張 黎，鄭龍龍，白 冰，譚 凡，王 辰，呂曉玲，白 瑞，鄭明學(xué)

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801)

山西省太谷區(qū)某蛋雞場57日齡青年雞出現(xiàn)精神萎靡、排番茄樣糞便等臨床癥狀，發(fā)病后3 d死亡率高達30%。剖檢病死雞可見其空腸腫脹變短，漿膜面有多量散在出血點，十二指腸近空腸段漿膜和黏膜出現(xiàn)彌漫性針尖大小出血點，空腸充滿紫黑色血樣內(nèi)容物，黏膜有多量出血斑。鏡檢可見空腸內(nèi)容物有大量紅細(xì)胞和多量裂殖體，盲腸內(nèi)有少量卵囊，糞便中有多量卵囊，疑似感染毒害艾美耳球蟲(Eimerianecatrix,E.necatrix)。本試驗采用飽和食鹽水漂浮法收集被感染病雞的糞便和盲腸內(nèi)容物中卵囊，利用單卵囊技術(shù)分離純化得到1株山西省流行蟲株，檢測其生物學(xué)特點，初步確定其蟲株類型；隨后使用序列特征性擴增區(qū)域(Sequence characterized amplified region,SCAR)標(biāo)記技術(shù)進一步確定蟲株類型。本試驗結(jié)果不僅豐富了山西省E.necatrix流行毒株的生物信息，還為雞球蟲疫苗免疫效果評價提供了良好的種子資源。

1 材料與方法

1.1 樣品來源 太谷區(qū)某雞場57日齡青年雞含血糞便和腸道內(nèi)容物。

1.2 實驗動物 50只健康SPF級白來航雞由購自北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司的SPF種雞蛋孵化而來，在隔離器中飼養(yǎng)至50 日齡備用。

1.3 主要儀器和試劑 PCR擴增儀，購自Bio-Rad公司；凝膠成像分析儀，購自北京六一生物科技有限公司；普通光學(xué)顯微鏡，購自O(shè)lympus Corporation公司。QIAamp DNA Mini Kit，購自QIAGEN公司；EasyTaq聚合酶、DL1 000 DNA Marker，均購自TaKaRa公司；其他化學(xué)試劑，均購自Sigma-Aldrich公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 單卵囊的分離純化與卵囊擴增 采用飽和食鹽水漂浮法[1]收集感染雞糞便和腸內(nèi)容物中的卵囊并計數(shù)。

利用單卵囊技術(shù)[2]分離純化蟲株。PBS稀釋卵囊液至顯微鏡下觀察每滴只有1～2個球蟲卵囊，用一次性無菌針頭蘸取稀釋好的卵囊液滴于明膠玻璃紙，蓋上糖衣紙，口服給予10只實驗雞。將感染單個卵囊的雞隔離飼養(yǎng)144 h，逐只收集糞便，用飽和食鹽水漂浮法收集卵囊，涂片法鏡檢，觀察有無球蟲卵囊。當(dāng)檢測到卵囊后，用飽和鹽水漂浮法收集此后0～24 h和24～48 h糞便中的卵囊。檢測到卵囊后48 h取感染雞盲腸內(nèi)容物收集卵囊。收集的卵囊混懸于2.5%重鉻酸鉀溶液，28 ℃通氣培養(yǎng)16 h后開始吸取少量卵囊液，顯微鏡檢測卵囊最短孢子化時間(即出現(xiàn)第1個卵囊內(nèi)形成4個孢子囊的時間)，待孢子化率達到85%以上時將卵囊液保存于4 ℃冰箱。

以5 000個/羽的劑量將分離的卵囊口服接種給5只實驗雞，采集接種后144～192 h的糞便，以飽和鹽水漂浮法收集卵囊。

1.4.2 蟲株生物學(xué)特點鑒定 將35只體重相近的50 日齡實驗雞稱重后隨機分為3個組：空白對照組(C組)10 只，不接種球蟲；低劑量接種組(T1組)15只，口服卵囊5.0×104個/羽；高劑量接種組(T2組)10 只，口服卵囊1.1×105個/羽；接種卵囊后每天觀察各組雞只的精神狀況和死亡情況。對于死亡雞，即死即剖檢，涂片，蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin staining，H.E.)染色鏡檢觀察腸組織病理變化和蟲體寄生情況。

于接種后120 h時剖檢5只T1組雞只，肉眼觀察其腸道病變，刮取各腸道黏膜，涂片鏡檢觀察裂殖體寄生部位并測定裂殖體大小。

于接種后135 h開始，每小時收集T1組和T2組雞只糞便，鏡檢有無球蟲卵囊，確定潛隱期。潛隱期后0～48 h收集T1組和T2組糞便，檢測卵囊產(chǎn)量和大小，并在潛隱期后48 h時對各組雞只稱重并剖殺，觀察腸道病變，刮取各腸道黏膜，鏡檢觀察腸道病理組織學(xué)變化，參考Johnson和Reid[5]描述的方法判定腸道病變記分，檢測觀察卵囊寄生部位，取腸道組織制作石蠟切片進行H.E.染色鏡檢觀察腸道病變。

計算各組雞只接種當(dāng)天到剖殺時的平均增重、相對增重率和死亡率，以及平均腸道病變記分。

1.4.3 PCR鑒定與測序分析 提取1.4.1項純化擴增卵囊的DNA，以提取的DNA作為模板，參考E.necatrixSCAR標(biāo)記序列[3]，設(shè)計產(chǎn)物長度為230 bp的特異性引物[4](SCAR-F：5′-GGTACTGACTTCATTCATATTGCG-3′，SCAR-R：5′-ACAACGCCTCATAACCCCAA-3′)，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物。PCR擴增體系：2×EasyTaq PCR SuperMix 12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 10.5 μL，模板1.0 μL，總體積25.0 μL。PCR反應(yīng)條件：98 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，68 ℃ 30 s，共29個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物送深圳華大基因股份有限公司測序，對測序所得基因序列使用MEGA 11軟件Clustal W方法進行進化樹分析。

1.5 數(shù)據(jù)分析 試驗結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”方式表示。使用SPSS Statistics 19.0軟件對平均增重和平均腸道病變記分進行t檢驗。P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 單卵囊分離純化與卵囊擴增 通過飽和鹽水漂浮法從1只感染雞的糞便和腸道內(nèi)容物中分離到2.0×105個卵囊。通過單卵囊技術(shù)分離到1株純凈的球蟲蟲株，卵囊最短孢子化時間為18 h，卵囊形態(tài)見圖1。

圖1 球蟲卵囊形態(tài)(400×)

2.2 蟲株生物學(xué)特點鑒定 接種卵囊后120 h T1組和 T2組雞精神萎靡，排出番茄樣帶血糞便。剖檢T1組5只實驗雞，可見其空腸腸管直徑腫脹至正?？漳c的2倍以上，長度縮短至僅為正常長度的約1/2，在漿膜面可見多量出血斑和灰白色壞死灶，腸腔內(nèi)充滿血液和組織碎片，病變甚者波及十二指腸(圖2B)；刮取腸黏膜涂片鏡檢，十二指腸和盲腸均未見裂殖體，空腸中段有大量成簇的大裂殖體，偶爾見裂殖體破裂，裂殖子從內(nèi)釋放出來，呈月牙形，蜷曲蠕動，裂殖體平均大小為(63.17±7.66) μm×(47.12 ±6.91) μm(圖2C)。表明本試驗分離球蟲主要感染雞空腸導(dǎo)致病變，裂殖體寄生部位為空腸，且裂殖體較大。

圖2 腸道病變和蟲體鏡檢

于接種后152 h在T1組和T2組實驗雞糞便中初次檢出卵囊，即該蟲株潛隱期為152 h。接種后152～200 h(即潛隱期后0～48 h)T1組和T2組卵囊產(chǎn)量分別為193.67×104個/羽和320.00×104個/羽，T2組雞只卵囊產(chǎn)量高于T1組(表1)，卵囊平均大小為(19.92±0.20) μm×(19.27±0.11) μm。

于接種后144 h,T1組和T2組均出現(xiàn)死亡雞，剖檢發(fā)現(xiàn)其空腸病變較120 h時更嚴(yán)重，十二指腸和空腸除含有多量大小不等的裂殖體外，腸內(nèi)容物含多量脫落的上皮細(xì)胞和釋放的裂殖子，盲腸段未見裂殖體，染色鏡檢可見空腸固有層寄生有大量裂殖體，腸絨毛斷裂脫落至腸腔，并伴有多量紅細(xì)胞(圖2E)。于接種后168 h剖檢T1組和T2組死亡雞只，眼觀病變同144 h，染色鏡檢見裂殖體數(shù)量減少，但是腸絨毛斷裂脫落更嚴(yán)重(圖2F)；于接種后200 h剖殺T1組和T2組存活雞只，眼觀雞只漿膜面有大量白色結(jié)節(jié)，腸管高度腫脹，黏膜大量出血，內(nèi)容物呈紅色凝塊狀或乳酪狀凝塊。鏡檢十二指腸和空腸中段見多量裂殖體，未見卵囊，盲腸見有大量卵囊。C組雞只未出現(xiàn)死亡，剖檢腸道未見異常，也未見球蟲蟲體。表明本試驗分離球蟲卵囊的寄生部位為盲腸。

綜合以上特征，初步判斷本試驗分離球蟲疑似為E.necatrix。

接種后200 h內(nèi)T1組和T2組雞只死亡率分別為40%和50%，相對增重率僅為C組的31.61%和20.87%，T1組和T2組的雞只平均增重均顯著低于C組(P<0.05)，T2組的平均增重顯著低于T1組(P<0.05)；T1組和T2組的雞只平均腸道病變記分均顯著高于C組(P<0.05)，T1組和T2組的平均腸道病變記分差異不顯著(P>0.05)(表1)。

表1 致病力和卵囊產(chǎn)量

2.3 PCR鑒定與測序分析 對PCR擴增獲得的陽性產(chǎn)物進行測序分析，結(jié)果顯示，所分離蟲株的SCAR標(biāo)記基因與E.necatrixKT423374同源性為97.1%，與布氏艾美耳球蟲(Eimeriabrunetti，E.brunetti)AY571558、堆型艾美耳球蟲(Eimeriaacervulina，E.acervulina)AY571546、巨型艾美耳球蟲(Eimeriamaxima，E.maxima)FN813238、和緩艾美耳球蟲(Eimeriamitis，E.mitis)AY571598、早熟艾美耳球蟲(Eimeriapraecox，E.praecox)KT423376和柔嫩艾美耳球蟲(Eimeriatenella，E.tenella)KT985455同源性介于29.8%～41.4%；進化樹分析顯示，所分離蟲株的SCAR標(biāo)記基因與E.necatrixKT423374蟲株位于同一分支，進化同步；與E.brunettiAY571558、E.acervulinaAY571546、E.maximaFN813238、E.mitisAY571598、E.praecoxKT423376、E.tenellaKT985455位于不同分支，進化差異較大(圖3)，故將本試驗分離蟲株命名為E.necatrix-CN-SX-2018。

圖3 E. necatrix-CN-SX-2018 SCAR標(biāo)記基因進化樹

3 討論

SCAR標(biāo)記技術(shù)由于需要匹配高特異性長序列，使其保持了高特異性、穩(wěn)定性和重復(fù)性，可準(zhǔn)確獲得微量寄生蟲DNA的高可信度結(jié)果，已廣泛應(yīng)用于雞艾美耳球蟲的蟲株種類鑒定[6-8]。本試驗根據(jù)感染雞只的病變部位、裂殖體寄生部位和大小、卵囊寄生部位和大小、最短孢子化時間等經(jīng)典生物學(xué)特征[9，10]，初步判斷分離的野生球蟲疑似為E.necatrix，結(jié)合PCR方法擴增和測序獲得E.necatrix特異性SCAR標(biāo)記序列，確定分離的野生蟲株為E.necatrix，并將該蟲株命名為E.necatrix-CN-SX-2018。

E.necatrix是雞艾美耳球蟲中致病力最強的球蟲之一，主要感染8～18周齡的雞群[11]，患雞出現(xiàn)精神萎靡、腹瀉、便血等臨床癥狀，小腸中段腸管鼓氣和出血是主要病變，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡[12]。本試驗結(jié)果顯示，5.0×104個/羽的分離E.necatrix可致40%感染雞只死亡，相對增重率下降至31.61%；據(jù)董青[13]報道，5.0×104個/羽E.necatrix河南強毒株可造成10%實驗雞死亡，相對增重率為92.25%，兩者相比，本試驗分離的E.necatrix致病力更強。顏靜蕊[14]在評價早熟株免疫效果時，以11×104個/羽的E.necatrix山西分離株接種易感雞，引起的空腸病變記分為3.5分，并伴有44.4%的死亡率和44.4%的相對增重率，本試驗以此劑量的新分離E.necatrix感染易感雞，死亡率可達50%，相對增重率下降至20.87%，平均空腸病變記分為4分，且病變波及附近腸道，致病力大大增加，目前報道的雞球蟲活疫苗使用劑量[15]能否有效抵抗本蟲株的損害還待進一步研究。

綜上，本試驗分離的E.necatrix蟲株對易感雞的致病性很強，為雞球蟲疫苗評價提供了良好的檢驗用種子蟲株，也給雞球蟲病的防控帶來新的挑戰(zhàn)。