龍 鑫，候建平，鄭思思，李佳妮，王 穩(wěn)，朱麗琳

(1. 青海大學 省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點實驗室，青海 西寧 810016 ；2. 西寧市野生動物疫源疫病監(jiān)測站，青海 西寧 810001)

高原兔(Lepusoiostolus)又名灰尾兔，隸屬于兔形目，兔科，主要分布于我國青藏高原及其毗鄰地區(qū)，是世界上分布海拔最高的兔種。目前，關(guān)于野生高原兔的生理研究偏少，主要集中于形態(tài)學觀察、生活習性、種群數(shù)量及人工防控、棲息地利用等內(nèi)容[1]。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群與動物宿主的神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)存在相互調(diào)控，進而與宿主的發(fā)育、免疫、代謝等諸多生理過程及眾多疾病的發(fā)生存在關(guān)聯(lián)[2]?；诖耍钊肓私飧咴媚c道菌群的組成及功能在其生理生態(tài)學研究中具有重要意義。目前，16S rDNA擴增子測序、宏基因組、培養(yǎng)基分離培養(yǎng)等技術(shù)手段被廣泛應用于動物腸道微生物研究[3]。本試驗利用16S rDNA高通量測序方法，分析高原兔小腸與大腸部位菌群種類及相對豐度，同時利用不同培養(yǎng)基對高原兔新鮮糞便中的微生物進行分離培養(yǎng)，獲得可培養(yǎng)的腸道微生物菌株，并進一步對獲得的菌株進行耐藥性檢測。本試驗結(jié)果有助于豐富對高原兔腸道微生物的認識，并為高原兔生理生態(tài)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 LB瓊脂和肉湯、MRS瓊脂和肉湯、M17瓊脂和肉湯、乳酸桿菌選擇性培養(yǎng)基(LBS)瓊脂和肉湯，均購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒、2 ×TaqPCR Master Mix和DL 2 000 Marker，均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；大腸埃希菌(EscherichiacoliATCC8099)、腸炎沙門菌(SalmonellaenteritidisCMCC 50041)、金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC6538)、痢疾志賀氏菌(ShigelladysenteriaeCMCC 51105)和銅綠假單胞菌(PseudomonasaeruginosaCMCC 10104)，均購自北京醫(yī)田生物技術(shù)有限公司；34種藥敏紙片，均購自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 主要儀器 KG-SX-500高壓滅菌鍋，購自上海珂淮儀器有限公司；SW-CJ-1FD無菌超凈臺、NRY-2102C恒溫培養(yǎng)箱和搖床，均購自上海昕儀儀器儀表有限公司；UV-3600Plus紫外可見分光光度計，購自屹譜儀器制造(上海)有限公司；ProFlex PCR儀，購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.3 試驗材料 利用網(wǎng)捕法在青海省海北藏族自治州海晏縣境內(nèi)捕獲高原兔2只，及時運回實驗室，用注射空氣造成氣體栓塞方法處死后，在實驗室無菌條件下進行剖檢。采集小腸段和大腸段內(nèi)容物共4份樣本，凍存于-80 ℃冰箱，用于16S rDNA擴增子測序。同時采集高原兔新鮮糞便數(shù)枚，混合后置于4 ℃冰箱，用于腸道微生物分離培養(yǎng)。動物捕獲及樣本采集嚴格遵守青海大學醫(yī)學院醫(yī)學倫理委員會的相關(guān)規(guī)定。

1.4 試驗方法

1.4.1 16S rDNA擴增子測序及生物信息分析 所有待測小腸段和大腸段內(nèi)容物樣本按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書的操作方法，進行微生物基因組DNA的提取。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA。以微生物基因組DNA為模板，對細菌16S rDNA的V4～V5區(qū)域進行PCR擴增。由北京奧維森基因科技有限公司進行基于MiSeq平臺(PE 2×300 bp)的16S rDNA建庫和高通量測序。

生物信息分析：首先，對原始測序數(shù)據(jù)進行一系列質(zhì)量控制，得到可用于后續(xù)分析的高質(zhì)量純凈序列(Clean reads)。然后，進行操作分類單元(Operational Taxonomic Units，OTU)分析，使用Uparse(Version 7.0.1090)方法進行OTU聚類，序列相似性設(shè)為97%，得到OTU代表序列。使用Usearch_global方法將優(yōu)化序列比對OTU代表序列，得到各個樣品的OTU序列豐度統(tǒng)計表。為了得到每個OTU對應的物種分類信息，采用RDP classifier(Version 2.2)對97%相似水平的OTU代表序列進行物種組成分析，置信度閾值設(shè)為0.8，并在各個分類水平(界、門、綱、目、科、屬)統(tǒng)計每個樣本的微生物群落組成。細菌分類比對的參考數(shù)據(jù)庫是Silva 16S rRNA database(Release128 http://www.arb-silva.de)。最后利用R語言繪制OTU水平韋恩圖。

1.4.2 細菌分離與純化 在無菌條件，將高原兔糞便樣本放入1 mL無菌水中，3 000 r/min離心5 min。取離心后懸液100 μL，從10倍開始對懸液進行10倍梯度稀釋至109倍。分別取稀釋倍數(shù)為10、103、105、107和109的懸液涂布在LB、MRS、M17和LBS瓊脂培養(yǎng)基表面，有氧條件下，在培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)24～48 h。挑選表征(顏色、大小、形狀)不同的單菌落在上述肉湯中培養(yǎng)12 h后，再次在相應的瓊脂培養(yǎng)基上進行單菌落培養(yǎng)分離。重復上述步驟5次，直至得到純化的單菌落。

1.4.3 基于16S rRNA基因的菌種鑒定 提取純化單菌落總DNA，利用細菌16S rRNA基因通用擴增引物對[上游引物7F：5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′；下游引物1540R：5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成]進行PCR擴增。取10 μL PCR擴增產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。將PCR擴增陽性的產(chǎn)物送往生工生物工程(上海)股份有限公司進行一代測序。將測序結(jié)果基于NCBI的BLAST程序進行序列相似性比對，明確細菌的分類水平。并將同一種細菌的最長序列作為代表性序列提交至NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫。運用MEGA X軟件，以Maximum composite likelihood模型計算遺傳距離，采用鄰接法(Neighbor-joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，Bootstrap自展1 000次檢驗進化樹拓撲結(jié)構(gòu)置信區(qū)間，以痰液彎曲菌(Campylobactersputorumstrain ATCC 33709)為外類群。

1.4.4 藥敏試驗 采用藥敏紙片瓊脂擴散法(K-B法)，將麥氏度調(diào)節(jié)為0.5的菌液均勻涂在瓊脂培養(yǎng)基上，貼上34種藥敏紙片，每種藥敏紙片重復3片。培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)14 h后測量抑菌圈直徑，并依據(jù)中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準《抗菌藥物敏感性試驗的技術(shù)要求(WS/T 639—2018)》[4]判定結(jié)果。

1.4.5 抑菌試驗 利用牛津杯法測定2種潛在有益菌株對5種病原菌的抑菌圈大小。分別在LB和LBS瓊脂平板上加入50 μL病原菌菌液，并涂布均勻。在培養(yǎng)基表面等距離擺放牛津杯并輕輕按壓，使其與培養(yǎng)基接觸無空隙。在牛津杯中加入2種潛在有益菌株菌液各200 μL，培養(yǎng)24 h后，測定抑菌圈的大小。每種菌株做3次重復。

2 結(jié)果

2.1 16S rDNA擴增子測序及生物信息分析 高原兔小腸部位的菌群在菌門水平主要由擬桿菌門(Bacteroidetes)22.30%、厚壁菌門(Firmicutes)20.02%、互養(yǎng)菌門(Synergistetes)2.92%、放線菌門(Actinobacteria)1.07%組成；大腸部位的菌群在菌門水平主要由厚壁菌門16.70%、放線菌門14.24%、擬桿菌門11.43%、藍細菌門(Cyanobacteria)1.87%組成(圖1A)。高原兔小腸部位相對豐度大于1.00%的菌屬包括：理研菌科RC9腸道群(RikenellaceaeRC9 gut group)8.47%、擬桿菌屬(Bacteroides)7.89%、克里斯滕森菌科R-7群(ChristensenellaceaeR-7 group)7.26%、dgA-11 gut group 2.87%、金字塔桿菌屬(Pyramidobacter)2.28%、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)2.21%、月形單胞菌屬(Selenomonas)1.78%、芽孢桿菌屬(Bacillus)1.39%、副擬桿菌屬(Parabacteroides)1.21%、臭味桿菌屬(Odoribacter)1.21%；高原兔大腸部位相對豐度大于1.00%的菌屬包括：腸桿菌屬(Enterorhabdus)10.28%、擬桿菌屬7.33%、芽孢桿菌屬3.44%、克里斯滕森菌科R-7群3.04%、紅蝽桿菌科UCG-002屬(CoriobacteriaceaeUCG-002)1.64%、理研菌科RC9腸道群1.54%、副擬桿菌屬1.13%(圖1B)。OTU水平的韋恩圖顯示，高原兔小腸和大腸部位微生物OTU總數(shù)為452，小腸部位微生物OTU數(shù)小于大腸部位微生物OTU數(shù)，2個部位共有微生物OTU數(shù)高達254(圖2)。

圖1 高原兔小腸和大腸部位菌群在門水平(A)和屬水平(B)上的組成

圖2 高原兔小腸和大腸部位菌群OTU分布韋恩圖

2.2 細菌分離與純化以及基于16S rRNA基因的菌種鑒定 經(jīng)5輪純化后，最終獲得25個單菌落。經(jīng)生工生物工程(上海)股份有限公司進行一代測序后，獲得所有25個單菌落的16S rRNA基因序列。將所有測序序列利用NCBI的BLAST程序進行序列相似性比對，發(fā)現(xiàn)這些菌株隸屬于3門、6屬、9種，分別是萎縮芽孢桿菌(Bacillusatrophaeus)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、運動芽孢桿菌(Bacillusmobilis)、耐久腸球菌(Enterococcusdurans)、蒙氏腸球菌(Enterococcusmundtii)、托爾豪特鏈球菌(Streptococcusthoraltensis)、大腸埃希菌(Escherichiacoli)、神戶腸桿菌(Enterobacterkobei)、檸檬節(jié)桿菌(Arthrobactercitreus)。將上述每個種的最長序列作為代表性序列提交到NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫獲得登錄號，并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。由圖3可知，不同分離菌株與相應參考菌株親緣關(guān)系較近，均處系統(tǒng)進化樹同一分支。

圖3 基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)進化樹

2.3 藥敏試驗 結(jié)果如表1所示，9種菌株對3～27種抗菌藥物表現(xiàn)出耐藥性。其中，耐久腸球菌、蒙氏腸球菌、運動芽孢桿菌、神戶腸桿菌可耐受的抗菌藥物至少有14種，而托爾豪特鏈球菌、萎縮芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌可耐受的抗菌藥物低于5種。進一步從抗菌藥物抑制細菌的角度進行分析，發(fā)現(xiàn)有15種抗菌藥物能夠抑制本試驗中分離的6～9種菌株，分別是哌拉西林、頭孢西丁、甲氧芐胺嘧啶、頭孢他啶、頭孢拉定、厄他培南、諾氟沙星、氨芐青霉素、頭孢唑林、丁胺卡那、鏈霉素、氧氟沙星、環(huán)丙氟哌酸、多西環(huán)素、左氧氟沙星；其中左氧氟沙星可抑制分離到的9種菌株；而吉他霉素、氨曲南、克林霉素、制霉菌素、林可霉素對6～9種分離菌株無抑制作用，其中制霉菌素和林可霉素對所有分離到的菌株均無抑制作用。

表1 分離菌株藥敏試驗

續(xù)表

2.4 抑菌試驗 選取本試驗分離到的2株腸球菌進行抑菌試驗。由圖4可知，蒙氏腸球菌對5種腸道病原菌均有一定的抑制效果，尤其對腸炎沙門菌、銅綠假單胞菌的抑制效果較好；耐久腸球菌對腸炎沙門菌、金黃色葡萄球菌的抑制效果較好，而對另外3種腸道病原菌無抑制效果。

圖4 兩種菌株對5種腸道病原菌的抑制效應

3 討論

本試驗綜合利用16S rDNA高通量測序技術(shù)和細菌培養(yǎng)分離技術(shù)，分別從腸道微生物種類和分離菌株耐藥性、抑菌性2個方面揭示高原兔腸道菌群特征。16S rDNA高通量測序結(jié)果揭示高原兔小腸和大腸部位微生物組成的整體特征，小腸部位菌群主要由厚壁菌門和擬桿菌門組成；大腸部位菌群除上述2種菌門外，還包括放線菌門。該結(jié)果與宋冰等[5]對工廠兔、散養(yǎng)兔和野兔盲腸菌群研究結(jié)果一致。這3種菌門也是脊椎動物普遍共棲的腸道微生物類別[2]。屬水平結(jié)果顯示，小腸和大腸部位微生物的優(yōu)勢菌群在種類上存在一定相似性，均含有擬桿菌屬、芽孢桿菌屬、克里斯滕森菌科R-7群、理研菌科RC9腸道群、副擬桿菌屬。食性被認為是影響動物腸道菌群組成的重要因素之一，動物借助腸道菌群消化、吸收食物中的營養(yǎng)物質(zhì)，進而適應其特有食性[6]。高原兔的植食特性有利于在纖維物質(zhì)消化中起主要作用的厚壁菌門、擬桿菌門細菌在腸道內(nèi)定殖和生長[7]。比如，擬桿菌門的擬桿菌屬被認為與纖維素、淀粉和果膠等復雜多糖消化有關(guān)[8]。Tavella等[9]研究表明，大量的克里斯滕森菌與理研菌科成員通過降低內(nèi)臟脂肪含量對相關(guān)的心血管和代謝性疾病產(chǎn)生保護效應，進而對機體健康發(fā)揮有益作用。本試驗發(fā)現(xiàn)，高原兔小腸與大腸部位存在特異OTU，可能與腸道不同部位的結(jié)構(gòu)和生理功能有關(guān)。而高達56.19%的OTU為高原兔小腸與大腸共有，提示這些微生物穩(wěn)定存在于高原兔腸道微生物群落中，可能發(fā)揮核心生理功能。未來可借助宏基因組學手段深入研究核心菌群的基因功能和代謝通路等。

基于細菌培養(yǎng)分離技術(shù)，本試驗利用4種培養(yǎng)基共獲得9種高原兔腸道菌株，隸屬于3門、6屬。目前，培養(yǎng)組學多應用于人體、經(jīng)濟動物和模式動物的腸道菌群培養(yǎng)，野生動物腸道菌群的培養(yǎng)工作相對滯后。較之于菌群高通量測序結(jié)果，本試驗分離的菌株較少。究其原因，一方面，本試驗使用的培養(yǎng)基類型及培養(yǎng)條件較為單一，難以覆蓋絕大多數(shù)菌株的生長條件；另一方面，本試驗以糞便為材料進行菌群培養(yǎng)，并不能完全代表真實的腸道菌群狀況。本試驗分離菌株中，神戶腸桿菌、蒙氏腸球菌、托爾豪特鏈球菌、檸檬節(jié)桿菌所占比例較高。王恩召等[10]研究發(fā)現(xiàn)，神戶腸桿菌可通過釋放3-甲基丁酸進而對小孢根霉(Rhizopusmicrosporus)產(chǎn)生抑制作用。王雅君等[11]從雉雞嗉囊中分離篩選到1株蒙氏腸球菌Sna，具有較強的抗氧化活性和膽固醇清除活性。托爾豪特鏈球菌為條件致病菌，可引起膿胸、感染性心內(nèi)膜炎、菌血癥等[12]。李俊琴[13]分離的藏羚羊和高原鼠兔腸道菌群中，檸檬節(jié)桿菌是二者共有的優(yōu)勢菌種。本試驗發(fā)現(xiàn)的2種腸球菌，蒙氏腸球菌和耐久腸球菌，對5種常見腸道致病菌表現(xiàn)出一定的抑制能力，提示未來潛在的應用價值[14]。以上結(jié)果表明，高原兔腸道菌群中致病菌和有益菌共存，是高原兔宿主與腸道菌群協(xié)同演化、相互適應的結(jié)果。這些分離菌株豐富了高原兔可培養(yǎng)腸道菌株資源，不僅為進一步優(yōu)化培養(yǎng)條件以分離更多高原兔源菌株提供參考，而且為適于家兔養(yǎng)殖業(yè)的高原兔源有益菌株研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

動物源細菌的抗菌藥耐藥性在全球范圍內(nèi)蔓延，耐藥細菌和耐藥基因在“動物、食品、環(huán)境和人群”鏈條內(nèi)流通，嚴重威脅著人類公共衛(wèi)生安全[15]。藥敏試驗結(jié)果顯示，9種分離菌株對3～27種抗菌藥物表現(xiàn)出耐藥性，而制霉菌素、林可霉素對所有分離到的菌株均無抑制作用。因此推測高原兔腸道耐藥菌株可能來自與其共享草地及水源的牦牛、藏羊等家養(yǎng)動物。高原畜牧養(yǎng)殖業(yè)中廣泛使用的治療性抗菌藥使得家養(yǎng)動物腸道菌群面臨高選擇性壓力，產(chǎn)生耐藥菌株和耐藥基因，并隨著家養(yǎng)動物糞便轉(zhuǎn)移至高原生態(tài)環(huán)境中，進一步導致耐藥菌株和耐藥基因在不同高原野生動物之間傳播[16]。本試驗結(jié)果增添了對高原兔腸道菌株耐藥性的新認識，為后續(xù)深入探討“高原家養(yǎng)動物糞便—環(huán)境(土壤、水源、草地)—野生動物”的潛在傳播路徑提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。