彭韻志 ，白文慧 ，陳張軍，于 慧，靳 敏，胡 海，王占黎

(1.包頭醫(yī)學(xué)院研究生院，內(nèi)蒙古 包頭 014040;2.包頭醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院;3.內(nèi)蒙古自治區(qū)疾病相關(guān)生物標(biāo)志物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

香青蘭(Dracocephalum moldavica L.)是唇形科植物，廣泛應(yīng)用于中國傳統(tǒng)民族醫(yī)學(xué)，其主要成分有黃酮類、糖類、苯丙素類、三萜、甾體、揮發(fā)油以及微量元素等[1-6]。香青蘭全草中黃酮類化合物含量約為1.90 %，主要有洋芹素、木犀草素、金合歡素、桅子素乙、玄參黃酮、鼠尾草素、異鼠李素、田薊苷、藿香苷、山柰酚以及日本椴苷等[7-9]。香青蘭提取物具有良好的抗氧化、抗炎特性，可有效治療多種疾病。此外，黃酮類化合物可用作天然預(yù)防性治療，在緩解腸道炎癥、腸道屏障受損和菌群失調(diào)等方面起作用[10]。

隨著信息時(shí)代的發(fā)展，以系統(tǒng)生物學(xué)、生物信息學(xué)和高通量為基礎(chǔ)，集藥理學(xué)和信息網(wǎng)絡(luò)于一體的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)正在蓬勃發(fā)展，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以直接從大量數(shù)據(jù)中識(shí)別藥物和疾病靶點(diǎn)，了解它們之間的機(jī)制和通路[11-12]。中草藥具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，是中醫(yī)治療疾病的有效手段，但由于其成分復(fù)雜，有效成分和不良反應(yīng)尚不明確，限制了中草藥的應(yīng)用。因此，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討中草藥治療疾病的作用機(jī)制有益于中草藥的有效應(yīng)用。

1 資料與方法

1.1香青蘭提取物活性成分探索 在Pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)依次檢索木犀草素(Luteolin)、熊果酸(Ursolic acid)、芹菜素(Apigenin)、山奈酚(Kaempferol)、金合歡素(Acacetin)、齊墩果酸(Oleanic acid)、迷迭香酸(Rosmarinicacid)等，通過UniProt(https://www.uniprot.org/)將相關(guān)靶點(diǎn)的基因名標(biāo)準(zhǔn)化[13]。

1.2潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)靶點(diǎn)的獲取 潰瘍性結(jié)腸炎的相關(guān)靶點(diǎn)通過OMIM(https://omim.org/)、DisGeNET(https://www.disgenet.org/)、GeneCards(https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫檢索并使用UniProt將相關(guān)靶點(diǎn)的基因名標(biāo)準(zhǔn)化。利用韋恩圖(https://www.omicshare.com/tools/)將香青蘭提取物成分靶點(diǎn)和潰瘍性結(jié)腸炎疾病靶點(diǎn)對(duì)比分析，交集靶點(diǎn)即為香青蘭提取物治療潰瘍性結(jié)腸炎的潛在作用靶點(diǎn)。

1.3蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建和生物學(xué)功能注釋 通過STRING 11.0(https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)(Protein-Protein Interaction Network,PPI)圖[14]。參數(shù)設(shè)置為：物種僅限于Homo sapiens，相關(guān)度大于0.700[15]。通過CytoScape 3.6.0構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖。利用MCODE算法對(duì)蛋白質(zhì)群進(jìn)行生物學(xué)功能注釋。

1.4富集分析 通過DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)對(duì)香青蘭提取物治療潰瘍性結(jié)腸炎的潛在靶基因進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路分析[16]。物種限定為Homo sapiens，注釋的意義參考P<0.05。

2 結(jié)果

2.1香青蘭提取物活性成分篩選 利用Pubchem搜索化合物信息，得到香青蘭提取化合物的1 596個(gè)蛋白質(zhì)靶點(diǎn)，經(jīng)過高可能性篩選和重疊消除后，共獲得537個(gè)成分靶點(diǎn)。如表1所示，單個(gè)化合物與多個(gè)靶點(diǎn)相關(guān)，說明藥物具有多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的特點(diǎn)。

表1 靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)根據(jù)連接度的成分排序

2.2疾病靶點(diǎn)及藥物治療潰瘍性結(jié)腸炎的潛在靶點(diǎn)的獲取 通過檢索OMIM、DisGeNET、GeneCards疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫，本研究共獲得了1 458個(gè)香青蘭提取物活性成分靶點(diǎn)，537個(gè)疾病靶點(diǎn)。如圖1所示，將藥物成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)進(jìn)行交集，共獲得172個(gè)香青蘭提取物活性成分治療潰瘍性結(jié)腸炎的潛在作用靶點(diǎn)。

圖1 香青蘭提取物活性成分靶點(diǎn)和潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)疾病靶點(diǎn)的韋恩圖

2.3PPI網(wǎng)絡(luò)分析 圖2為172個(gè)潛在蛋白靶點(diǎn)的 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。疾病靶點(diǎn) PPI 網(wǎng)絡(luò)圖(交互分?jǐn)?shù)≥0.700)，包含172個(gè)節(jié)點(diǎn)和1 598條邊。Average node degree為18.6，avg.local clustering coefficient為0.532，PPI enrichment p-value<1.0e-16，表明所選蛋白之間的相互作用比從基因組中隨機(jī)抽取的一組相似大小的蛋白質(zhì)有更多的交互作用，因此，所選蛋白質(zhì)作為一個(gè)整體具有生物學(xué)意義。

圖2 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析

隨后進(jìn)行高度中心靶點(diǎn)的篩選。PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龌凇岸?Degree)”“介度中心度(Closeness)”“接近中心度(Betweenness)”3大網(wǎng)絡(luò)參數(shù)，用于選擇中位數(shù)以上節(jié)點(diǎn)作為關(guān)鍵靶點(diǎn)，構(gòu)建藥物對(duì)疾病治療效果的中心節(jié)點(diǎn)。第一次篩選條件設(shè)定為degree≥18、closeness≥0.35、betweenness≥0.01、交互分?jǐn)?shù)≥0.700，得到33個(gè)中心節(jié)點(diǎn)和230條邊。然后進(jìn)一步篩選了33個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，設(shè)定條件為degree≥44、closeness≥0.390、betweenness≥0.030 5、交互分?jǐn)?shù)≥0.700，得到10個(gè)中心節(jié)點(diǎn)和21條邊。在網(wǎng)絡(luò)中，節(jié)點(diǎn)與其他多個(gè)邊緣交互PPI中相互作用排前10的靶基因如表2所示，被認(rèn)為是關(guān)鍵治療靶點(diǎn)。

表2 蛋白質(zhì)互作靶基因排序

利用MCODE算法對(duì)蛋白質(zhì)群進(jìn)行生物學(xué)功能注釋，識(shí)別出其主要功能子簇，如圖3所示。由圖3可得，香青蘭提取物治療潰瘍性結(jié)腸炎潛在靶點(diǎn)的主要功能子簇有6個(gè)，分別由增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、上皮生長因子細(xì)胞增殖和信號(hào)傳導(dǎo)的酪氨酸激酶型受體(EGFR)、酪氨酸激酶受體2(ERBB2)、周期素依賴性激酶抑制因子1A(CDKN1A)等85個(gè)靶點(diǎn)蛋白組成，提示香青蘭提取物治療潰瘍性結(jié)腸炎可能主要經(jīng)由這些靶點(diǎn)的相互作用，因此將這85個(gè)靶點(diǎn)記錄為核心靶點(diǎn)。

圖3 利用MCODE算法分析蛋白質(zhì)群

2.4GO功能富集分析 利用DAVID數(shù)據(jù)庫對(duì)172個(gè)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO分析。共有89個(gè)生物過程(BP)、12個(gè)細(xì)胞成分(CC)和40個(gè)分子功能(MF)，分別符合基因計(jì)數(shù)≥2和P<0.05的要求。如圖4所示為GO富集分析分別展示生物學(xué)過程、細(xì)胞成分和分子功能的前11項(xiàng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)交集靶點(diǎn)涉及轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控DNA模板化(Positive regulation of transcription,DNA-templated)、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控(Positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter)、細(xì)胞對(duì)白細(xì)胞介素1的反應(yīng)(Cellular response to interleukin-1)、類固醇代謝過程(Steroid metabolic process)、對(duì)腫瘤壞死因子的細(xì)胞反應(yīng)(Cellular response to tumor necrosis factor)等生物學(xué)過程；富集在小窩(Caveola)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜(Endoplasmic reticulum membrane)、I-kappaB/NF-kappaB復(fù)合體(I-kappaB/NF-kappaB complex)、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體(Transcription factor complex)、蛋白質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)(Proteinaceous extracellular matrix)等細(xì)胞成分；參與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(Transcription factor binding)、血紅素結(jié)合(Heme binding)氧化還原酶活性、作用于成對(duì)供體結(jié)合或還原分子氧(Oxidoreductase activity,acting on paired donors,with incorporation or reduction of molecular oxygen)、氧結(jié)合(Oxygen binding)、類固醇羥化酶活性(Steroid hydroxylase activity)等分子功能。

圖4 GO富集分析

2.5KEGG通路富集分析 為了進(jìn)一步揭示香青蘭提取物治療潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)信號(hào)通路的作用機(jī)制，對(duì)相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行了KEGG通路富集分析。KEGG富集分析共獲得205條通路(P<0.01)，與癌癥、免疫和炎癥等密切相關(guān)。如圖5所示，按照P值從小到大的順序列出了前20條通路，如，大腸癌(colorectal cancer，CRC)和炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)涉及消化系統(tǒng)，T 細(xì)胞受體信號(hào)通路(T cell receptor signaling pathway)和Toll樣受體信號(hào)通路(Toll-like receptor signaling pathway)參與免疫系統(tǒng)反應(yīng)，腫瘤壞死因子信號(hào)通路(TNF signaling pathway)、NOD樣受體信號(hào)通路(NOD-like receptor signaling pathway)和HIF-1信號(hào)通路(HIF-1 signaling pathway)涉及炎癥反應(yīng)。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)了FoxO信號(hào)通路(FoxO signaling pathway)、催乳激素信號(hào)通路(Prolactin signaling pathway)。

圖5 KEGG通路富集分析

3 討論

3.1香青蘭提取物活性成分篩選 長期使用抗炎或免疫抑制藥物具有療效和安全的局限性，中草藥已被廣泛應(yīng)用于改善胃腸功能障礙和調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)[17]。經(jīng)典的中草藥已被用作潰瘍性結(jié)腸炎的潛在治療藥物，其中，黃酮類化合物和多酚類化合物已被應(yīng)用于緩解潰瘍性結(jié)腸炎的臨床實(shí)踐[18-19]。香青蘭提取物的活性成分有多種藥理作用，可以改善腸腔環(huán)境并維持免疫平衡。Li等[20]證實(shí)木犀草素的治療顯著緩解了潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的結(jié)腸損傷。據(jù)報(bào)道，熊果酸(ursolic acid)可以通過腸道菌群和脂肪酸代謝影響免疫細(xì)胞浸潤和細(xì)胞因子表達(dá)，對(duì)葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型起到保護(hù)和治療作用[21]。

3.2潛在靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)分析 本實(shí)驗(yàn)整理的30個(gè)活性成分主要作用于172個(gè)潰瘍性結(jié)腸炎疾病靶點(diǎn)，單個(gè)化合物與多個(gè)靶點(diǎn)相關(guān)，體現(xiàn)了藥物多成分、多靶點(diǎn)的協(xié)同作用。PPI分析表明，172個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)具有生物相關(guān)性。PPI網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，靶基因主要集中在Signaling by Interleukins、Cytokine Signaling in immune system和Inflammatory response。有研究證實(shí)，IL23/IL17軸可以促進(jìn)Th17細(xì)胞分化，進(jìn)而產(chǎn)生促炎因子白介素-17(IL-17)，這在潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用[22]。據(jù)報(bào)道，潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病機(jī)制包括多種腸道相關(guān)的免疫炎癥途徑，包括上皮屏障、共生菌群、抗原識(shí)別以及免疫反應(yīng)失調(diào)等[23]。

3.3通路富集分析 KEGG通路富集分析表明香青蘭提取物治療潰瘍性結(jié)腸炎時(shí)涉及消化、免疫系統(tǒng)反應(yīng)和炎癥反應(yīng)的相關(guān)通路，能夠調(diào)節(jié)T 細(xì)胞受體信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路和HIF-1信號(hào)通路。T 細(xì)胞受體信號(hào)通路和Toll樣受體信號(hào)通路可以調(diào)節(jié)機(jī)體腸道穩(wěn)態(tài)[24-26]。腫瘤壞死因子信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路和HIF-1信號(hào)通路能夠調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥反應(yīng)[27-30]。同時(shí)，已有研究指出FoxO信號(hào)通路有助于維持和修復(fù)上皮屏障[31- 32]。本研究的結(jié)果也富集到了該通路，解釋了香青蘭提取物可以修復(fù)腸屏障的作用機(jī)制。

綜上所述，香青蘭提取物中活性成分具有多種生物學(xué)功能，可作用于多條炎癥、免疫及癌癥相關(guān)通路，具有多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的特點(diǎn)。