金 濤，楊青山，吳樹金，朱曉燕，史宇悰，牛建雄，劉 林*

1.甘肅中醫(yī)藥大學 第一臨床醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730000； 2.甘肅省人民醫(yī)院 骨科，甘肅 蘭州 730000；3.蘭州大學 藥學院，甘肅 蘭州 730000

骨關節(jié)炎(osteoarthritis)是一種常見的以關節(jié)軟骨進行性退變?yōu)橹饕卣髀约膊　ｋS著骨關節(jié)炎的發(fā)展，其不僅會影響關節(jié)軟骨，還會影響軟骨下骨、關節(jié)囊、滑膜及關節(jié)周圍肌肉，對整個關節(jié)造成嚴重損害。根據(jù)預測到2030年時，骨關節(jié)炎的發(fā)病率將影響全球20%的成年人，并將很快成為導致殘疾的最大原因[1]。但是由于對骨關節(jié)炎發(fā)病機制的不了解，限制了對其早期的發(fā)現(xiàn)以及靶向治療，到晚期骨關節(jié)炎時患者將只能接受關節(jié)置換術的治療。

在真核細胞中，內質網(wǎng)是一個動態(tài)細胞器，負責蛋白質的合成、轉位、折疊和翻譯后修飾，其有效的功能對細胞內穩(wěn)態(tài)至關重要。在軟骨細胞中，內質網(wǎng)負責細胞外基質分子的合成和周轉。當細胞產(chǎn)生應激反應隨后引起內質網(wǎng)功能的紊亂，這一狀態(tài)被稱為內質網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress, ER stress)。一般來說， 軟骨細胞凋亡是骨關節(jié)炎發(fā)生和發(fā)展的重要過程，而內質網(wǎng)應激在調控軟骨細胞凋亡方面發(fā)揮了不可忽視的作用。因此本文將對內質網(wǎng)應激如何調控骨關節(jié)炎做一綜述，并總結從內質網(wǎng)途徑治療骨關節(jié)炎的可能方法。

1 內質網(wǎng)應激在骨關節(jié)炎中發(fā)揮的作用

關節(jié)軟骨主要由軟骨細胞和細胞外基質組成，是一種無血管的組織，因此軟骨細胞對潛在的缺氧以及營養(yǎng)物質的耗竭比較敏感。當發(fā)生骨關節(jié)炎時，關節(jié)軟骨原有的壓力和氧氣梯度被改變，軟骨細胞受到刺激后進到應激狀態(tài)，內質網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)隨之紊亂導致蛋白質在內質網(wǎng)中錯誤折疊并積聚，這一狀態(tài)即內質網(wǎng)應激。為了限制內質網(wǎng)應激的有害影響并恢復蛋白質穩(wěn)態(tài)，真核細胞具有一種進化上保守的適應性反應，即未折疊蛋白質應答(unfolded protein response，UPR)[2]。

內質網(wǎng)中的UPR主要由3種不同的信號蛋白質來介導，即肌醇需要蛋白1α(inositol-required enzyme 1 alpha, IRE1α)、蛋白激酶RNA樣內質網(wǎng)激酶(protein kinase-RNA-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)和激活轉錄因子6(activating transcrip-tion factor 6，ATF6)[3]。當未折疊或錯誤折疊的蛋白質在內質網(wǎng)管腔內積聚后，內質網(wǎng)應激隨之啟動，內質網(wǎng)傳感器感知應激信號，并與分子伴侶解離。解離的分子伴侶與未折疊或錯誤折疊的蛋白質結合，以修飾產(chǎn)生的蛋白質并降低內質網(wǎng)應激的程度。UPR中常用的分子伴侶系統(tǒng)主要包括免疫球蛋白重鏈結合蛋白(binding-immunoglobulin protein，Bip)、鈣網(wǎng)蛋白和蛋白質二硫鍵異構酶[4]。然而當內質網(wǎng)應激持續(xù)存在時，UPR將導致內質網(wǎng)功能障礙，從而激活相關的凋亡途徑來介導細胞死亡(圖1)。

圖1 未折疊蛋白質應答(UPR)的信號通路

1.1 IRE1調節(jié)相關通路致軟骨細胞凋亡

IRE1是一種具有絲氨酸/蘇氨酸激酶和核酸內切酶活性的雙酶，其有兩種亞型：IRE1α和IRE1β。當內質網(wǎng)應激發(fā)生后，分子伴侶Bip從IRE1α的管腔結構域中解離出來，促進其同源二聚和自磷酸化，并激活其激酶和核酸內切酶結構域。被激活的IRE1α以其底物X-box結合蛋白1(X-box binding protein1，XBP1)的信使RNA為標靶剪接出26個核苷酸，導致其翻譯框架移動，從而產(chǎn)生轉錄因子XBP1s[5]。這種轉錄因子可以進入細胞核，調節(jié)如內質網(wǎng)應激伴侶基因及內質網(wǎng)相關降解基因等的表達[6]，從而達到調節(jié)內質網(wǎng)應激的目的。在采用使內側半月板脫位模型小鼠研究創(chuàng)傷誘導的骨關節(jié)炎中，小鼠手術后Bip的表達顯著增加，清楚地表明內質網(wǎng)應激和UPR參與了骨關節(jié)炎的發(fā)病[7]。

IRE1α是一種具有腔內結構域和細胞質結構域的單一跨膜蛋白，它們在內質網(wǎng)膜的兩側執(zhí)行不同的任務[8]。在內質網(wǎng)應激下，細胞將啟動UPR以降低應激程度并減緩對細胞的損傷，IRE1α在此時表現(xiàn)出剪接XBP1的活性。但若內質網(wǎng)中蛋白質錯誤折疊速率超過了UPR所能承受的最大負荷，IRE1α在此時則表現(xiàn)為一種被稱為調節(jié)的IRE1依賴衰變(regulated IRE1-dependent decay,RIDD)的活性。剪接XBP1可以促進細胞生存，而RIDD則促進細胞凋亡[9]。在內質網(wǎng)應激時，RIDD主要通過降解編碼生存因子的信使RNA和針對促凋亡因子的microRNA來促進細胞凋亡。在骨關節(jié)炎中炎性因子的持續(xù)釋放導致慢性內質網(wǎng)應激，從而使大量錯誤折疊的蛋白質在內質網(wǎng)腔內積聚，進而主要通過IRE1α信號通路觸發(fā)軟骨細胞凋亡[10]。

此外，激活的IRE1α可通過其細胞質結構域與腫瘤壞死因子受體相關因子2(tumor necrosis factor receptor-associated factor 2，TRAF2)相結合，隨后再與凋亡信號調節(jié)激酶1(apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1)結合形成凋亡復合物。ASK1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可以激活下游的c-Jun氨基端激酶(c-jun n-terminal kinase，JNK)和p38通路。在人骨關節(jié)炎關節(jié)軟骨細胞中，活性JNK和活性p38的表達水平均高于正常軟骨，表明該通路與關節(jié)軟骨細胞死亡有關?；钴S的JNK通過調節(jié)B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，BCL-2)家族成員來施加凋亡信號。這些Bcl2家族成員活性的改變會激活促凋亡因子，將凋亡信號從內質網(wǎng)傳遞到線粒體，并通過caspases執(zhí)行細胞凋亡。在骨關節(jié)炎軟骨細胞中，BCL-2交互調節(jié)蛋白(BCL-2 interacting mediator,BIM)被JNK信號激活，并在軟骨退變過程中誘導軟骨細胞凋亡[11]。同樣，在骨關節(jié)炎患者的軟骨組織和培養(yǎng)的人骨關節(jié)炎軟骨細胞中，促凋亡的BCL-2相關X蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)的表達水平增加，這證明IRE1α-TRAF2-ASK1通路在軟骨細胞凋亡中發(fā)揮了不可忽視的作用。目前環(huán)狀RNA在軟骨細胞凋亡中的作用機制已成為研究熱點，在白細胞介素-1β誘導的軟骨細胞損傷模型中，環(huán)狀RNA-0114876可誘導TRAF2表達增加，而抑制環(huán)狀RNA-0114876可增強軟骨細胞活性，減輕炎性反應，減少細胞凋亡[12],環(huán)狀RNA可能通過IRE1α-TRAF2-ASK1信號通路來介導軟骨細胞凋亡。

1.2 PERK調節(jié)相關通路致軟骨細胞凋亡

PERK是一種定位于內質網(wǎng)的Ⅰ型跨膜蛋白，Bip與其管腔結構域的解離促進了其二聚化和自磷酸化。激活的PERK直接磷酸化真核細胞翻譯起始因子2(eukaryotic initiation factor 2，EIF2)的α亞基，隨后它可以抑制蛋白表達，并選擇性地增強內質網(wǎng)駐留伴侶蛋白的表達以及翻譯調節(jié)因子的表達[13]。骨關節(jié)炎軟骨細胞中PERK的減少會導致Ⅱ型膠原的表達減少以及Ⅰ型膠原的表達增加，而Ⅱ型膠原的減少和Ⅰ型膠原的增加正是已知的會導致關節(jié)軟骨功能減弱的重要原因[14]。

轉錄因子4(activating transcription factor 4，ATF4)是環(huán)磷酸腺苷反應元件結合蛋白家族的一個轉錄因子，作為PERK-EIF2α的下游因子，當EIF2α磷酸化時其被激活?？偟膩碚f，PERK介導的UPR有兩個不同的作用：一是減輕內質網(wǎng)在應激條件下的蛋白質合成超負荷，二是通過增加ATF4的產(chǎn)生來保護細胞免受各種內源性和外源性應激的影響。除此之外，ATF4還可誘導C/EBP 同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)的轉錄，CHOP是一種亮氨酸拉鏈轉錄因子,UPR的3條通路均能誘導CHOP的轉錄，但PERK-EIF2α-ATF4這條通路在對CHOP的轉錄中發(fā)揮了主要作用。在骨關節(jié)炎小鼠模型中，缺乏CHOP基因的小鼠的關節(jié)軟骨的退變和軟骨細胞凋亡較正常小鼠輕[15]，這表明CHOP介導的UPR加劇了骨關節(jié)炎。CHOP誘導細胞凋亡的機制之一是下調內質網(wǎng)膜上促生存蛋白BCL-2的表達，Bcl-2對細胞的保護作用是通過調節(jié)內質網(wǎng)及Ca2+水平來實現(xiàn)的，而這種活性則被JNK介導的磷酸化所抑制。CHOP還調節(jié)軟骨細胞中白細胞介素-1β(IL-1β)的凋亡和分解代謝反應，導致一氧化氮和基質金屬蛋白酶-13的上調，并抑制腺苷酸活化蛋白激酶的信號傳導，從而加劇骨關節(jié)炎的發(fā)生。

哺乳動物雷帕霉素復合物1靶基因(mammalian target of rapamycin complex 1，MTORC1)是EIF2α-ATF4信號的下游因子，當內質網(wǎng)應激發(fā)生時，其被激活并導致活化蛋白激酶B的磷酸化被抑制，使IRE1α-JNK通路被選擇性激活，進而導致細胞凋亡的發(fā)生[16]。在內質網(wǎng)應激的條件下，這種機制在骨關節(jié)炎顳下頜關節(jié)的軟骨細胞中是活躍的。在骨關節(jié)炎的早期階段，MTORC1在顳下頜關節(jié)軟骨細胞中被抑制，但當骨關節(jié)炎發(fā)展到晚期細胞凋亡占優(yōu)勢時，MTORC1被激活[17]。因此，抑制MTORC1為骨關節(jié)炎的預防和治療提供了一種潛在的治療策略。

1.3 ATF6相關通路

ATF6是一種Ⅱ型跨膜蛋白，其在哺乳動物中廣泛表達的有兩種亞型，即ATF6α和ATF6β。當內質網(wǎng)應激發(fā)生時Bip從其腔結構域解離，ATF6α從內質網(wǎng)移位到高爾基體，并被Site-1蛋白酶(site-1 pepsin，S1P)和Site-2蛋白酶(site-2 pepsin，S2P)切割。隨后其胞質部分片段被釋放并運輸?shù)郊毎?，并與內質網(wǎng)應激反應元件相結合來啟動XBP1的轉錄表達，以響應內質網(wǎng)應激。然而，敲除Atf6的骨關節(jié)炎小鼠關節(jié)軟骨正常，其骨關節(jié)炎發(fā)展的速度與未敲除Atf6的對照組的發(fā)展速度相同[7]，這表明ATF6在維持內質網(wǎng)穩(wěn)態(tài)方面可能只起到很小的作用。

2 從內質網(wǎng)途徑治療骨關節(jié)炎的總結

骨關節(jié)炎是一種多因素疾病，內質網(wǎng)應激誘導的軟骨細胞凋亡是其中的一個促成因素。因此，靶向內質網(wǎng)應激本身或干預UPR信號可能是未來骨關節(jié)炎治療的希望，以下將對這些潛在的靶點做一總結。

2.1 單一UPR通路的抑制劑

褪黑素是一種內質網(wǎng)應激抑制劑，可減弱內質網(wǎng)應激標志物的激活。最近的一項研究表明，褪黑素可顯著減輕博萊霉素誘導的小鼠肺組織EIF2α及IRE1α的磷酸化并抑制IRE1途徑的下游靶點JNK[18]。因此在軟骨細胞中褪黑素也可能作為一種潛在的藥物來減輕內質網(wǎng)應激從而達到治療骨關節(jié)炎的目的。姜黃素是一種抗氧化和抗感染藥物，可通過促進軟骨細胞中沉默信息調節(jié)因子 2 相關酶類 1的表達來調節(jié)PERK-EIF2α-CHOP通路， 可以使CHOP減少以及軟骨降解減慢，從而保護骨關節(jié)炎模型大鼠軟骨[19]。

2.2 小分子化學伴侶

4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid，4-PBA)是一種小分子化學伴侶，其能有效地擴散到軟骨外植體培養(yǎng)中，并以劑量依賴的方式減少軟骨細胞中過度的內質網(wǎng)壓力[20]。在大鼠交叉韌帶橫斷致骨關節(jié)炎模型中，灌胃給予4-PBA的大鼠表現(xiàn)出組織損傷減輕，內質網(wǎng)應激標志物如Bip及CHOP等的下調，細胞凋亡減少[21]。另一種具有類似作用的化學伴侶是?；撬崦撗跄懰幔闷涮幚淼墓顷P節(jié)炎軟骨細胞的內質網(wǎng)應激水平顯著下降[22]。

2.3 內質網(wǎng)相關降解和自噬的激活劑

海藻糖是由兩個葡萄糖分子組成的一個非還原性雙糖，它被認為可以加速自噬通量，同時減少軟骨細胞凋亡，從而減少骨關節(jié)炎軟骨的退化。研究表明在小鼠骨關節(jié)炎模型中，在飲用水中添加海藻糖顯著降低了小鼠的國際骨關節(jié)炎研究協(xié)會(Osteoarthritis Research Society International，OARSI)評分和滑膜炎嚴重程度評分。此外，海藻糖還能減少細胞凋亡，降低凋亡標志物蛋白的水平，如裂解的caspase-3、細胞色素C和CHOP[23]。

3 問題與展望

關節(jié)軟骨主要由軟骨細胞和細胞外基質組成，在內質網(wǎng)應激的壓力下細胞外基質中的膠原蛋白是如何調節(jié)還需要進一步的闡明。此外，軟骨細胞在內質網(wǎng)應激下UPR從促進生存的信號轉為促進凋亡信號的具體臨界值也尚不清楚。激活轉錄因子6β(activating transcription factor 6β，ATF6β)是ATF6在軟骨細胞中的另一種表型，其生長板軟骨細胞中能夠控制軟骨細胞的增殖和聚集聚糖酶的表達，而這兩個過程可以也參與了骨關節(jié)炎的發(fā)病，未來的研究應進一步闡明其具體機制。因此，未來可通過體內外實驗尋找更多調控內質網(wǎng)應激所引起的軟骨細胞凋亡的蛋白及基因，并能夠以此為靶點，在骨關節(jié)炎引起關節(jié)軟骨的結構變化及功能障礙之前準確診斷和治療骨關節(jié)炎。