許津銘，洪語萱，韋 暉，許 琪*

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 國家醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點實驗室，北京 100005；2.北京市第一六六中學(xué)，北京 100006

由新型冠狀病毒SARS-CoV-2引發(fā)的COVID-19疫情已導(dǎo)致全球近5億人感染，因病死亡人數(shù)高達(dá)580萬[1](最新COVID-19感染數(shù)據(jù)的參考網(wǎng)址：https://covid19.who.int/)。研究顯示，COVID-19患者廣泛存在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS)相關(guān)的并發(fā)癥或后遺癥。據(jù)統(tǒng)計，超過1/3的COVID-19患者會出現(xiàn)程度不一的神經(jīng)精神癥狀，包括頭疼、味覺與嗅覺喪失、幻覺甚至癲癇發(fā)作等。值得注意的是，這些癥狀往往并不隨患者的康復(fù)而消失，遷延周期較長，表明SARS-CoV-2感染會造成較難修復(fù)的CNS損傷[2]。由SARS-CoV-2引發(fā)的人體免疫系統(tǒng)過度激活，導(dǎo)致B淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫穩(wěn)態(tài)失衡是造成患者CNS損傷的重要基礎(chǔ)[3]。其中，SARS-CoV-2的刺突蛋白(S蛋白)是介導(dǎo)病毒侵入人體細(xì)胞的關(guān)鍵分子，亦是當(dāng)前各國疫苗研發(fā)的主要靶點。針對S蛋白最新的抗原圖譜研究顯示，COVID-19患者體內(nèi)存在大量針對S蛋白不同線性多肽表位的IgG抗體，但這些抗體大多數(shù)不具備針對SARS-CoV-2的病毒中和能力[4]。血清學(xué)檢測顯示，S蛋白的線性表位IgG抗體滴度與COVID-19患者的病情嚴(yán)重程度正相關(guān)，部分抗體在患者群體中的響應(yīng)率較高(>50%)，且能以較高滴度存留較長時間(>60 d)[4]。這些長期存在的“無效”抗體可能參與了包括CNS損傷在內(nèi)的COVID-19相關(guān)并發(fā)癥或后遺癥的病理過程。

基于此，本研究選取已報道的一個S蛋白線性表位S2-78(1 148-FKEELDKYFKNH-1 159)作為研究對象。該線性表位的血清IgG抗體在COVID-19患者中的總體響應(yīng)率達(dá)69.3%，抗體滴度是健康對照的129倍，居所有已報道線性表位第1位。通過構(gòu)建針對S2-78的免疫小鼠模型，觀察其行為學(xué)和病理學(xué)改變，以探討SARS-CoV-2非中和抗體造成CNS損傷的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：8周齡SPF級C57BL/6J，并雄鼠8只，購買于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心飼養(yǎng)。飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)為4只/籠，溫度區(qū)間為20～24 ℃，濕度區(qū)間為50%～70%，光照時間為8:00～20:00，自由飲水?dāng)z食。

1.1.2 主要藥品與試劑：血藍(lán)蛋白偶聯(lián)的S2-78多肽(keyhole limpet hemocyanin-S2-78,KLH-S2-78)(KLH-FKEELDKYFKNH，上海生工生物工程公司)；兔抗鼠離子化鈣結(jié)合適配分子(ionized calcium-binding adapter molecule 1,IBA1)多克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的驢抗鼠二抗(Abcam公司)；AlexaFluor?594熒光基團(tuán)標(biāo)記的驢抗山羊二抗(Thermo Fisher公司)；DMB顯色劑(北京索萊寶科技公司)；蔗糖、奎寧、鹽酸胱氨酸、牛血清白蛋白、吐溫20和磷酸鹽緩沖液(Sigma-Aldrich公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠免疫注射：按照50 μg/只的劑量使用KLH-S2-78免疫4只8周齡C57BL/6J小鼠作為實驗組(KLH-S2-78，KS)；按照50 μg/只的劑量使用KLH免疫4只8周齡C57BL/6J小鼠作為實驗對照組(KLH-Vehicle，KV)；無任何處理的2只8周齡C57BL/6J小鼠作為陰性對照組(Negative control，NC)。共免疫4次，前3次免疫間隔一周，第3次與第4次免疫間隔兩周(圖1A)。

1.2.2 前脈沖抑制(prepulse inhibition, PPI)：在25 min的測試過程中，實驗動物接受驚反射刺激(120 dB的白噪聲)、前脈沖刺激(70、75、80、85 dB的白噪聲)、前脈沖聯(lián)合驚反射刺激(70 dB、75 dB、80 dB、85 dB的前脈沖刺激及間隔100 ms的120 dB驚反射刺激)、恒定背景噪聲(65 dB的白噪聲)共4種模式的處理。實驗開始后，給予每只動物5 min適應(yīng)時間，之后每種類型的模式以假隨機(jī)的順序出現(xiàn)8次。每個模式間的間隔為15～25 s。每次測試后噴灑30%乙醇去除氣味并清理殘留物。

1.2.3 雙瓶偏好實驗：用50 mL離心管制成測試飲(糖/苦)水用瓶，每管盛有25 mL 1.5%蔗糖溶液(m/v)或25 mL奎寧溶液(1.5 mmol/L)。實驗總時間為4 d，測試前預(yù)適應(yīng)48 h，雙瓶飲水。為了防止實驗鼠飲(糖/苦)水位置偏好，在預(yù)適應(yīng)和正式檢測的24 h時間點都進(jìn)行糖水和苦水的位置交換。在預(yù)適應(yīng)48 h后，禁水24 h，記錄恢復(fù)飲水后2 h內(nèi)實驗鼠雙瓶偏好的實驗結(jié)果。通過前后稱取水瓶重量計算糖水、苦水以及液體總消耗量和糖水偏好百分比：糖水偏好百分比=糖水消耗(g)/(糖水消耗+苦水消耗)×100%

1.2.4 曠場實驗：將小鼠放入曠場正中心，進(jìn)行自發(fā)運動和焦慮樣行為測試，記錄小鼠10 min的行動軌跡，每次測試后噴灑30%乙醇去除氣味并清理殘留物。用Anymaze軟件分析小鼠曠場實驗結(jié)果。

1.2.5 食物小球埋藏實驗：將干凈的墊料均勻地鋪在籠盒里(約3 cm厚)，再將實驗用巧克力埋藏在墊料下約0.5 cm處使巧克力完全不可見。禁食24 h后將小鼠放在籠盒的正中央，按下計時器開始計時。當(dāng)小鼠找到巧克力并且開始吃的時候按下計時器停止計時,這段時間則是小鼠尋找巧克力的時間，記錄此數(shù)據(jù)用于統(tǒng)計分析。若小鼠在300 s內(nèi)都沒有找到巧克力，則停止計時，并記為300 s。

1.2.6 ELISA抗體效價水平檢測：每孔加入10 μg/L多肽溶液100 μL用于包被，漂洗3次后每孔加入200 μL鹽酸胱氨酸溶液用于封閉剩余的馬來酰胺基，漂洗3次后40 ℃烘干3 h封口避光保存。使用PBS稀釋待測血清樣本或質(zhì)檢血清樣本后，加入96孔板，每孔加入100 μL，并于37 ℃孵育2 h；漂洗3次后，加入HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG抗體(1∶40 000)，每孔100 μL，4 ℃孵育1 h；漂洗3次后每孔加入50 μL顯色劑室溫避光顯色10 min，每孔加入25 μL終止液后，用酶標(biāo)儀檢測A450吸光值(A)。 結(jié)果判定：待測孔A450/陰性孔≥2.1則為陽性孔，陽性孔血清的最大稀釋度即為待測樣品的滴度。

1.2.7 組織免疫熒光染色：犧牲小鼠后將腦組織制成2 μm的石蠟切片，在經(jīng)過脫蠟和抗原修復(fù)處理后，用5% BSA室溫封閉20 min；加入兔抗小鼠IBA1(1∶1 000)4 ℃孵育過夜；PBS漂洗3次后滴加二抗溶液(1∶1 000)，室溫避光孵育1 h。PBS漂洗3次后滴加DAPI染色8 min，用防熒光淬滅劑封片，使用正置顯微鏡觀察熒光結(jié)果。使用Image J對腦組織中的相關(guān)細(xì)胞進(jìn)行組織學(xué)定量分析。

2 結(jié)果

2.1 KLH-S2-78多肽免疫小鼠產(chǎn)生高滴度anti-S2-78 IgG抗體

經(jīng)總計9周的環(huán)境適應(yīng)、免疫建模和行為學(xué)表型檢測后犧牲小鼠，并留存外周血和大腦組織(圖1A)。ELISA檢測顯示，在1∶100滴度下，陰性對照組(NC)小鼠及實驗對照組(KLH-vehicle，KV)小鼠外周血血清中的anti-S2-78 IgG抗體信號均低于檢出判讀閾值(A450<0.2)。實驗組(KLH-S2-78，KS)小鼠外周血中檢出高滴度anti-S2-78 IgG抗體(最高滴度為25 600，A450=0.305 5)，顯著高于NC組和KV組(P<0 .0001)(圖1B)。

A.experimental workflow; B.serum anti-S2-78 IgG titers

2.2 KLH-S2-78多肽免疫小鼠出現(xiàn)精神病樣行為學(xué)改變

在驚嚇反射實驗中，KS小鼠的前脈沖抑制率(PPI%)較KV小鼠降低，在70-80 dB的預(yù)脈沖強(qiáng)度下均具有顯著性差異(P<0 .05)(圖2A)。

在糖水偏好實驗中，KS小鼠和KV小鼠的糖水?dāng)z取率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖2B)。在食物小球埋藏實驗中，KS小鼠的進(jìn)食潛伏期較KV小鼠顯著性增加[F(3，2)=9.04，P=0.027](圖2C)。

在開放曠場實驗中，KS小鼠進(jìn)入曠場中央?yún)^(qū)域的次數(shù)及停留時間均顯著低于KV小鼠(中央進(jìn)入次數(shù)：F(3，2)= 2.71，P=0.004 7；中央停留時間：F(3，2)=2.81，P=0.040)。KS小鼠在曠場中總運動距離較KV小鼠有一定下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖2D)。

A.startle reflex test; B.two-bottle choice test; C.buried food pellet test; D.open field test; *P<0.05, **P<0.01 compared with KLH-vehicle group

2.3 KLH-S2-78多肽免疫小鼠大腦中小膠質(zhì)細(xì)胞激活增加

腦組織免疫熒光染色顯示，在KS小鼠前額葉皮質(zhì)(prefrontal cortex,PFC)和海馬體(hippocam-pus,Hipp)中，單位面積(mm2)下Iba1+小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量較KV小鼠顯著性增多[PFC：F(3，2)=5.90，P=0.003；Hipp：F(3，2)= 1.94，P=0.027](圖3)。

PFC.prefrontal cortex; Hipp.hippocam-pus; *P<0.05 compared with KLH-vehicle group

3 討論

現(xiàn)有研究證據(jù)顯示，COVID-19患者體液免疫的病理性改變是導(dǎo)致患者不良預(yù)后的重要基礎(chǔ)。SARS-CoV-2感染后導(dǎo)致的系統(tǒng)性炎性反應(yīng)會在急性期誘發(fā)呼吸窘迫綜合征，而且患者在康復(fù)后仍長期處于免疫應(yīng)激狀態(tài)，這可能也是S蛋白線性表位抗體在患者體內(nèi)長期駐留的原因之一。本研究證實，S2-78線性多肽免疫小鼠后確實能夠?qū)е峦庵苎猘nti-S2-78 IgG抗體水平升高，模型小鼠表現(xiàn)出了感覺運動門控缺陷、嗅覺功能受損和自發(fā)活動能力受損的精神病樣行為學(xué)表型，同時大腦前額葉皮質(zhì)和海馬體中小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量顯著增加，處于中樞炎性反應(yīng)應(yīng)激狀態(tài)。但在糖水偏好實驗中，KLH-S2-78組小鼠和KLH組小鼠的糖水?dāng)z取率未見差異，表明S2-78多肽的免疫應(yīng)激并不影響小鼠的味覺感受，同時也表明實驗小鼠無抑郁相關(guān)的情緒類表型。

目前對于SARS-CoV-2相關(guān)非中和性“無效”抗體的可能生物學(xué)功能尚無定論，但推測，其可能通過交叉反應(yīng)識別與其線性表位同源性較高的內(nèi)源性蛋白，誘發(fā)自身免疫炎性反應(yīng)[5]。相關(guān)的臨床研究也支持了這一推論。血清學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)COVID-19患者體內(nèi)針對包括細(xì)胞因子、趨化因子、補(bǔ)體和細(xì)胞表面分子等主要類別免疫調(diào)控蛋白的自身抗體水平顯著上升，至少10%的危重癥患者出現(xiàn)高滴度的I型干擾素通路自身抗體[5]。這些自身抗體能夠通過抑制部分免疫信號通路受體、改變外周免疫細(xì)胞的組成從而干擾機(jī)體的免疫調(diào)控機(jī)制和病毒防御機(jī)制。

S2-78線性表位的同源性比對顯示，其與高等動物的FSTL1蛋白高度相似，與人源FSTL1的序列同源性達(dá)89%，與小鼠的同源性達(dá)87.5%。這種序列上的高度一致性提示anti-S2-78 IgG抗體可能會識別并拮抗內(nèi)源性的FSTL1蛋白。FSTL1是一個激活素結(jié)合蛋白，可通過激活NF-κB炎性信號通路導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎性反應(yīng)的發(fā)生，其蛋白產(chǎn)物被認(rèn)為是風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的自身免疫抗原，也是該疾病免疫療法研發(fā)的重要靶點[6]。此外，表達(dá)譜數(shù)據(jù)顯示，F(xiàn)STL1基因在大腦中廣泛表達(dá)[7]。除寡突膠質(zhì)細(xì)胞外，F(xiàn)STL1在神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中均有較高的表達(dá)豐度。因此，本研究推測，COVID-19患者中升高的anti-S2-78 IgG抗體有可能通過識別大腦中的FSTL1蛋白，從而激活了相應(yīng)的自身免疫炎性反應(yīng)通路，導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。

本研究具有一定的局限性。首先，外周中升高的anti-S2-78 IgG是否穿越血腦屏障影響中樞及其具體路徑有待進(jìn)一步探索。有臨床研究表明Lambert-Eaton肌無力綜合征患者外周血清中有針對GRP78的抗體，該抗體可誘導(dǎo)ICAM-1上調(diào)、claudin-5表達(dá)下調(diào)，從而引起血腦屏障通透性增加[8]。部分COVID-19患者會因為免疫系統(tǒng)過度活躍從而觸發(fā)“炎性因子風(fēng)暴”，導(dǎo)致正常情況下保護(hù)大腦的血腦屏障遭到破壞[9]。因此，COVID-19患者可能由于血腦屏障開放，導(dǎo)致包括anti-S2-78 IgG在內(nèi)的有害物質(zhì)進(jìn)入中樞，進(jìn)而損傷神經(jīng)系統(tǒng)，這需要進(jìn)一步的研究。其次，盡管有研究證實線性多肽表位的識別抗體能夠與同源性較高的線性表位發(fā)生交叉識別反應(yīng)[10]，但anti-S2-78 IgG是否與人FSTL1蛋白發(fā)生直接相互作用仍需進(jìn)一步證實。