黃京菊，李諾 ，韋永先，王文艷，覃濤，楊葉桂

1 廣西醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學科，南寧 530005；2 廣西醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院；3 桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學科

心肺復蘇（CPR）后腦損傷是重癥領域的熱點研究方向。大腦在心跳驟停（CA）時失去血氧供給，會引起缺血性損傷；而CPR成功后恢復血氧供給，大腦仍有很大可能遭受缺血再灌注損傷，誘發(fā)神經(jīng)細胞凋亡程序，導致腦損傷的發(fā)生及發(fā)展。細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）是一種重要信號傳遞蛋白，其能將細胞水平的信號從細胞外受體傳遞至細胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)ERK磷酸化水平能夠改變疾病的預后。有研究表明，ERK抑制劑PD98059在CPR動物模型中可降低磷酸化ERK（p-ERK）水平，減少腦組織天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase-3）凋亡蛋白的激活，發(fā)揮神經(jīng)保護作用［1］。茶多酚是提取自綠茶的具有藥物作用的活性成分，能夠降低細胞ERK磷酸化水平，與PD98059相似［2］。有學者發(fā)現(xiàn)茶多酚有抗細胞凋亡作用，其機制與降低Caspase-12和Caspase-3有關［3］，而Caspase-12是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關凋亡信號途徑的關鍵蛋白。據(jù)此，我們推測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關凋亡信號通路可能參與了PD98059在CPR中神經(jīng)保護的機制。2021年1月—2022年6月，本研究觀察了PD98059對大鼠CPR后腦缺血再灌注損傷的改善作用，并分析其機制是否與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關凋亡信號通路ERK/Calpain-2/Caspase-12有關?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量190～230 g，由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK（桂）2014-0002，本實驗所有操作通過廣西醫(yī)科大學動物管理和應用委員會批準，符合動物倫理學標準。PD98059購自德國Sigma公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，兔抗大鼠β-actin抗體購自美國Abcam公司兔抗人鈣蛋白酶2（Calpain-2）抗體購自上海生物科技有限公司，Caspase-12抗體、cleaved Caspase-3抗體購自美國CST公司，抗兔二抗、HRP標記購自美國CST公司。

1.2 動物建模及分組 CA/CPR建模：采用2%戊巴比妥鈉（3 mL/kg）經(jīng)腹腔注射麻醉大鼠，留置經(jīng)口氣管導管連接小型動物呼吸機，分離股動、靜脈，股動脈置管用于監(jiān)測動脈壓，股靜脈置管用于靜脈給藥，記錄標準Ⅱ肢體導聯(lián)心電圖。按CHEN等［4］經(jīng)食道電刺激誘導CA的方法，將起搏電極插入食道約7 cm深度，使用12 V交流電快速起搏誘導CA 60 s。將24只誘導CA大鼠按隨機數(shù)字表法分為對照組及PD98059組各12只，在誘導CA 6 min后啟動CPR，同時將PD98059組及對照組大鼠經(jīng)靜脈分別注射0.3 mg/kg的PD98059及同體積生理鹽水。將余下12只健康大鼠作為假手術組，僅進行手術操作而不行電刺激誘導CA。

1.3 CPR效果評價 記錄大鼠CPR后自主循環(huán)恢復（ROSC）時間、ROSC后24 h大鼠神經(jīng)功能評分（NDS）。ROSC定義為出現(xiàn)室上性節(jié)律（包括竇性、房性或交界性心律）伴有平均動脈壓≥50 mmHg并持續(xù) 5 min以上。根據(jù)簡單行為反應、喚醒水平、顱神經(jīng)反射、肌肉緊張、運動功能、癲癇發(fā)作進行NDS評估，總分0～80分，分數(shù)越低代表神經(jīng)功能損傷越嚴重，腦死亡為0分［5］。

1.4 腦組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關凋亡蛋白檢測 采用Western blotting法。ROSC后24 h經(jīng)腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，快速取大鼠腦組織，分離腦皮質(zhì)組織，提取腦皮質(zhì)組織蛋白，并進行蛋白定量。按照4∶1的比例混合蛋白樣品與緩沖液，沸水浴5 min使蛋白變性，放置室溫冷卻。制膠后，將變性的蛋白加入上樣孔中，設定電泳電壓為80 V，待電泳條帶進入分離膠后將電壓改為120 V；電泳完畢，切下相應的分子量膠片；在轉(zhuǎn)膜、封閉后，分別加入兔抗Caspase-12、cleaved Caspase-3、Calpain-2、β-actin 單克隆一抗，恒溫4 ℃的搖床孵育過夜，用TBST洗滌3次后，加入羊抗兔二抗、HRP標記，孵育 1 h，再次洗滌3次；加入化學發(fā)光劑，應用電化學發(fā)光法檢測目標蛋白，再應用化學發(fā)光檢測系統(tǒng)掃描獲取圖像。以β-actin作為內(nèi)參，運用Gel-Pro Analyzer 分析，測定Caspase-12、cleaved Caspase-3、Calpain-2、條帶的灰度值，以目的蛋白條帶與β-actin條帶灰度值的比值表示Caspase-12、cleaved Caspase-3 、Calpain-2、蛋白相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件。計量資料通過Sample K-S進行正態(tài)檢驗，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較行SNK檢驗，多組數(shù)據(jù)比較行單因素方差分析，方差不齊數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗；計數(shù)資料以例或百分比表示，組間比較行χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PD98059組、對照組大鼠CPR效果比較PD98059組、對照組大鼠ROSC時間分別為（86.10 ±15.84）s、（89.00 ± 13.20）s，ROSC后 24 h NDS分別為（75.60 ± 1.27）、（71.91 ± 1.36）分；PD98059 組ROSC后24 h NDS高于對照組（P＜0.05），兩組ROSC時間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.2 各組大鼠腦組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關凋亡蛋白比較 大鼠腦組織 Caspase-12、cleaved Caspase-3、Calpain-2蛋白表達假手術組＜PD98059組＜對照組（P均＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠腦組織Caspase-12、cleaved Caspase-3、Calpain-2蛋白比較（±s）

表1 各組大鼠腦組織Caspase-12、cleaved Caspase-3、Calpain-2蛋白比較（±s）

注：與假手術組比較，*P＜0.05；與對照組比較，#P＜0.05。

組別假手術組對照組PD98059組n 12 12 12 Caspase-12 0.37 ± 0.01 0.61 ± 0.01*0.44 ± 0.02*#cleaved Caspase-3 0.13 ± 0.02 0.27 ± 0.01*0.21 ± 0.01*#Calpain-2 0.29 ± 0.01 0.39 ± 0.01*0.34 ± 0.02*#

3 討論

機體生理功能的實現(xiàn)依賴蛋白質(zhì)，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白質(zhì)合成、折疊和修飾的重要細胞器。當細胞受到外來負面刺激時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未完成折疊或折疊錯誤的蛋白質(zhì)比例增加，誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。在初期，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激會啟動包括自噬等多種機制，清除非正常形態(tài)的蛋白質(zhì)，以保持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)［6］。當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激程度較大，持續(xù)時間較長時，會誘導凋亡程序啟動致細胞死亡［7］。Caspase-12被認為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導細胞凋亡的關鍵蛋白，其能夠活化Caspase-3，后者裂解DNA引起細胞凋亡［8］。本研究結果顯示，CPR后大鼠腦組織Caspase-12和cleaved Caspase-3水平升高，提示明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)誘發(fā)的凋亡參與腦損傷機制。而PD98059組大鼠腦組織Caspase-12和cleaved Caspase-3水平降低，提示PD98059降低腦組織細胞凋亡的作用可能與減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激有關。

ERK是細胞信號傳導的重要功能蛋白質(zhì)，而且已被證實參與了細胞凋亡的調(diào)控［9］。YANG等［10］發(fā)現(xiàn)，外傷引起的腦損傷模型中，ERK磷酸化表達水平上調(diào)，并且參與了細胞凋亡過程。而XIA等［11］發(fā)現(xiàn)，通過使用高壓氧療法下調(diào)磷酸化ERK蛋白表達可以減輕創(chuàng)傷性腦損傷水平。本研究結果與上述研究結果相似，我們在短暫CA后ROSC的大鼠腦組織中發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關凋亡蛋白表達增加，而使用PD98059降低EKR磷酸化水平后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關凋亡蛋白相應降低，提示PD98059通過抑制p-ERK表達降低了凋亡水平，從而發(fā)揮其神經(jīng)保護作用。但是，有其他腦損傷動物模型和體外細胞研究發(fā)現(xiàn)，抑制ERK信號通路可能會引起腦損傷加重［12］。YANG等［13］研究顯示，局灶缺血腦組織ERK磷酸化水平降低，當腦損傷發(fā)生以后使用藥物提高p-ERK表達可減輕局灶缺血腦組織的損傷。我們認為在不同損傷模型中腦損傷發(fā)生的病理生理機制存在差異，因此，EKR在不同的疾病背景中發(fā)揮的作用不同，而此種現(xiàn)象為后期針對不同種類腦損傷使用不同藥物提供了切實的基礎證據(jù)。

ERK作為信號傳導的關鍵蛋白，本身并不具備激活凋亡程序末位蛋白Caspase-3的能力。前期研究報道了PD98059能夠減輕腦組織Caspase-3的激活水平，但文章尚未闡述凋亡蛋白激活機制［1］。為了完善前期研究結果，提供切實可靠的基礎實驗依據(jù)，對于特定疾病背景下與p-ERK關聯(lián)的下游調(diào)控靶點的探索具有研究價值。體外實驗研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細胞中G蛋白偶聯(lián)的雌激素受體需通過提高ERK磷酸化水平激活Calpain，從而提升自身黏附能力，而使用ERK抑制劑U0126能夠降低該腫瘤細胞黏附能力［14］。該結果提示Calpain是ERK信號通路的下游調(diào)控靶點。

Calpain是細胞內(nèi)依賴鈣離子激活的蛋白酶，其活性與鈣離子濃度正相關。當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激水平過高時，細胞內(nèi)鈣離子升高從而激活Calpain，后者能夠激活位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面的Caspase-12，啟動內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導的細胞凋亡程序。Calpain擁有多個亞基，其中關于Calpain-1及Calpain-2的研究較多。何金玲等［15］研究顯示，Calpain-2參與了機械性心肌細胞損傷的凋亡程序而不是Calpain-1。Calpain-2是一種鈣離子依賴的半胱氨酸蛋白酶，Calpain-2活性增加可通過多種途徑介導細胞凋亡。通過藥物抑制EKR信號通路能夠降低Calpain表達水平，減輕心肌細胞凋亡。另有研究表明，衣霉素通過Calpain-2/Ca2+依賴性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激途徑誘導肝星狀細胞凋亡［16］。XIE等［17］認為，Ca2+依賴 Calpain-2 通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Caspase-12，促進了大鼠肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關的異常凋亡。與既往研究相似，本研究在大鼠CRP后腦缺血再灌注損傷模型中使用PD98059抑制EKR磷酸化水平，發(fā)現(xiàn) Calpain-2、Caspase-12、cleaved Caspase-3表達水平均下調(diào)，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導的細胞凋亡減輕，驗證了我們之前的推測，即PD98059通過抑制ERK/Calpain-2/Caspase-12信號通路降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導的細胞凋亡，從而減輕CPR后大鼠腦缺血再灌注損傷，發(fā)揮腦保護作用。

綜上所述，細胞外調(diào)節(jié)激酶抑制劑PD98059能夠減輕大鼠心肺復蘇后腦缺血再灌注損傷，其機制可能通過抑制ERK/Calpain-2/Caspase-12信號通路，降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導的細胞凋亡實現(xiàn)。