周俊輝，鐘巍，奚高原，王鵬浩

河南省胸科醫(yī)院 鄭州大學(xué)附屬胸科醫(yī)院麻醉科，鄭州 450000

單肺通氣（OLV）在胸外科手術(shù)中應(yīng)用廣泛，但其易引起非通氣側(cè)肺的機(jī)械性損傷及缺血再灌注損傷，從而導(dǎo)致肺損傷的發(fā)生，影響患者預(yù)后。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，OLV期間通過纖維支氣管鏡對(duì)非通氣側(cè)肺選擇性地給予5 L/min氧氣輸送可增加患者氧合而不影響手術(shù)視野，即為無呼吸性氣流通氣（AOI），亦稱為非通氣側(cè)肺持續(xù)給氧［1］。研究顯示，在不施加通氣壓力的情況下，提供非通氣側(cè)肺AOI可有效改善患者術(shù)中氧合狀態(tài)，預(yù)防低氧血癥的發(fā)生且不中斷手術(shù)、不妨礙術(shù)野，從而為胸外科手術(shù)期間提供更好的手術(shù)條件［2］。然而，AOI在減輕非通氣側(cè)肺損傷中的可能機(jī)制仍未可知。本研究擬探討AOI對(duì)行OLV胸腔鏡下肺癌根治術(shù)的患者非通氣側(cè)肺損傷的改善作用及其機(jī)制，以期為AOI在OLV中的應(yīng)用提供理論支持。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 經(jīng)河南省胸科醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)［倫理批號(hào)：（2018）倫申第（12-08）］，選擇2019年3月—2020年5月本院收治的擇期行胸腔鏡下肺癌根治術(shù)患者?；谛厍荤R下肺癌根治術(shù)患者肺損傷評(píng)分經(jīng)干預(yù)后下降約50%［3］的假設(shè)計(jì)算樣本量，參數(shù)設(shè)定為雙側(cè)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)=0.05、檢驗(yàn)效能=0.9，失訪率15%，則共需要受試者60例。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡40～65歲，體質(zhì)量40.0～80.0 kg，身高150.0～180.0 cm，美國(guó)麻醉醫(yī)師協(xié)會(huì)（ASA）分級(jí)Ⅱ～Ⅲ級(jí)，血液動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定，對(duì)研究過程知情并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：存在全身性感染、慢性肺部疾病、懷孕、腎臟疾病、影響四肢功能的外周動(dòng)脈疾病、復(fù)雜性冠心病、復(fù)雜高血壓、先天性心臟瓣膜病、術(shù)前中風(fēng)，入院期間發(fā)生過心臟驟停。將符合標(biāo)準(zhǔn)的60例患者使用計(jì)算機(jī)生成隨機(jī)數(shù)序列，按照1∶1的比例隨機(jī)分配到AOI組及對(duì)照組，每組30例。對(duì)照組男15例、女15例，年齡（51.7 ± 7.5）歲，BMI（23.8 ± 3.1）kg/m2，ASA分級(jí)Ⅱ級(jí)19例、Ⅲ級(jí)11例，術(shù)前一秒用力呼氣容積（FEV1）/用力肺活量（FVC）76.7% ± 5.5%，術(shù)前動(dòng)脈血氧分壓（PaO2）為（88.6 ± 5.9）mmHg，術(shù)前動(dòng)脈二氧化碳分壓（PaCO2）為（41.6 ± 3.4）mmHg，OLV部位左肺18例、右肺12例，OLV時(shí)長(zhǎng)（127.7 ± 21.8）min，雙肺通氣時(shí)長(zhǎng)（66.8 ± 14.9）min，手術(shù)總時(shí)長(zhǎng)（163.5 ±28.6）min，麻醉總時(shí)長(zhǎng)（181.4 ± 31.3）min，失血量（347.6 ± 68.9）mL，液體入量（1 452.6 ± 234.8）mL；AOI組男16例、女14例，年齡（50.6 ± 8.0）歲，BMI（24.0 ± 3.2）kg/m2，ASA分級(jí)Ⅱ級(jí)17例、Ⅲ級(jí)13例，術(shù)前FEV1/FVC 77.5% ± 5.8%，術(shù)前PaO2（90.1 ±5.6）mmHg，術(shù)前PaCO2（42.0 ± 3.6）mmHg，OLV部位左肺19例、右肺11例，OLV時(shí)長(zhǎng)（130.4 ± 22.5）min，雙肺通氣時(shí)長(zhǎng)（68.3 ± 16.1）min，手術(shù)總時(shí)長(zhǎng)（165.7 ±27.3）min，麻醉總時(shí)長(zhǎng)（183.5 ± 33.8）min，失血量（350.2 ± 70.5）mL，液體入量（1 462.6 ± 244.7）mL。兩組患者性別、年齡、BMI、ASA分級(jí)、術(shù)前FEV1/FVC、術(shù)前PaO2、術(shù)前PaCO2、OLV 時(shí)長(zhǎng)等一般資料均具有可比性（P均＞0.05）。

1.2 手術(shù)麻醉及肺部通氣方法 所有患者均由同一組胸外科醫(yī)師團(tuán)隊(duì)通過標(biāo)準(zhǔn)后外側(cè)視頻輔助胸腔鏡行肺癌根治術(shù)，術(shù)中仔細(xì)游離癌變肺葉的血管和支氣管，清掃系統(tǒng)淋巴結(jié)。麻醉方法：患者進(jìn)入手術(shù)室后吸氧，監(jiān)護(hù)心電圖、腦電雙頻譜指數(shù)（BIS）及血氧飽和度。建立上外周靜脈輸液通路，輸注醋酸鈉林格液。2 mg咪達(dá)唑侖進(jìn)行預(yù)處理，依托咪酯進(jìn)行麻醉誘導(dǎo)，羅庫溴銨進(jìn)行肌肉松弛，用可視雙腔氣管管進(jìn)行氣管插管，機(jī)械通氣，丙泊酚、七氟醚、羅庫溴銨及瑞芬太尼維持。術(shù)中通氣維持在6 mL/kg+5 cm呼氣末正壓通氣（PEEP），目標(biāo)為將氣道峰值壓力控制在30 cm H2O以下，以呼吸頻率進(jìn)行容量或壓力控制通氣，使PaCO2保持在30～45 mmgHg。OLV開始即刻，給予AOI組患者非通氣側(cè)肺5 L/min氧氣的持續(xù)性通氣，對(duì)照組患者非通氣側(cè)肺不給予持續(xù)性通氣。術(shù)畢時(shí)行超聲引導(dǎo)下胸椎旁神經(jīng)阻滯，靜脈推注舒更葡糖鈉注射液2 mg/kg以拮抗羅庫溴銨。當(dāng)符合麻醉醫(yī)師評(píng)估的拔除氣管導(dǎo)管標(biāo)準(zhǔn)時(shí)進(jìn)行拔管?；颊邭夤軐?dǎo)管拔除后均被送入麻醉后監(jiān)護(hù)室（PACU）以接受后續(xù)診療。

1.3 動(dòng)脈氧合參數(shù)檢測(cè) 分別在麻醉誘導(dǎo)后即刻（T0）、OLV 后 30 min（T1）、OLV 后 1 h（T2）及 OLV 后2 h（T3），用含有肝素的注射器采集患者橈動(dòng)脈血液，將動(dòng)脈血樣立即注入血?dú)夥治鲈嚬苤?，采用SIEMENS RAPIDPoint 500血?dú)夥治鰞x（德國(guó)西門子公司）進(jìn)行血?dú)夥治觯瑴y(cè)量氧合參數(shù)PaO2和PaCO2。

1.4 肺組織損傷情況觀察 采用HE染色。手術(shù)結(jié)束時(shí)留取已切除肺腫瘤周圍正常的肺組織，置入4%甲醛溶液24 h進(jìn)行標(biāo)本固定，乙醇脫水，石蠟包埋，將組織切成厚度5 μm的切片，中性樹脂密封。將切片轉(zhuǎn)移到載玻片上，使用試劑盒進(jìn)行HE染色，SZ51光鏡（日本Olympus公司）觀察肺組織病理學(xué)變化。肺組織損傷的評(píng)分為水腫、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、出血、細(xì)支氣管上皮脫屑和透明膜形成，0分表示沒有或非常輕微、1分表示中等和有限、2分表示中等、3分表示廣泛或突出、4分表示廣泛和最突出，各項(xiàng)相加累計(jì)總分即為肺損傷評(píng)分［4］。

1.5 肺組織細(xì)胞凋亡情況觀察 采用TUNEL法。使用TUNEL細(xì)胞凋亡測(cè)定試劑盒（德國(guó)Roche公司）試劑盒檢測(cè)和量化細(xì)胞凋亡，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。高倍鏡（×400）下對(duì)患者的10個(gè)隨機(jī)肺組織切片進(jìn)行分析，出現(xiàn)凋亡的細(xì)胞胞核為褐色，將TUNEL陽性細(xì)胞百分比表示為細(xì)胞凋亡指數(shù)。

1.6 肺組織細(xì)胞凋亡及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè)采用Western blotting法。取各組肺組織，提取總蛋白質(zhì)，通過二辛可寧酸蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)試每種蛋白質(zhì)樣品濃度。對(duì)50 μg蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行凝膠電泳，在20 V下跨膜1 h至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。一抗封閉采用5%脫脂牛奶，將細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白B淋巴細(xì)胞瘤2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）一抗，自噬相關(guān)蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1一抗（美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司）及GAPDH一抗（美國(guó)Cell Signaling Technology公司）稀釋為1∶1 000及1∶2 000，4 ℃下孵育過夜。將二抗即辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔抗體稀釋為1∶10 000，將PVDF膜加入二抗，室溫下孵育1 h，PVDF膜顯影、定影。采用Image J 2.1軟件對(duì)上述蛋白表達(dá)進(jìn)行半定量分析，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白與GAPDH蛋白灰度值的比值，作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 術(shù)后不良事件發(fā)生情況觀察 記錄術(shù)后3 d內(nèi)患者發(fā)生的不良事件，包括呼吸抑制（呼吸頻率＜12次/分）、竇性心動(dòng)過緩（心率＜50次/分）、竇性心動(dòng)過速（心率＞100次/分）、低血壓（收縮壓相對(duì)基線降低20%）、高血壓（收縮壓相對(duì)基線升高20%）及惡心嘔吐。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料采用Shapiro-Wilk進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較行t檢驗(yàn)，組內(nèi)不同時(shí)點(diǎn)比較采用重復(fù)測(cè)量的方差分析；非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，組間比較行χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組不同時(shí)點(diǎn)氧合參數(shù)比較 見表1。

表1 兩組不同時(shí)點(diǎn)PaO2、PaCO2比較（mmHg，±s）

注：與同組T0時(shí)點(diǎn)比較，*P＜0.05；與對(duì)照組同時(shí)點(diǎn)比較，#P＜0.05。

組別對(duì)照組T0 T1 T2 T3 AOI組T0 T1 T2 T3 n 30 30 PaO2 311.2 ± 40.7 88.7 ± 20.5*97.8 ± 23.3*91.7 ± 20.8*310.5 ± 41.6 125.4 ± 33.1*#187.5 ± 43.5*#193.6 ± 45.7*#PaCO2 36.3 ± 3.7 44.4 ± 4.1*44.9 ± 3.7*44.5 ± 3.6*37.1 ± 3.3 41.2 ± 3.5*#40.2 ± 4.4*#42.3 ± 3.5*#

2.2 兩組肺組織損傷情況比較 HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組肺泡腫脹，壁厚，其內(nèi)可見滲液，可觀察到嚴(yán)重的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；AOI組較對(duì)照組肺泡水腫液滲出減少，肺間質(zhì)增厚和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)均明顯改善。見OSID碼圖1。對(duì)照組、AOI組肺損傷評(píng)分分別為（8.6 ± 1.2）、（4.2 ± 0.8）分，AOI組肺損傷評(píng)分低于對(duì)照組（P＜0.05）。

2.3 兩組細(xì)胞凋亡指數(shù)比較 對(duì)照組、AOI組細(xì)胞凋亡指數(shù)分別為21.5% ± 7.4%、9.3% ± 3.1%，AOI組細(xì)胞凋亡指數(shù)低于對(duì)照組（P＜0.05）。

2.4 兩組細(xì)胞凋亡及自噬相關(guān)蛋白比較 見表2、3。

表2 兩組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05。

組別對(duì)照組AOI組n 30 30 Bcl-2 0.46 ± 0.06 0.70 ± 0.12*Bax 0.69 ± 0.11 0.51 ± 0.07*Bcl-2/Bax 0.69 ± 0.12 1.23 ± 0.19*

表3 兩組細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白比較（±s）

表3 兩組細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05。

組別對(duì)照組AOI組n 30 30 Beclin-1 0.79 ± 0.16 0.54 ± 0.11*LC3-Ⅰ0.43 ± 0.08 0.66 ± 0.11*LC3-Ⅱ0.74 ± 0.15 0.52 ± 0.10*LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ1.40 ± 0.22 0.91 ± 0.14*

2.5 兩組術(shù)后不良事件發(fā)生情況比較 對(duì)照組術(shù)后1例發(fā)生呼吸抑制、2例發(fā)生竇性心動(dòng)過緩、3例發(fā)生竇性心動(dòng)過速、2例發(fā)生高血壓、1例發(fā)生低血壓、1例發(fā)生口干、1例有惡心及嘔吐；AOI組術(shù)后2例發(fā)生呼吸抑制、3例發(fā)生竇性心動(dòng)過緩、4例發(fā)生竇性心動(dòng)過速、4例發(fā)生高血壓、2例發(fā)生低血壓、2例發(fā)生口干、無惡心嘔吐發(fā)生，兩組術(shù)后不良事件發(fā)生情況比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均＞0.05）。

3 討論

OLV是一種麻醉管理技術(shù)，可在胸科手術(shù)中提供極大的幫助。由于其特殊性和專業(yè)性，在操作中需要有關(guān)氣道管理、維持氣體交換和預(yù)防急性肺損傷的特定技能和知識(shí)，而保持足夠的氣體交換和減少急性肺損傷可能是一個(gè)矛盾的過程［5］。OLV開始后，非通氣側(cè)肺不再供應(yīng)空氣或氧氣，然而該側(cè)肺的血供仍然正常運(yùn)作，從而會(huì)導(dǎo)致肺內(nèi)分流率（Qs/Qt）顯著增大［6］。評(píng)估呼吸窘迫的嚴(yán)重程度一直是判斷肺功能的重要臨床手段，用于評(píng)估肺部疾病嚴(yán)重程度及其對(duì)氧合影響的各種客觀測(cè)量指標(biāo)有許多種，常用的參數(shù)有PaO2與氧吸入濃度（FiO2）比及肺泡小動(dòng)脈氧差（A-aDO2）等。在FiO2和其他呼吸參數(shù)不變的情況下，OLV開始后A-aDO2逐漸增大，PaO2則逐漸降低。本研究結(jié)果顯示，OLV開始后對(duì)照組及AOI組氧合狀態(tài)均下降，而AOI組的氧合狀態(tài)高于對(duì)照組，提示患者AOI可改善患者呼吸窘迫狀態(tài)，對(duì)肺功能起到保護(hù)作用。PaCO2在臨床上常用于判斷呼吸衰竭類型、是否出現(xiàn)呼吸性酸堿平衡失調(diào)、代謝性酸堿失調(diào)的代償反應(yīng)及肺泡通氣情況。本研究結(jié)果顯示，與OLV開始后不給予AOI相比，給予AOI可降低術(shù)中不同時(shí)點(diǎn)的PaCO2，提示AOI可減少OLV時(shí)因通氣不足引起的CO2蓄積，避免出現(xiàn)呼吸性酸堿失衡。

AOI技術(shù)是在不通氣的一側(cè)肺通過纖維支氣管鏡給予流速為5 L/min的持續(xù)性給氧，可顯著改善患者的氧合功能，但不影響手術(shù)操作。目前，AOI已成功應(yīng)用于硬質(zhì)支氣管鏡檢查、內(nèi)窺鏡檢查和氣管內(nèi)插管。然而有部分觀點(diǎn)認(rèn)為，AOI在OLV中并無有效作用，其原因?yàn)榉伪┞队诖髿鈮合挛莸揭欢ǔ潭群髿獾谰蜁?huì)關(guān)閉［7］。但本研究團(tuán)隊(duì)在前期研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)肺充滿氧氣時(shí)，未通氣的肺會(huì)緩慢塌陷，缺氧性肺血管收縮進(jìn)展緩慢，因此，AOI可能有助于預(yù)防肺組織缺氧并可增加OLV期間的PaO2［8］。本研究結(jié)果同樣提示，AOI在OLV中可以改善非通氣側(cè)肺的肺組織損傷，從而起到積極的作用。

本研究根據(jù)吳唐靜等［9］提供的研究方法，在可視化操作下對(duì)非通氣側(cè)肺持續(xù)輸注5 L/min的氧氣，即在OLV期間給予AOI。有研究顯示，OLV開始后給予AOI可提升患者的氧合狀態(tài)，使Qs/Qt下降［10］。本研究結(jié)果顯示，AOI組肺損傷評(píng)分較對(duì)照組顯著下降，提示AOI可減輕患者非通氣側(cè)的急性肺損傷。此外，OLV組肺組織病理結(jié)構(gòu)也受到嚴(yán)重影響，提示OLV 2 h可嚴(yán)重影響肺功能，這與以往研究中OLV 1 h可增加肺損傷發(fā)生率是一致的［11］。OLV后再次進(jìn)行通氣的肺暴露于高應(yīng)變，繼發(fā)非生理性潮氣量和正常功能殘氣量的喪失。同時(shí)，再次進(jìn)行通氣的肺可誘發(fā)缺氧/復(fù)氧所致的氧化應(yīng)激反應(yīng)和機(jī)械通氣所引起的毛細(xì)血管剪切應(yīng)力。塌陷肺的手術(shù)操作和/或切除可能會(huì)導(dǎo)致肺損傷。OLV結(jié)束、雙肺通氣開始后，萎陷的肺臟再次膨脹，進(jìn)而誘發(fā)缺血再灌注肺損傷，炎癥因子大量釋放，再次加重肺損傷［8］。本研究從OLV開始即刻給予非通氣側(cè)肺持續(xù)的氧氣通氣，減輕了肺損傷。因此，AOI是一種有效的肺保護(hù)手段。

缺血再灌注通過快速激活免疫系統(tǒng)誘發(fā)炎癥和損傷，肺缺血再灌注損傷的潛在機(jī)制涉及炎癥因子的釋放及其表達(dá)的增加，從而導(dǎo)致肺細(xì)胞凋亡［12］。Bcl-2家族包括抗凋亡基因如Bak、Bcl-2和Bcl-xL以及促凋亡基因如Bad和Bax。Bcl-2家族成員已被證明可以預(yù)防肺上皮細(xì)胞凋亡，Bcl-2可以與Bax結(jié)合形成Bcl-2/Bax異二聚體調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，Bcl-2/Bax的比值決定了缺血性疾病中細(xì)胞的存活率，即當(dāng)Bcl-2占主導(dǎo)地位時(shí)，細(xì)胞可存活［13］。本研究結(jié)果顯示，Bcl-2過表達(dá)減少了細(xì)胞凋亡，同時(shí)也增加了Bcl-2/Bax的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯降低。因此，AOI可能通過抑制細(xì)胞凋亡而減輕肺損傷。

自噬是一種分解代謝的細(xì)胞過程，可以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和存活。肺缺血再灌注后自噬水平升高，細(xì)胞凋亡增加，這已得到廣泛的認(rèn)可。抑制過度自噬可以減輕各種病理?xiàng)l件下的組織損傷，維持中等水平的自噬可能有助于減少缺血再灌注誘導(dǎo)的肺損傷并促進(jìn)體內(nèi)細(xì)胞存活。Beclin-1是自噬啟動(dòng)的標(biāo)志性蛋白之一，其表達(dá)可以預(yù)測(cè)自噬的發(fā)生情況。作為第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的自噬標(biāo)志性蛋白，LC3表達(dá)強(qiáng)弱?？煞从匙允傻膰?yán)重程度。當(dāng)自噬形成時(shí)， LC3-Ⅰ可酶解掉一小段多肽，從而轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)C3-Ⅱ。因此，LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰ比值的大小可估計(jì)自噬水平的高低。本研究探索了LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及Beclin-1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)AOI組Beclin-1蛋白表達(dá)、LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰ較對(duì)照組降低，提示AOI組自噬水平減輕。自噬能夠選擇性降解受損的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)聚集體，而細(xì)胞凋亡則可去除受損或老化的細(xì)胞，因此維持自噬和細(xì)胞凋亡之間的平衡對(duì)于細(xì)胞命運(yùn)至關(guān)重要。本研究結(jié)果顯示，AOI在一定程度上調(diào)節(jié)了肺缺血再灌注引起的細(xì)胞自噬及凋亡之間的平衡紊亂，有益于肺保護(hù)。同時(shí)，本研究中兩組術(shù)后不良事件包括呼吸抑制、竇性心動(dòng)過緩、竇性心動(dòng)過速、高血壓、低血壓、口干、惡心及嘔吐等發(fā)生例數(shù)均較少，且兩組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示AOI應(yīng)用于胸腔鏡下肺癌根治術(shù)患者具有較高的安全性，可在臨床上推廣應(yīng)用。

綜上所述，OLV期間行AOI可改善胸腔鏡下肺癌根治術(shù)患者非通氣側(cè)肺損傷且安全性良好，該機(jī)制可能與AOI改善肺組織氧合狀態(tài)，抑制細(xì)胞凋亡及自噬有關(guān)。本研究尚存在如下局限性∶首先，樣本量偏小，證據(jù)等級(jí)相對(duì)較低；其次，出于安全考慮，本研究排除了患有嚴(yán)重肺部疾病的患者，而納入易受OLV影響患者的研究設(shè)計(jì)可能更適合本研究的假設(shè)；最后，非通氣側(cè)肺AOI可減輕患者非通氣側(cè)肺損傷的作用機(jī)制可能有多種，故需要進(jìn)一步的研究去探討。