jié)腸組織樣品進(jìn)行梯度脫水。③透明:將脫水的結(jié)腸組織轉(zhuǎn)移到無水乙醇和二甲苯的混合溶液中，浸泡過夜后轉(zhuǎn)移到二甲苯溶液中，浸泡2 h后更換新的二甲苯溶液，再次浸泡2 h。④浸蠟：將透明后的結(jié)腸樣本在已熔好的二甲苯和純蠟混合溶液、純蠟溶液Ⅰ、純蠟溶液Ⅱ中各浸泡2 h以使結(jié)腸組織充分浸蠟。⑤包埋：將結(jié)腸組織垂直立于金屬包埋模具中，倒蠟并放上組織包埋盒，及時(shí)補(bǔ)蠟，待蠟完全凝固脫模后即得石蠟組織塊。

修剪蠟塊并將組織塊切成若干張約7 μm的石蠟切片。組織片于42℃水浴鍋中展至平整無褶皺后，用載玻片撈片。將載玻片置于50℃烘箱內(nèi)烘烤2 h以去除殘留水分。依次按照脫蠟、復(fù)水、染色、脫水、封片的程序?qū)M織進(jìn)行染色。①脫蠟：將載玻片置于二甲苯溶液Ⅰ中浸泡10 min，隨后將其取出轉(zhuǎn)移至二甲苯溶液Ⅱ，浸泡10 min。②復(fù)水：載玻片依次在1000、950、900、800、700 mL/L乙醇溶液中浸泡10 min。③染色：使用蘇木精避光染色4 min，置于流水中沖洗3 min；再用10 mL/L 鹽酸醇溶液分化10 s，再次流水沖洗3 min；然后用10 mL/L氨水返藍(lán)10 s，用流水沖洗3 min；最后用伊紅復(fù)染3 min。④脫水:將載玻片分別在900 mL/L、950 mL/L、無水乙醇Ⅰ和無水乙醇Ⅱ中浸泡2 min，然后分別在二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中浸泡2 min。⑤密封:在切片中加入中性膠，然后加入蓋玻片。用鑷子輕輕按壓蓋玻片以驅(qū)趕氣泡。觀察結(jié)腸組織形態(tài)，根據(jù)潰瘍部位、炎癥浸潤程度及上皮細(xì)胞變化情況3項(xiàng)指標(biāo)予以評分。具體評分細(xì)則如下：黏膜無潰瘍、無炎癥、上皮細(xì)胞正常，每項(xiàng)得分為0分；黏膜局部潰瘍、隱窩周圍炎癥浸潤、杯狀細(xì)胞缺失，每項(xiàng)得分為1分；黏膜大面積潰瘍、浸炎癥潤至黏膜下層、杯狀細(xì)胞大面積缺失，每項(xiàng)得分為2分；黏膜下層潰瘍、炎癥浸潤至黏膜基底層、隱窩缺失，每項(xiàng)得分為3分；黏膜透壁性潰瘍、透壁性炎癥浸潤、隱窩大面積缺失并出現(xiàn)息肉，每項(xiàng)得分為4分。最終病理組織學(xué)指數(shù)(Histopathological index，HI)得分為3項(xiàng)分?jǐn)?shù)的平均值[11]。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。用GraphPad Prism 8及Origin繪圖，圖中#表示和空白組相比P<0.05，##表示P<0.01，###表示P<0.001。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度DSS對小鼠體重的影響

與體重穩(wěn)定增加的空白組相比，30 g/L DSS的體質(zhì)變化率在第5天開始出現(xiàn)顯著性差異，40 g/L DSS和50 g/L DSS組小鼠的體質(zhì)變化率在第4天開始出現(xiàn)顯著性差異，且較30 g/L DSS組體重下降幅度更大(圖2)。表明DSS處理以劑量依賴性方式顯著降低小鼠的體重。

圖2 不同濃度DSS對小鼠體質(zhì)量變化率的影響

2.2 不同濃度DSS對小鼠腹瀉情況的影響

自由飲用滅菌蒸餾水的小鼠糞便干燥致密，色澤較深，整體形態(tài)呈顆粒狀，試驗(yàn)期間無腹瀉情況發(fā)生。與空白組相比，30 g/L DSS組小鼠的糞便略為濕潤，表面可見少量黏液附著，質(zhì)地疏松，黏度及硬度有所下降，整體形態(tài)不完整，糞便顏色略變淺且可見斑駁紅色血跡。40 g/L DSS組小鼠的糞便質(zhì)地濕軟松散，整體呈黏液樣且易黏附于肛門上，糞便顏色進(jìn)一步變淺，血跡明顯，腹瀉情況更為嚴(yán)重(圖3)。50 g/L DSS組小鼠糞便呈棕黃色稀血便，腹瀉最嚴(yán)重。表明自由飲用DSS可引起小鼠不同程度的腹瀉，且腹瀉程度與DSS濃度呈正相關(guān)。

A.空白組；B.30 g/L DSS；C.40 g/L DSS；D.50 g/L DSS

2.3 不同濃度DSS對小鼠便血情況的影響

空白組小鼠肛門形態(tài)完好，無泛紅、腫漲等炎癥表現(xiàn)，肛周無血跡(圖4)。與空白組相比，DSS處理組均出現(xiàn)不同程度的肛門紅腫及便血的現(xiàn)象。其中40 g/L DSS組有明顯的肛門腫脹和便血，50 g/L DSS組最嚴(yán)重。排便時(shí)可見肛門直腸脫垂，肛門內(nèi)有大量血液殘留。表明不同濃度的DSS以劑量依賴的方式影響小鼠糞便中的血液程度。

A.空白組；B.30 g/L DSS；C.40 g/L DSS；D.50 g/L DSS

2.4 不同濃度DSS對小鼠DAI指數(shù)的影響

根據(jù)體質(zhì)量下降情況、腹瀉情況及便血情況計(jì)算得到DAI指數(shù)(圖5)。在造模期間，空白組小鼠一直處于健康狀態(tài)，DAI指數(shù)為0。與空白組相比，不同濃度DSS處理后的小鼠DAI指數(shù)均顯著升高，且相比于30 g/L DSS組、40 g/L DSS及50 g/L DSS組小鼠DAI指數(shù)更高，表現(xiàn)出更明顯的急性UC的特征。

圖5 不同濃度DSS對小鼠DAI指數(shù)的影響

2.5 不同濃度DSS對小鼠結(jié)腸長度的影響

空白組小鼠結(jié)腸內(nèi)糞便呈顆粒狀，結(jié)腸無充血、水腫等炎癥表現(xiàn)；30 g/L DSS組結(jié)腸縮短(圖6)，結(jié)腸內(nèi)糞便濕軟呈溪流狀；40 g/L DSS組小鼠結(jié)腸縮短更加明顯，部分潰瘍表面可見壞死組織；50 g/L DSS組小鼠結(jié)腸表面出現(xiàn)明顯彌漫性水腫、潰瘍等結(jié)腸病變，結(jié)腸萎縮最為嚴(yán)重。DSS以劑量依賴性方式顯著誘導(dǎo)小鼠UC樣結(jié)腸病變。

圖6 不同濃度DSS對小鼠腸道長度的影響

2.6 不同濃度DSS對小鼠結(jié)腸組織形態(tài)的影響

空白組小鼠隱窩結(jié)構(gòu)正常，杯狀細(xì)胞豐富，腸黏膜完整，黏膜下層、肌層以及漿膜層均無炎癥浸潤現(xiàn)象(圖7)。與空白組相比，不同濃度DSS均在不同程度上破壞了結(jié)腸組織形態(tài)。30 g/L DSS組小鼠結(jié)腸組織病變情況相對較輕，結(jié)腸黏膜形態(tài)并未嚴(yán)重受損，基本保持完整；40 g/L DSS組結(jié)腸組織病變嚴(yán)重，炎性細(xì)胞已浸潤至黏膜下層和漿膜層，黏膜層幾乎完全脫落，隱窩和上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本消失；50 g/L DSS組較40 g/L DSS組病變更為嚴(yán)重。

A.空白組；B.30 g/L DSS；C.40 g/L DSS；D.50 g/L DSS

2.7 不同濃度DSS對小鼠HI指數(shù)的影響

不同濃度DSS處理組HI 指數(shù)均與空白組差異顯著(圖8)，且40 g/L DSS和50 g/L DSS組小鼠的HI指數(shù)較30 g/L DSS組更高，這表明40 g/L DSS和50 g/L DSS組小鼠結(jié)腸損傷更為嚴(yán)重。表明不同濃度均可對小鼠結(jié)腸組織造成損傷，但30 g/L DSS組小鼠結(jié)腸炎癥較輕，不具備明顯的急性UC的特征，而40 g/L DSS組與50 g/L DSS組小鼠結(jié)腸病變嚴(yán)重，表現(xiàn)出明顯的急性UC的特征。

圖8 不同濃度DSS對小鼠HI指數(shù)的影響

3 討論

UC是由多種因素引起的慢性炎癥性腸道疾病[12]。UC動(dòng)物模型是探究UC發(fā)病機(jī)制及評估藥物療效的基礎(chǔ)，目前已開發(fā)出免疫造模法、化學(xué)誘導(dǎo)法等多種具有類似于UC特征的結(jié)腸炎動(dòng)物模型。UC的免疫造模法主要有結(jié)腸黏膜組織致敏法、胎鼠結(jié)腸種植法及致敏物質(zhì)造模法。其中結(jié)腸黏膜組織致敏需要收集動(dòng)物或人體的新鮮結(jié)腸黏膜組織，在制成勻漿的組織中加入弗氏佐劑，乳化后取0.1 mL～0.3 mL注射于大鼠足跖內(nèi)[13]。第1次注射后10 d進(jìn)行第2次注射，17 d后背部進(jìn)行第3次注射，24 d后腹股溝進(jìn)行第4次注射，31 d后將組織勻漿注入腹腔進(jìn)行最后注射。該模型需要充分研磨結(jié)核菌和乳化弗氏佐劑，操作復(fù)雜且重復(fù)性差，目前已很少使用。胎鼠結(jié)腸種植法是在成年鼠的腎包膜下移植同系胎鼠的結(jié)腸，使鼠發(fā)生宿主抗移植免疫反應(yīng)從而建立UC模型的方法。具體操作為：戊巴比妥鈉腹腔麻醉成年大鼠，在成年鼠右腎包膜下無菌移植從受孕14 d～18 d的孕鼠中取出的3 cm～4 cm胎鼠結(jié)腸。21 d后，剖檢動(dòng)物，宿主小鼠結(jié)腸黏膜出現(xiàn)大面積潰瘍，胎鼠結(jié)腸黏膜腺嚴(yán)重萎縮，伴有單核細(xì)胞浸潤和纖維結(jié)締組織增生。胎鼠結(jié)腸植入模型與慢性UC的臨床癥狀有許多相似之處，但其試驗(yàn)周期長，成功率低，因此適用于慢性炎癥和特異性藥物篩選[14]。致敏物質(zhì)的方法是用致敏化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎的方法。二硝基氯苯是一種常用的致敏化學(xué)試劑，可用作半抗原與組織蛋白結(jié)合，引發(fā)T細(xì)胞依賴性免疫反應(yīng)，從而誘發(fā)UC[15]。用二硝基氯苯構(gòu)建UC模時(shí)，需先在動(dòng)物背部及腹部皮膚涂擦二硝基氯苯液，待動(dòng)物對其致敏后即在腸道內(nèi)滴注二硝基氯苯液以激發(fā)腸黏膜的炎癥反應(yīng)。二硝基氯苯模型具有可重復(fù)性且結(jié)腸病理改變與人類UC相似，但由于腸內(nèi)滴注二硝基氯苯液對手法要求較高，目前應(yīng)用較少。

化學(xué)建模法是利用化學(xué)物質(zhì)對腸黏膜的刺激作用建立UC模型。用于建立UC模型的化學(xué)物質(zhì)包括角叉菜膠、葡聚糖硫酸鈉、乙酸、三硝基苯磺酸等[16]。最為常用的UC模型是化學(xué)誘導(dǎo)的腸道炎癥模型。而在各種化學(xué)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型中，DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型因其簡單性、可控性以及與人類UC的高度相似性而被廣泛使用。DSS是一種水溶性的帶負(fù)電荷的硫酸鹽多糖，由氯磺酸和葡聚糖的酯化反應(yīng)形成。研究表明，DSS誘導(dǎo)小鼠UC的機(jī)制與其對結(jié)腸上皮細(xì)胞的毒性有關(guān)[17]。DSS攜帶由硫酸基團(tuán)貢獻(xiàn)的高度負(fù)電荷，帶負(fù)電荷的DSS可通過排斥力破壞帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜，誘導(dǎo)侵蝕結(jié)腸上皮，增加了結(jié)腸上皮的通透性，并最終損害了結(jié)腸黏膜的完整性。此外，DSS因其抗凝血的特性也可進(jìn)一步加劇了腸道出血的癥狀，最終誘使小鼠表現(xiàn)出人類UC的特征。

DSS的分子質(zhì)量可影響DSS的誘導(dǎo)效果，目前市面上DSS的分子質(zhì)量分別為4 ku～6 ku、36 ku～50 ku及40 ku～60 ku。由于低分子質(zhì)量DSS的炎性作用較弱，而高分子量DSS在體內(nèi)吸收較困難，因此本研究選用36 ku～50 ku的DSS建立小鼠UC模型。UC模型有急性、慢性之分。急性UC模型通常由高濃度DSS誘導(dǎo)，DSS濃度通常為3%～5%，給藥周期集中在7 d～10 d；慢性UC模型使用低濃度DSS長期刺激動(dòng)物，DSS的濃度通常為1%～3%，給藥期可達(dá)50 d～60 d[18]。急性UC模型典型的組織學(xué)改變主要表現(xiàn)為上皮糜爛、杯狀細(xì)胞耗竭及炎性細(xì)胞的大量浸潤。然而，慢性UC模型通常有其他組織學(xué)改變，如隱窩膿腫、直腸黏膜鱗狀上皮化生、腺瘤樣病變等。李蘭珍等[19]通過讓大鼠自由飲用20 g/L DSS 7 d，隨后自由飲用無菌水14 d，連續(xù)3個(gè)周期后成功建立了Wistar大鼠慢性UC模型。為探討參苓白術(shù)散對UC的干預(yù)作用，馬琪等[20]對雄性Balb/c小鼠連續(xù)7 d給予35 g/L DSS，成功建立了Balb/c小鼠急性UC模型。由此可知，改變DSS的給藥頻率及給藥濃度可以誘使小鼠表現(xiàn)出不同時(shí)期的UC特征。

本研究用36 ku～50 ku DSS自由飲用7 d的方式誘發(fā)急性結(jié)腸炎，并設(shè)置30、40、50 g/L 3個(gè)DSS濃度梯度，以探究建立昆明小鼠UC模型的最佳DSS濃度。結(jié)果表明，30、40、50 g/L DSS均可使小鼠出現(xiàn)不同程度的體重下降、腹瀉、便血等疾病狀態(tài)，顯著升高DAI 指數(shù)。但從結(jié)腸組織形態(tài)來看，30 g/L DSS組小鼠有輕度結(jié)腸炎，不具有明顯的急性UC特征。而與30 g/L DSS組相比，40 g/L DSS與50 g/L DSS組小鼠均表現(xiàn)出急性UC的特征，且50 g/L DSS組比40 g/L DSS組炎癥更為強(qiáng)烈。在試驗(yàn)過程中50 g/L DSS組小鼠死亡數(shù)量較多，因此本試驗(yàn)認(rèn)為40 g/L DSS為小鼠急性結(jié)腸炎最佳建模濃度。