原昆鵬,曲雪婷,孫軍昌,王 旭, 齊昊南,陳淑貞,王冬冬,尹 月 ,臧立鈺,衣玉穎,劉均華,尹燕博,溫建新
(1.青島農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院,山東 青島 266109 ; 2.青島市即墨區(qū)畜牧業(yè)發(fā)展服務中心,山東 青島 266225 ;3.青島博隆實驗動物有限公司,山東 青島 266225 ; 4.青島市農(nóng)業(yè)行政執(zhí)法支隊,山東 青島 266071)
犬細小病毒病是幼犬最危險的傳染病之一,受感染犬臨床特征是嘔吐、發(fā)燒、腹瀉、出血性腸炎、心肌炎和白細胞減少癥[1]。犬細小病毒病是由犬細小病毒(Canine parvovirus,CPV)引起的,CPV屬于細小病毒科,細小病毒屬,是一種無囊膜單股負鏈DNA病毒[2]。CPV全長約5.3 kb,包括2個主要的開放閱讀框(Open reading frame,ORF),1個編碼結(jié)構(gòu)蛋白VP1和VP2,另1個編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2[3]。
CPV于1978年首次被發(fā)現(xiàn),為了與犬微小病毒(Minute virus of canine,MVC)區(qū)分被命名為CPV-2[4]。1979—1981年發(fā)現(xiàn)抗原變異株CPV-2a[5],1984年變異株CPV-2b被發(fā)現(xiàn)[6]。抗原變異株CPV-2c于2000年首次報道[7]。在我國,CPV-2感染于1982年首次被報道[8],CPV-2a于1986年被報道[9],CPV-2b出現(xiàn)于1997年[10],CPV-2c于2010年在吉林省被發(fā)現(xiàn)[11]。近年來,new CPV-2a和new CPV-2b開始在中國流行[12]。目前,new CPV-2a和new CPV-2b似乎已經(jīng)取代了CPV-2a和CPV-2b的原型株,并已成為許多國家的主要流行型[9]。
CPV-2在抗原多樣性方面持續(xù)增加,其進化速度接近每年每個位點10-4個替代[13]。目前,我國寵物臨床CPV防疫多使用進口疫苗,這些進口疫苗均源于原始的CPV-2毒株[14]。本研究從2012—2020年青島地區(qū)使用進口疫苗免疫過的臨床CPV發(fā)病犬中,先后分離到3株CPV,全基因組序列分析發(fā)現(xiàn),與傳統(tǒng)的CPV-2毒株相比,分離毒株已發(fā)生較大變異,這可能是導致CPV臨床免疫失敗的主要原因。
1.1 病料采集 青島市使用進口CPV疫苗免疫過的,臨床癥狀為嘔吐、血樣腹瀉的發(fā)病犬,采集新鮮腸道組織作為分離病毒所用病料,低溫凍存。采集青島市使用進口CPV疫苗免疫過的成年健康犬糞便為健康犬對照樣品。
1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清,均購自Cytiva公司;病毒DNA提取試劑盒(TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0)、DL-2 000 DNA Marker、DL-5 000 DNA Marker、pMD18-T載體(pMDTM18-T Vector Cloning Kit)、DH5α感受態(tài)細胞、PrimeStar HS DNA聚合酶,均購自寶日醫(yī)生物技術(北京)有限公司;快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒,購自康為世紀生物科技有限公司。
1.3 主要儀器 PCR基因擴增儀[TC-96/G/H(b)型],杭州博日公司產(chǎn)品;電泳儀(JY600E型)、核酸電泳槽(JY-SPFT型)、凝膠成像儀(JY04S-3C型),君意東方公司產(chǎn)品。
1.4 樣品處理 將病料與無菌PBS(pH=7.2)按照1∶5比例混合研磨,反復凍融3次后8 000 r/min 高速離心10 min,取上清用0.22 μm濾器過濾除菌,-80 ℃保存。
1.5 病毒分離 采用同步接毒的方式,向傳代后的F81 細胞懸液按1∶9(體積比)接入經(jīng)處理后的樣品,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中,次日用含1%血清的細胞維持液進行換液。每天觀察細胞病變(Cytopathic effect,CPE)情況,傳至出現(xiàn)較穩(wěn)定的 CPE 后收毒,同時設正常 F81 細胞為陰性對照。
1.6 PCR鑒定 按照本實驗室建立的犬細小病毒 PCR 診斷檢測方法[15]對健康犬對照樣品、第3代F81細胞培養(yǎng)物進行PCR鑒定,同時設立陽性對照(本實驗室保存的CPV分離株)和陰性對照(未接種樣品的F81細胞培養(yǎng)物)。通過病毒DNA提取試劑盒提取DNA,以提取后DNA為模板進行PCR擴增。PCR反應體系(25.0 μL):2×Mix 12.5 μL,ddH2O 8.5 μL,模板 2.0 μL,上游引物 1.0 μL,下游引物 1.0 μL。PCR反應程序:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s,共35個循環(huán);72 ℃,10 min。PCR產(chǎn)物4 ℃保存,取PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳,在紫外燈下觀察結(jié)果。
1.7 病毒全基因組分析
1.7.1 全基因組擴增 參照參考文獻[3,16]擴增病毒的全基因組,方法同1.6,并將本實驗室于2012年和2015年分離到的2株病毒(CPV-QD12和CPV-QD15)一同擴增。擴增的DNA產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。陽性PCR產(chǎn)物利用膠回收試劑盒進行膠回收純化后克隆至pMD18-T載體,連接體系:膠回收產(chǎn)物4 μL,SolutionⅠ5 μL,Vector 1 μL,混勻后16 ℃連接過夜。次日將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞中,涂板后挑取單菌落,擴大培養(yǎng)后進行菌液PCR鑒定,陽性菌液送青島睿博生物科技有限公司測序。
1.7.2 全基因組及VP2、NS1序列分析與系統(tǒng)進化樹構(gòu)建 利用DNASTAR進行序列拼接,得到病毒全基因組序列。利用MegAlign軟件對本研究獲得的序列與參考株序列進行同源性分析。通過與GenBank中近幾年發(fā)表的其他CPV序列進行比較,進行全基因組及VP2、NS1核苷酸、氨基酸比對分析,并進行基因分型與氨基酸非同義替代分析。利用MEGA 7鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。
2.1 病毒分離 樣品同步接種F81細胞,盲傳到第3代開始出現(xiàn)典型的CPE,表現(xiàn)為接毒細胞脫落、變形、大范圍的拉網(wǎng)狀病變,陰性對照正常F81細胞生長良好,排列緊密,形狀統(tǒng)一(圖1)。將本研究于2020年分離到的CPV命名為CPV-QD20株。
圖1 光學顯微鏡下細胞形態(tài)(40×)
2.2 PCR鑒定 PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,分離毒株的細胞培養(yǎng)物和陽性對照均與預期相符,在481 bp處出現(xiàn)明亮條帶;細胞陰性對照培養(yǎng)物PCR擴增結(jié)果為陰性(圖2)。
圖2 PCR擴增鑒定
2.3 病毒全基因組擴增 通過PCR對CPV全基因組進行擴增,結(jié)果顯示,在712、2 105、1 728、1 591、635、66和100 bp處出現(xiàn)與預期相符的7個條帶(圖3)。
圖3 全基因組的PCR擴增
2.4 序列分析 序列分析發(fā)現(xiàn),分離獲得的3株CPV的基因組全長為5 055~5 062 bp。3株CPV全基因核苷酸同源性為99.0%~99.8%。NS1基因核苷酸同源性為99.1%~99.3%,氨基酸同源性為99.0%~99.4%。VP2基因核苷酸同源性為99.3%~99.9%,氨基酸同源性為99.7%~100%。3株CPV與參考毒株全基因核苷酸同源性為90.9%~99.8%。
2.5 系統(tǒng)進化樹構(gòu)建 基于全基因組構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹顯示,CPV-QD12株與中國分離株MH476593、MF805798、MF805794親緣關系較近,其中親緣關系最近的是MH476593,核苷酸同源性為99.7%;CPV-QD15株與2017年中國分離株MH476590親緣關系最近,核苷酸同源性為99.9%。CPV-QD20株與MG013488、MH476592、MH476584、MH476583、MH476587處在同一分支,與2017年上海分離株CPV-SH1516核苷酸同源性最高,為99.8%(圖4)。
圖4 基于犬細小病毒全基因組的系統(tǒng)進化樹
2.6VP2、NS1蛋白氨基酸非同義替代分析 對3株CPV分離株編碼VP2蛋白、NS1蛋白的氨基酸序列與參考序列進行對比,氨基酸非同義替代結(jié)果如表1和表2所示。根據(jù)CPV基因分型的相關報道[17],CPV-QD12和CPV-QD15為new CPV-2a型,CPV-QD20為CPV-2c型,健康犬對照樣品檢出CPV-2c型。
表1 VP2蛋白中非同義替代的氨基酸
續(xù)表
表2 NS1蛋白中非同義替代的氨基酸
CPV-2的感染在世界各地非常普遍,本研究進行全基因組測序的3株CPV的基因型分別為new CPV-2a、CPV-2c。CPV-2a、CPV-2b、new CPV-2a、new CPV-2b和CPV-2c在我國均為流行株[9]。近年來,new CPV-2a成為我國部分地區(qū)的主要流行型,CPV-2c除了在我國流行之外,還是意大利、德國、烏拉圭、阿根廷、尼日利亞等國家的主要抗原變異型[18]。全基因組系統(tǒng)進化樹結(jié)果顯示,3株CPV與國外CPV分離株親緣關系較遠,與國內(nèi)參考毒株同源性較高,都處在同一大分支中并沒有形成明顯獨立分支,這說明在青島地區(qū)分離的3株CPV與國內(nèi)其他CPV流行株均源自同一祖先。但是,本研究全基因組測序的3株CPV的基因型,CPV-QD12和CPV-QD15為new CPV-2a型,CPV-QD20為CPV-2c型,健康犬對照樣品也檢出CPV-2c型,均與原始的CPV-2存在差異。本研究分離的CPV-QD20為CPV-2c型,說明青島地區(qū)CPV毒株出現(xiàn)了新的基因型,不排除new CPV-2a型和CPV-2c型同時流行的可能。
VP2蛋白是CPV-2的主要結(jié)構(gòu)蛋白,參與宿主免疫應答,VP2基因的突變可能改變CPV-2的類型、感染和致病性[19]。VP2基因的第5、87、267、300、322、323、324、334、341、370、440、555位氨基酸的突變已被證實與CPV-2的感染和致病性有關[3]。2014年以后的大部分CPV-2c分離株中VP2基因的第5位氨基酸都發(fā)生A→G突變,此處突變可能改變了CPV的抗原性和免疫原性[20]。本研究中3株CPV分離株都出現(xiàn)了第267位氨基酸F→Y突變,第324位氨基酸 Y→I突變。第267位氨基酸F→Y突變可能在傳播和感染中發(fā)揮重要作用[12]。第297位氨基酸S→A突變是new CPV-2a和new CPV-2b的標志[9],本研究的2株new CPV-2a分離株均發(fā)生了該突變。第324位氨基酸 Y→I突變是近幾年來我國CPV分離株常見的氨基酸突變[21]。第370位氨基酸Q→R突變可能與宿主范圍的改變以及宿主紅細胞的血凝有關[20]。第426位的突變被用來區(qū)分CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c[3]。本研究中new CPV-2a 型CPV-QD12株和CPV-QD15株都在第440位出現(xiàn)氨基酸突變(T→A),而CPV2c型CPV-QD20株則未出現(xiàn)此突變。
CPV的非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2與病毒復制相關[22]。亞洲CPV-2c變異株在NS1基因的第60、544、545、630位氨基酸中都表現(xiàn)出特定的改變,這些氨基酸突變可能有助于進一步闡明CPV的進化情況[23],對推斷CPV變異株的傳播是至關重要的[24]。關于CPV非結(jié)構(gòu)基因的研究有限[13],它們的作用需要進一步評估。
本研究中的3株CPV分離株均是從接種過疫苗的臨床發(fā)病犬中分離到的。在我國,CPV的商業(yè)疫苗株大多數(shù)是CPV-2型。接種CPV-2型疫苗可以對免疫動物形成交叉保護,使免疫動物抵抗強毒CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c的攻擊[25-27]。有報道顯示,近年來new CPV-2a成為我國部分地區(qū)的優(yōu)勢變異株[28],CPV-2型疫苗不能保護免疫犬抵抗new CPV-2a和new CPV-2b的攻擊[29]。本研究中的3株CPV分離株分屬new CPV-2a和CPV-2c兩個基因型,與原始CPV-2毒株存在差異。與其他CPV-2c型相比,本研究分離的CPV-20株在VP2基因和NS1基因中均出現(xiàn)了不同的氨基酸非同義替代。上述發(fā)現(xiàn)是否是CPV-2型疫苗免疫失敗的原因有待進一步試驗驗證。
CPV主要經(jīng)糞口傳播,這是幼犬感染的重要原因。本研究從健康犬對照樣品中檢測到CPV-2c型病毒,說明使用進口CPV弱毒活疫苗的成年犬存在排毒問題??梢?,將成年犬與幼犬隔離飼養(yǎng)是保護幼犬的重要措施。本研究認為應該使用CPV流行株研發(fā)滅活疫苗,做加強免疫,防止疫病擴散。CPV進化速度快,作為一種易變異的DNA病毒,在時間、空間和宿主方面對CPV進行持續(xù)的流行病學監(jiān)測能夠及時掌握CPV變異情況,為疾病防控和疫苗株的更新提供參考。