趙彥華，張世勇，劉洪巖，孫夢玲，薛 暉

(江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇 南京 210017)

中國大鯢(Andriasdavidianus)在分類學上屬于兩棲綱(Amphibia)、有尾目(Caudata)、隱鰓鯢科(Cryptobrachidae)、大鯢屬(Andrias)，因其叫聲似嬰兒啼哭，民間俗稱“娃娃魚”，是我國現(xiàn)存最大的兩棲動物[1]。自1978年我國首次人工繁育中國大鯢以來[2]，全國各地陸續(xù)開展了中國大鯢的人工繁育和養(yǎng)殖技術的研究，促進了中國大鯢養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展[3]。但隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大、種質(zhì)的退化和養(yǎng)殖環(huán)境的惡化，越來越多的疾病給大鯢養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。近幾年，在江蘇省中國大鯢養(yǎng)殖廠出現(xiàn)一種以表皮出血為主并伴有部分皮膚潰爛的疾病，引起該病的病原尚未確認，臨床治療上存在很大的障礙，因此本試驗通過對發(fā)病的中國大鯢開展致病原因探究和致病菌的全基因組分析，從而為臨床病害防控提供科學的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 75%消毒酒精，購自青島海氏海諾英諾消毒科技有限公司；腦心浸出液肉湯(Brain heart infusion,BHI)平板、營養(yǎng)瓊脂(Nutrient agar,NA)平板、血瓊脂(Blood agar,BA)平板和革蘭染色液，均購自廣東環(huán)凱生物科技有限公司；細菌藥敏試劑片，購自杭州濱和微生物試劑有限公司；微量生化發(fā)酵管，購自北京陸橋生物技術有限公司；Taq酶、PCR Buffer、DL3 000 DNA Marker和Ezup柱式細菌基因組DNA 抽提試劑盒，均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 主要儀器 基因擴增儀StepOnePlusTMReal-Time PCR System(5020)：德國賽默飛；顯微鏡(CX23)：日本奧林巴斯；分子凝膠成像分析系統(tǒng)(ChemiDoc XRS)：美國伯樂；生化培養(yǎng)箱(DHP-9162)、恒溫振蕩器(THZ-98A)：上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 材料采集 患病中國大鯢，來自江蘇省湯山某大鯢養(yǎng)殖場，平均體長約55 cm，平均體重約1 800 g。健康中國大鯢，來自江蘇省鎮(zhèn)江市某大鯢養(yǎng)殖場，共30尾，平均體長約8 cm，平均體重約48 g。

1.4 發(fā)病原因初步鑒定

1.4.1 患病大鯢臨床癥狀和剖檢觀察 選取癥狀明顯患病大鯢，觀察臨床特征，體表是否存在贅生物，隨后進行體表消毒，嚴格按照無菌操作流程打開腹腔，觀察腹腔內(nèi)臟器情況。

1.4.2 病毒感染鑒定 取患病大鯢潰爛處皮膚肌肉、肝臟和腸道組織，加入無菌生理鹽水進行研磨，研磨液利用無菌針式過濾器(0.22 μm)進行過濾，將過濾后濾液無菌注射于健康大鯢背部肌肉，共注射4尾，每尾2 mL，暫養(yǎng)于水族箱中觀察14 d。

1.4.3 病原菌分離和鏡檢 無菌接種環(huán)輕壓發(fā)病大鯢肝臟橫截面和腸道內(nèi)壁，劃線接種于NA平板，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)48 h后挑取典型菌落進行純培養(yǎng)，純培養(yǎng)后細菌接種于BA平板，觀察細菌溶血性；選用革蘭染色法對純培養(yǎng)后細菌進行染色，鏡檢觀察細菌形態(tài)和染色特征。

1.5 人工感染試驗 將健康大鯢于水族箱中適應飼養(yǎng)7 d，水族箱規(guī)格為1 100 cm×500 cm×700 cm，水溫控制為22 ℃，試驗共設置2個試驗組和1個對照組，每組4尾。將健康大鯢體表皮膚無菌劃傷，在試驗組水族箱中加入15 mL含病原菌肉湯培養(yǎng)基，對照組大鯢則放入15 mL無菌肉湯培養(yǎng)基，連續(xù)觀察14 d，記錄各組大鯢感染數(shù)。取發(fā)病大鯢肝臟和腸道組織進行病原菌的分離和鑒定。

1.6 病原菌生化鑒定 將病原菌接種于微量生化發(fā)酵管，以微量發(fā)酵管的形式進行生化指標檢測。

1.7 16S rDNA序列的擴增和分析

1.7.1 DNA提取和PCR擴增 按照Ezup柱式細菌基因組DNA 抽提試劑盒說明書提取病原菌DNA，并測定其濃度和純度。以提取的DNA為模板，選用細菌16S rDNA通用引物進行聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction,PCR)擴增，PCR反應體系(25.0 μL)：10×PCR緩沖液(含Mg2+)2.5 μL、10 mmo/L 4×dNTP 1 μL、10 μmol/L正向和反向引物各0.5 μL、TaqDNA聚合酶(5 U)0.2 μL、DNA模板0.5 μL，加入ddH2O至25.0 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性25 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30次；72 ℃延伸10 min。委托生工生物工程(上海)股份有限公司對擴增產(chǎn)物進行純化和測序。

1.7.2 序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 測序后，在GenBank數(shù)據(jù)庫中輸入測得的病原菌16S rDNA 序列并進行BLAST比對。將病原菌16S rDNA序列通過美國國立生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)的BLAST檢索系統(tǒng)進行序列同源性分析，檢索出高同源性的序列使用MEGA 4.0軟件，采用鄰接法(Neighbor-joining method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進行置信度檢測。

1.8 藥敏試驗 選取9種常用抗菌藥，按照紙片擴散法進行試驗，將濃度為1×107CFU/mL的病原菌懸液均勻涂布于BHI平板培養(yǎng)基上，加入藥敏試紙片，每種藥敏試紙片設立2個試驗組和2個對照組，28 ℃培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈直徑，計算2個試驗組抑菌圈直徑平均值作為結(jié)果進行判定，直徑≥16 mm判定為敏感(Sensitivity,S)，直徑介于11～15 mm判定為中介(Intermediary,I)，直徑≤10 mm判定為耐藥(Resistance,R)。

1.9 全基因組分析 利用Illumia測序方法，對病原菌基因組進行測序，獲得原始圖像數(shù)據(jù)，經(jīng)Base Calling轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)進行基因組組裝和測序，進行基因功能注釋和預測。利用Trimmomatic軟件對原始測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)量剪切，得到測序數(shù)據(jù)，最后經(jīng)過Nanopore三代測序，利用RNAmmer-1.2和tRNAscan-SE 2.0.4軟件對基因組中包含的核糖體RNA(Ribosomal RNA,rRNA)和轉(zhuǎn)運RNA(Transfer RNA,tRNA)進行預測，采用R circlize包進行基因組圈圖繪制，全面展示基因組的特征。

2 結(jié)果

2.1 患病大鯢臨床癥狀和剖檢觀察 患病大鯢主要臨床癥狀為體表有大量彌散性出血點，頭部皮膚較為嚴重并伴有潰爛，行動遲緩，拒絕進食，剖檢后發(fā)現(xiàn)其腹腔內(nèi)肝臟有大量出血點，腸壁充血，脾臟發(fā)白。

2.2 病毒感染鑒定 無菌組織勻漿注射于健康大鯢后連續(xù)觀察14 d，大鯢活動和進食正常，無肉眼可見病害癥狀出現(xiàn)，排除病毒感染可能性。

2.3 病原菌分離和鏡檢 從患病大鯢肝臟中分離出1株優(yōu)勢菌株，命名為WG-1。分離菌在營養(yǎng)瓊脂平板上呈現(xiàn)出表面光滑、邊緣整齊、圓形微凸的乳白色菌落，不溶血(圖1)。革蘭染色后在顯微鏡下可見紅色呈短鏈分布的球桿狀細菌，無鞭毛和莢膜，為革蘭陰性菌。

圖1 病原菌在營養(yǎng)瓊脂平板(A)和血平板培養(yǎng)基(B)上生長狀態(tài)

2.4 人工感染試驗 人工感染病原菌后，試驗組大鯢于試驗第8天首次出現(xiàn)感染癥狀，至第14天試驗結(jié)束時，2個試驗組感染率分別為100%和75%，臨床癥狀與中國大鯢出血癥癥狀相似，體表有出血點，頭部潰爛，行動遲緩，對照組大鯢無癥狀。在2個試驗組發(fā)病大鯢肝臟和腸道組織中均分離出與病原菌WG-1形態(tài)一致的細菌，符合科赫氏法則要求。

2.5 病原菌生化鑒定 生化試驗結(jié)果顯示，病原菌氧化酶試驗陰性、V-P試驗陰性、吲哚陽性、鳥氨酸脫羧，可分解葡萄糖，不可分解甘露醇、七葉苷、阿拉伯糖和蔗糖。

2.6 PCR擴增、序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 病原菌16S rDNA擴增后得到1 474 bp的片段(圖2)。同源序列的BLAST結(jié)果顯示，病原菌與AR0057(GenBank登錄號:CP027177.1)摩根氏菌屬(Morganella)細菌的同源性達99.93%，與分離病原菌相似度最高的8個菌株均同屬于摩根氏菌屬，表明分離病原菌屬于摩根氏菌屬。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，病原菌在系統(tǒng)發(fā)育樹上與分離自海產(chǎn)品的摩氏摩根菌(MorganellamorganiiNR_115750.1)聚為一支(圖3)。

圖2 WG-1 16S rDNA基因的PCR擴增

圖3 基于16S rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.7 藥敏試驗 選擇氨曲南等9種抗菌藥進行藥敏試驗，結(jié)果顯示，病原菌對卡那霉素最敏感，鏈霉素次之，對羧芐西林、多黏菌素和呋喃妥因有耐藥性(表1)。

表1 耐藥性分析結(jié)果

2.8 全基因組分析

2.8.1 基因組組裝與預測 分離病原菌測序結(jié)果見表2，基因組有效數(shù)據(jù)量為2 350.4 Mb，Reads個數(shù)為2 790 545個，平均測序讀長為1 547 bp，N50長度為2 872 bp。運用ABySS軟件對數(shù)據(jù)進行組裝，并運用GapCloser軟件對組裝結(jié)果進行校正，組裝結(jié)果統(tǒng)計見表3，組裝后基因組總長度為3 824 333 bp，G+C含量為51.05%。利用Glimmer 3.02軟件對該基因組進行基因預測，預測結(jié)果見表4，共得到3 732個編碼蛋白的基因，基因總長度為3 342 762 bp，基因平均長度為895 kb，基因的G+C含量為52.4%。

表2 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計

表3 組裝結(jié)果統(tǒng)計

表4 基因預測結(jié)果統(tǒng)計

2.8.2 非編碼RNA統(tǒng)計 結(jié)果如表5所示，分離病原菌基因組含有82個tRNA，總長度為6 439 bp，占基因總長度的0.16%；含有22個rRNA,總長度為31 986 bp，占基因總長度的0.83%，其中包括：8個5S rRNA，總長度為920 bp，占基因總長度的0.02%；7個16S rRNA，總長度為10 717 bp，占基因總長度的0.28%；7個23S rRNA，總長度為20 349 bp，占基因總長度的0.53%。

表5 非編碼RNA統(tǒng)計

2.8.3 基因功能注釋 將預測基因的蛋白序列分別與NR、GO、eggNOG、KEGG、Swiss-Prot、CAZy、CARD數(shù)據(jù)庫進行比對，基因功能分析結(jié)果顯示，分別有3 664、1 780、2 961、2 328、2 716、66和96個基因在對應的NR、GO、eggNOG、KEGG、Swiss-Prot、CAZy和CARD數(shù)據(jù)庫獲得注釋。

表6 基因功能注釋統(tǒng)計

2.8.4 基因組圈圖 結(jié)果如圖4所示，圈圖的最外圈、第2圈、第3圈分別為基因組大小的標識、正鏈上編碼蛋白序列、負鏈上編碼蛋白序列，顏色的不同表示編碼序列不同的同源性功能分類；第4圈為rRNA和tRNA；第5圈為G+C含量，該區(qū)域G+C含量如高于全基因組平均G+C含量，則用向外的紅色顯示，峰值的高低與平均G+C含量差值呈正相關；如該區(qū)域G+C含量低于全基因組平均G+C含量，則用向內(nèi)的藍色表示，峰值的高低與平均G+C含量差值呈正相關；最內(nèi)圈為G+C skew值，計算公式為G-C/G+C，在生物學意義上，如該值為正值時，正鏈更傾向于轉(zhuǎn)錄編碼序列；為負值時，負鏈更傾向于轉(zhuǎn)錄編碼序列。

圖4 基因組圈圖

3 討論

目前，據(jù)研究報道已發(fā)現(xiàn)中國大鯢病害有10多種[4]，其中臨床上較常見的病害為細菌病，感染中國大鯢的細菌多種多樣，包括遲鈍愛德華菌(Edwardsiellatarda)[5]、惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)[6]、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)[7，8]、溫和氣單胞菌(A.sobria)[9]和殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種(A.salmonicidasubsp．salmoni-cida)[10]等。1999年，王高學等首次發(fā)現(xiàn)了熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)感染可導致大鯢患赤皮病，該菌株對鏈霉素、氯霉素、氟哌酸和慶大霉素高度敏感，臨床選用硫酸慶大霉素肌內(nèi)注射，治療效果較好[11]；2010年，王旭等發(fā)現(xiàn)元兇維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)感染可導致大鯢腐皮病，藥敏試驗顯示該菌對頭孢類抗菌藥較敏感[12]；2011年，杜宗君等通過對四川人工養(yǎng)殖死亡的大鯢研究發(fā)現(xiàn)，熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)感染可導致大鯢花斑肝，致病菌對新生霉素、氯霉素和強力霉素較為敏感，推薦采用敏感藥物內(nèi)服或肌內(nèi)注射進行治療[13]；2012年，高正勇等研究發(fā)現(xiàn)，弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)可感染大鯢造成死亡，藥物敏感性試驗顯示，該菌株對氨曲南、頭孢三嗪、先鋒噻肟等9種藥物高度敏感，建議根據(jù)藥敏試驗選擇最有效的藥物進行治療[14]。

摩氏摩根菌(Morganellamorganii)是腸桿菌科(Enterobacteriaceae)摩根氏菌屬(Morganella)的唯一菌種，目前分為2個亞種：摩根亞種和波斯尼亞種[15]。摩氏摩根菌為條件致病菌，能夠造成動物肺臟淤血、膿腫，腎臟出血等病變，也可以造成動物體表皮膚或肌肉的潰爛[16]。

本次試驗根據(jù)分離病原菌藥物敏感性試驗結(jié)果，臨床上建議首選卡那霉素進行治療；同時有文獻報道，我國1990年已從進口冷凍海魚中分離出摩根氏菌[17]，結(jié)合本試驗所得病原菌在系統(tǒng)進化樹上與海鮮中分離到的摩氏摩根菌聚為一支這一特點，建議在大鯢日常養(yǎng)殖中關注投喂的海鮮產(chǎn)品的質(zhì)量，以防造成細菌性疾病大暴發(fā)。