陳博，談金強(qiáng) ，祝和成，張峰，劉強(qiáng)

1 濟(jì)南市第四人民醫(yī)院心內(nèi)科 濟(jì)南市心血管病研究所，濟(jì)南 250031；2 濟(jì)南市濟(jì)陽(yáng)區(qū)人民醫(yī)院心內(nèi)科；3 濟(jì)南市第四人民醫(yī)院心臟與大血管外科

心外膜脂肪組織（EAT）具有重要的代謝功能，是炎癥因子的重要來(lái)源，與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化存在密切聯(lián)系［1-2］。既往研究發(fā)現(xiàn)，EAT厚度與急性心肌梗死患者冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度存在相關(guān)性［3］。近期，有研究通過(guò)多層螺旋CT評(píng)估冠狀動(dòng)脈斑塊及EAT體積，發(fā)現(xiàn)EAT體積與易損斑塊（VP）存在相關(guān)性［4］。但受限于分辨率，多層螺旋CT對(duì)VP的識(shí)別可能存在一定局限性。EAT可產(chǎn)生白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、IL-6等炎癥因子，IL-1β是炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子，與多種心血管疾病相關(guān)［5-7］。炎癥是動(dòng)脈粥樣硬化的重要致病機(jī)制，外周循環(huán)和EAT局部的IL-1β都可能會(huì)影響粥樣斑塊的穩(wěn)定性，但目前還沒(méi)有明確結(jié)論。因此，本研究擬探討EAT厚度及其組織中IL-1β與冠狀動(dòng)脈VP的相關(guān)性?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 經(jīng)濟(jì)南市第四人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批（批準(zhǔn)號(hào)LL-20210006），選取2017年12月—2019年11月我院收治的不穩(wěn)定型心絞痛患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：接受冠狀動(dòng)脈造影和冠狀動(dòng)脈血管內(nèi)超聲（IVUS）檢查確診為冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。唤邮軗衿诠跔顒?dòng)脈旁路移植術(shù)；患者簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并急性心肌梗死、活動(dòng)性炎癥、既往冠狀動(dòng)脈血運(yùn)重建病史、急性心力衰竭、冠狀動(dòng)脈慢性完全閉塞、心肌病、腫瘤。共收集符合上述條件的冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病患者63例，進(jìn)一步對(duì)患者冠狀動(dòng)脈造影后對(duì)狹窄≥50%的主要血管進(jìn)行IVUS檢查，并進(jìn)行虛擬組織學(xué)分析。VP定義為至少連續(xù)三幀圖像上同時(shí)滿(mǎn)足斑塊負(fù)荷≥50%、壞死核心占斑塊面積比例≥10%、壞死核心表面無(wú)纖維斑塊成分［8］。根據(jù)虛擬組織學(xué)IVUS定義的VP將患者分為VP組24例，非VP組39例。同時(shí)，納入排除冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病需接受換瓣手術(shù)的心臟瓣膜病患者45例作為對(duì)照組。VP組男17例、女7例，年齡（65 ± 10）歲，BMI（24.5 ±3.2）kg/m2，收縮壓（142 ± 31）mmHg、舒張壓（79 ± 13）mmHg，心率（77 ± 14）次/分，高血壓11例，高脂血癥9例，吸煙10例，糖尿病8例，有冠心病家族史10例，總膽固醇（4.81 ± 1.07）mmol/L，高密度脂蛋白（1.15 ±0.19）mmol/L，低密度脂蛋白（2.91 ± 0.89）mmol/L，糖化血紅蛋白6.1% ± 0.8%，左心室射血分?jǐn)?shù)57% ±7%；非VP組男23例、女16例，年齡（68 ± 11）歲，BMI（23.7 ± 3.6）kg/m2，收縮壓（141 ± 25）mmHg、舒張壓（79 ± 11）mmHg，心率（72 ± 17）次/分，高血壓16例，高脂血癥14例，吸煙15例，糖尿病14例，有冠心病家族史14例，總膽固醇（4.64 ± 1.14）mmol/L，高密度脂蛋白（1.28 ± 0.24）mmol/L，低密度脂蛋白（3.08 ±0.90）mmol/L，糖化血紅蛋白5.9% ± 0.9%，左心室射血分?jǐn)?shù)59% ± 8%；對(duì)照組男32例、女13例，年齡（62 ±12）歲，BMI（22.8 ± 3.3）kg/m2，收縮壓（143 ± 29）mmHg、舒張壓（81 ± 20）mmHg，心率（80 ± 15）次/分，高血壓9例，高脂血癥9例，吸煙8例，糖尿病5例，有冠心病家族史10例，總膽固醇（4.86 ± 1.18）mmol/L，高密度脂蛋白（1.23 ± 0.26）mmol/L，低密度脂蛋白（3.0 ± 0.93）mmol/L，糖化血紅蛋白5.7% ± 0.9%，左心室射血分?jǐn)?shù)56% ± 15%。三組年齡、性別、BMI、收縮壓、舒張壓、心率、血脂水平、左心室射血分?jǐn)?shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，高脂血癥、糖尿病、高血壓、吸煙、冠心病家族史等傳統(tǒng)冠心病危險(xiǎn)因素在VP組及非VP組中發(fā)生率高于對(duì)照組（P均＜0.05），VP組與非VP組各臨床資料差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 EAT厚度測(cè)量方法 所有受試者均接受超聲心動(dòng)圖檢查（飛利浦EPIQ-7C），檢查由同一名經(jīng)驗(yàn)豐富的超聲診斷醫(yī)生進(jìn)行，選擇胸骨旁長(zhǎng)軸切面測(cè)量右心室舒張末期游離壁的脂肪厚度［3］。選擇心臟S5-1探頭，頻率為3.5 MHz，深度設(shè)置15 cm。為減少誤差，將感興趣區(qū)放大以便于測(cè)量。連續(xù)測(cè)量3個(gè)心動(dòng)周期的EAT厚度數(shù)值，取平均值。

2.3 血漿IL-1β表達(dá)檢測(cè) 采用ELISA法。采集受試者空腹肘靜脈血，血漿標(biāo)本置于-80 ℃儲(chǔ)存，按照ELISA反應(yīng)試劑盒（武漢谷歌生物科技公司）說(shuō)明書(shū)測(cè)定血漿IL-1β。

2.4 EAT中IL-1β蛋白及mRNA表達(dá)檢測(cè) 開(kāi)胸術(shù)后30 min內(nèi)在患者右冠狀動(dòng)脈近段心外膜區(qū)域取EAT中標(biāo)本，用磷酸鹽緩沖鹽水沖洗標(biāo)本，并在-80 ℃下保存。①I(mǎi)L-1β蛋白表達(dá)：采用免疫組織化學(xué)法。將石蠟包埋的EAT標(biāo)本連續(xù)切片，采用Envision二步法進(jìn)行IL-1β免疫組化染色，一抗為抗IL-1β抗體，二抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體（武漢谷歌生物科技公司）。免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒由武漢谷歌生物科技公司提供，IL-1β蛋白陽(yáng)性表達(dá)為棕黃色或黃色顆粒狀物質(zhì)。②IL-1β mRNA表達(dá)：采用RT-PCR。取EAT標(biāo)本50 μg，采用TRIzol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 45 s、62 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，循環(huán)30次。引物由武漢谷歌生物科技公司合成，IL-1β上游引物5'-TGGGATAACGAGGCTTATGTG-3'，下游引物5'-ATGGAGAACACCACTTGTTGC-3'；GAPDH上游引物5'-CCACGAAACTACCTTCAACTCC -3'，下 游 引 物5'-GGAGCAATGATCTTGATCTTCA-3'。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算IL-1β相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料采用Kolmogorov-Smirnov正態(tài)性檢驗(yàn)驗(yàn)證是否服從正態(tài)分布，以±s表示，兩組數(shù)據(jù)比較行t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析及Bonferroni校正；計(jì)數(shù)資料以例或百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Spearman等級(jí)相關(guān)性分析VP組、非VP組EAT厚度及EAT中IL-1β水平與冠狀動(dòng)脈VP的相關(guān)性，多因素Logistic回歸分析不穩(wěn)定型心絞痛患者發(fā)生VP的影響因素，受試者工作特征（ROC）曲線(xiàn)評(píng)價(jià)EAT厚度對(duì)冠狀動(dòng)脈VP的預(yù)測(cè)價(jià)值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組EAT厚度比較 VP組、非VP組、對(duì)照組EAT 厚度分別為（6.1 ± 1.3）mm、（5.4 ± 1.5）mm、（4.6 ± 1.4）mm，EAT厚度VP組＞非VP組＞對(duì)照組（P均＜0.05）。

2.2 各組血漿IL-1β表達(dá)比較 VP組、非VP組、對(duì)照組血漿IL-1β表達(dá)分別為（0.25 ± 0.24）、（0.25 ±0.35）、（0.24 ± 0.36）pg/dL，三組血漿IL-1β表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 各組EAT中IL-1β蛋白及mRNA表達(dá)比較免疫組化染色顯示，EAT中IL-1β蛋白在VP組表達(dá)最多（OSID碼圖1）。VP組、非VP組、對(duì)照組EAT中IL-1β mRNA表達(dá)分別為6.13 ± 2.14、2.60 ± 0.93、2.09 ± 0.84，IL-1β mRNA表達(dá)VP組＞非VP組、對(duì)照組（P＜0.05）。

2.4 VP組、非VP組EAT厚度及EAT中IL-1β水平與冠狀動(dòng)脈VP的相關(guān)性 Spearman相關(guān)性分析顯示，VP組、非VP組EAT厚度及EAT中IL-1β水平均與冠狀動(dòng)脈VP呈正相關(guān)（r分別為0.34、0.67）。

2.5 不穩(wěn)定型心絞痛患者發(fā)生VP的影響因素 多因素Logistic回歸分析顯示，EAT厚度、EAT中IL-1β水平是不穩(wěn)定型心絞痛患者發(fā)生VP的獨(dú)立影響因素。見(jiàn)表1。

表1 不穩(wěn)定型心絞痛患者發(fā)生VP的多因素Logistic回歸分析結(jié)果

2.6 EAT厚度對(duì)冠狀動(dòng)脈VP的預(yù)測(cè)價(jià)值 ROC曲線(xiàn)分析顯示，EAT厚度預(yù)測(cè)冠狀動(dòng)脈VP的曲線(xiàn)下面積為0.74（95%CI為0.64～0.84）；當(dāng)EAT厚度截?cái)嘀禐?.4 mm時(shí)，預(yù)測(cè)冠狀動(dòng)脈VP的敏感度和特異度分別為95.8%和45.2%。見(jiàn)圖1。

圖1 EAT厚度預(yù)測(cè)冠狀動(dòng)脈VP的ROC曲線(xiàn)

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾?。?］，炎癥參與了動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的各個(gè)階段。炎癥因子可以促進(jìn)斑塊的形成，加快穩(wěn)定斑塊進(jìn)展為不穩(wěn)定斑塊［10-11］。CHOI等［12］對(duì)人體動(dòng)脈粥樣斑塊進(jìn)行了動(dòng)態(tài)隨訪(fǎng)，發(fā)現(xiàn)炎癥參與了VP的形成，而抑制炎癥活動(dòng)可以增加斑塊的穩(wěn)定性；如果相關(guān)的炎癥途徑被選擇性阻斷，斑塊體積會(huì)顯著減小。

斑塊破裂是急性冠脈綜合征最重要的致病機(jī)制。盡管近年來(lái)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的研究取得了很大的進(jìn)展，但斑塊破裂的機(jī)制仍不完全清楚。一種觀(guān)點(diǎn)認(rèn)為，局部炎癥因子可以釋放蛋白酶，抑制纖維帽形成，導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定［13］。本研究結(jié)果顯示，EAT中存在關(guān)鍵炎癥因子IL-1β，且存在VP的患者EAT中IL-1β表達(dá)顯著增加，但I(xiàn)L-1β通過(guò)何種機(jī)制影響斑塊的穩(wěn)定性還尚未可知。既往研究表明，IL-1β基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化嚴(yán)重程度顯著降低［14］。相關(guān)臨床研究也發(fā)現(xiàn)，針對(duì)IL-1β的治療可以改善心肌梗死患者預(yù)后，在標(biāo)準(zhǔn)治療基礎(chǔ)上加用IL-1β單克隆抗體可以將心肌梗死后心血管事件的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)降低15%［15］。因此，IL-1β信號(hào)途徑在VP的形成機(jī)制中可能有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，VP患者EAT中IL-1β表達(dá)增加，支持IL-1β影響斑塊穩(wěn)定性的觀(guān)點(diǎn)。外周循環(huán)中也可以檢測(cè)到IL-1β表達(dá)，但我們的研究發(fā)現(xiàn)外周循環(huán)中IL-1β水平與是否存在冠狀動(dòng)脈VP無(wú)關(guān)。一種可能的解釋是：EAT局部IL-1β表達(dá)增加，可通過(guò)旁分泌形式作用于冠狀動(dòng)脈粥樣斑塊，從而促進(jìn)斑塊不穩(wěn)定。

EAT是包裹在心臟和冠狀動(dòng)脈表面的脂肪組織。在成年人心臟中，EAT覆蓋80%的心臟表面，大部分位于右心室表面。這也是本研究選擇右室游離壁作為超聲心動(dòng)圖測(cè)量部位的原因。EAT和冠狀動(dòng)脈之間有緊密的解剖和功能聯(lián)系，因此兩者間可能存在相互作用［16］。研究發(fā)現(xiàn)，EAT可通過(guò)內(nèi)分泌和旁分泌產(chǎn)生炎癥因子和趨化素，而炎癥反應(yīng)是粥樣斑塊形成、發(fā)展的重要因素，導(dǎo)致斑塊趨向于不穩(wěn)定［17］。本研究結(jié)果顯示，EAT產(chǎn)生的IL-1β可能是影響冠狀動(dòng)脈粥樣斑塊性質(zhì)的一個(gè)重要因素。目前臨床上多采用CT或MRI測(cè)量EAT體積來(lái)探討其與心血管疾病的關(guān)系［17-18］。有研究發(fā)現(xiàn)，血清趨化素水平與EAT體積相關(guān)，可以預(yù)測(cè)患者心血管疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)［17］。對(duì)房顫患者的研究發(fā)現(xiàn)，CT測(cè)量的EAT體積與心房電重構(gòu)、結(jié)構(gòu)重構(gòu)相關(guān)，與房顫發(fā)生及射頻消融術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)［19］。但這兩種檢查效率較低，可重復(fù)性差，難以普遍用于臨床篩查。超聲心動(dòng)圖測(cè)量EAT厚度更為高效、經(jīng)濟(jì)，可進(jìn)行大樣本研究，并且易于動(dòng)態(tài)隨訪(fǎng)觀(guān)察。本研究結(jié)果表明，存在冠狀動(dòng)脈VP的患者EAT厚度顯著增加，并且EAT厚度及EAT中IL-1β水平是VP的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。

本研究存在一定的局限性。首先，冠狀動(dòng)脈VP在臨床上較難界定，血管內(nèi)超聲定義的VP并不完全等同于病理學(xué)定義的VP，但目前血管內(nèi)超聲結(jié)合虛擬組織學(xué)是較為準(zhǔn)確的檢測(cè)VP的方式。其次，這是一項(xiàng)單中心研究，同時(shí)滿(mǎn)足接受血管內(nèi)超聲檢查及外科開(kāi)胸手術(shù)的患者較難收集，因此入選患者數(shù)量有限。未來(lái)需要多中心、大樣本的研究來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證本文的發(fā)現(xiàn)并闡明EAT產(chǎn)生的IL-1β在VP形成中的具體作用機(jī)制。