陳子嫣 趙鶴翔 賈 妮 葛振林

牙齒的缺失常常給人們的口腔健康、功能、美觀造成影響，缺失牙如何修復(fù)一直是口腔研究領(lǐng)域中備受關(guān)注的熱點(diǎn)之一。目前，隨著生物技術(shù)和組織工程學(xué)的不斷發(fā)展，用干細(xì)胞構(gòu)建組織工程化牙齒，從而實(shí)現(xiàn)牙體組織再生的技術(shù)受到越來越多的青睞和關(guān)注。神經(jīng)嵴細(xì)胞作為胚胎發(fā)育早期出現(xiàn)的高度遷移性干細(xì)胞群，其遷移、分化和牙齒的發(fā)生和發(fā)育密不可分。牙齒的發(fā)育主要與外胚間充質(zhì)細(xì)胞和外胚層表面上皮細(xì)胞之間的相互作用有關(guān)，這些相互作用主要通過骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、音猬因子同族體超家族（sonic hedgehog， SHH），成纖維生長因子超家族（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF），Wnt 信號通路等保守的信號途徑介導(dǎo)[1∽4]，并且與神經(jīng)嵴細(xì)胞的遷移分化及定位息息相關(guān)。發(fā)育生物學(xué)顯示牙本質(zhì)、牙髓等牙齒結(jié)構(gòu)主要來源于由胚胎發(fā)育期出現(xiàn)的神經(jīng)嵴細(xì)胞（neural crest cells，NCCs）所演化成的外胚間充質(zhì)組織[5,6]，這其中主要涉及NCCs 的遷移分化、頜骨定位及復(fù)雜的分子調(diào)控過程。本文主要從神經(jīng)嵴細(xì)胞的遷移分化、頜骨定位等方面系統(tǒng)地回顧了神經(jīng)嵴細(xì)胞在牙齒發(fā)生發(fā)育過程中的作用，并簡要概述了神經(jīng)嵴細(xì)胞在成牙向分化過程中可能的分子通路。

一、神經(jīng)嵴細(xì)胞的遷移分化與牙齒的發(fā)生

NCCs在胚胎發(fā)育的第三周出現(xiàn)，是胚胎發(fā)育過程中短暫出現(xiàn)于神經(jīng)上皮與上皮前體之間的具有高度遷移性的細(xì)胞群，遷移初期NCCs與其他神經(jīng)上皮細(xì)胞失去聯(lián)系，完成部分或完全的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換（epithelial-mesenchymal transition，EMT），形成可以在形態(tài)上識別的單個(gè)或成群的遷移細(xì)胞，之后沿著確定的路徑遷移并定居于不同的區(qū)域，最終分化成為各種各樣的衍生物[7]。Zhang 等[8]用LacZ 報(bào)告的標(biāo)記NCCs 基因的轉(zhuǎn)基因方法，證明了NCCs 離開神經(jīng)褶皺之后通過腹側(cè)遷移參與第一鰓弓的形成。Yuan 等[9]用單細(xì)胞RNA 測序分析證明了NCCs進(jìn)入第一鰓弓后的動(dòng)態(tài)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，并且通過腹側(cè)的分層遷移實(shí)現(xiàn)了NCCs的分化異質(zhì)性。

牙齒的發(fā)生主要依賴于牙源性上皮與外胚間充質(zhì)的相互作用[6]。通過NCCs 標(biāo)記示蹤法證明了牙髓、牙本質(zhì)、牙骨質(zhì)等外胚間充質(zhì)發(fā)育產(chǎn)物均是由NCCs 衍生細(xì)胞所產(chǎn)生的[5]，同時(shí)在NCCs 所衍生的外胚間充質(zhì)中表達(dá)的同源盒基因的組合作用被認(rèn)為是決定牙齒形態(tài)、大小、位置的因素[10]。

二、神經(jīng)嵴來源的外胚間充質(zhì)細(xì)胞在牙齒發(fā)育過程中的位置確定

在NCCs 遷移形成外胚間充質(zhì)的過程中通過同源盒基因的組合作用來確定上下頜弓的牙區(qū)、無牙區(qū)、磨牙區(qū)、切牙區(qū)的具體位置關(guān)系。

1.牙板位置的確定

對控制牙板發(fā)育的空間模式和細(xì)胞機(jī)制現(xiàn)有研究較少。在小鼠牙齒模型中，胚胎發(fā)育第9 天，在FGF8 的誘導(dǎo)下Lhx6和Lhx7作為牙齒形成的原始標(biāo)記僅表達(dá)于第一鰓弓口部的外胚層中[11]；胚胎發(fā)育第11 天，口腔上皮增厚，牙軸在第一鰓弓上形成。在牙齒發(fā)育跡象出現(xiàn)前Pixt2作為牙齒發(fā)育的第一個(gè)轉(zhuǎn)錄標(biāo)記在上下頜弓近遠(yuǎn)端和口腔外胚層中出現(xiàn)[12,13]，當(dāng)Pax9高表達(dá)的區(qū)域限制性出現(xiàn)成排排列的牙板結(jié)構(gòu)形成未來牙弓后定位于牙齒形成的部位[14]，Pixt2和Pax9均與FGF8 和BMP4 的拮抗作用調(diào)節(jié)有關(guān)，由此推斷牙板位置可能是由兩種不同類型的信號分子的組合共同決定的。同時(shí)在對乳腺的發(fā)育研究中表明，未來腺體的正確定位取決于沿背腹軸存在的不同發(fā)育閾值的各種分子網(wǎng)絡(luò)[15]，由此Balic 認(rèn)為[3]牙板的發(fā)育的空間模式也受到類似的分子機(jī)制調(diào)控，即在發(fā)育中的頜骨沿背腹軸形成梯度來確定未來牙列的位置。

2.牙齒類型的確定

關(guān)于牙齒類型的確定在早期的研究中有兩種理論：發(fā)生域理論（在頜骨未來牙弓所在的位置上存在近端磨牙，遠(yuǎn)端切牙的牙軸，牙齒的類型沿這個(gè)牙軸確定）[16]和克隆理論（預(yù)編程細(xì)胞的單個(gè)克隆可以通過誘導(dǎo)牙板啟動(dòng)特定類別的所有牙齒的發(fā)育，隨著細(xì)胞克隆向遠(yuǎn)端增長的過程中，牙蕾形成，其周圍被抑制圈環(huán)繞，以限制其他牙齒的發(fā)育，直到克隆細(xì)胞充分移動(dòng)為止）[17]。但隨著同源盒基因的研究不斷進(jìn)展[10]，可以認(rèn)為發(fā)生域理論和克隆理論應(yīng)該是相輔相成的，與之相關(guān)的有Dlx、Barx、Msx、Alx等基因家族[10,18,19]。其中Dlx基因家族在上、下頜骨的結(jié)構(gòu)區(qū)分及磨牙的發(fā)育中起到重要的作用。在小鼠實(shí)驗(yàn)中，上頜弓Dlx1/Dlx2表達(dá)陽性，Dlx5/Dlx6表達(dá)陰性，下頜弓Dlx1/Dlx2和Dlx5/Dlx6均表達(dá)陽性，當(dāng)敲除Dlx1/Dlx2時(shí)上頜磨牙完全缺失，但下頜磨牙及切牙完好[18]，因此推斷Dlx1/Dlx2基因?qū)τ谏项M磨牙的影響更大，下頜磨牙的完好有可能是Dlx5/Dlx6基因的補(bǔ)償作用[12]。Barx基因家族與磨牙的形成有關(guān)—主要是Barx1，在前磨牙和磨牙的結(jié)構(gòu)域中均有Barx1的表達(dá)，同時(shí)在雪豹胚胎實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)Barx1的遠(yuǎn)端極限接近頜弓遠(yuǎn)端，相對的Barx1陰性區(qū)域較小，由此推斷Barx1與食肉動(dòng)物的進(jìn)化趨勢有關(guān)[10]。Msx 基因家族對NCCs 的增殖分化及牙齒的正常發(fā)育至關(guān)重要。當(dāng)敲除Msx1和Msx2之后磨牙和前牙的發(fā)育均會停止[12]，并且Msx1缺失的患者以第二前磨牙的缺失為主要表現(xiàn)[20]。Alx基因家族在NCCs 的早期遷移及切牙發(fā)育相關(guān)。Alx3在額鼻突中表達(dá)明顯[19]，且在切牙的結(jié)構(gòu)域顯示Alx3陽性[10]。進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)這些基因之間的存在與否對于牙齒類型的確定同樣重要，并且不同基因之間存在重疊區(qū)域，共同決定一定區(qū)域中牙齒的結(jié)構(gòu)形態(tài)[10]。而在間質(zhì)中BMP4 調(diào)節(jié)的Wnt∕β-catenin 信號，對于早期牙齒形態(tài)和順序牙齒的形成至關(guān)重要[3]，并且Jarvinen等[21]研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)中的低Wnt∕β-catenin 信號是繼發(fā)牙齒萌芽的先決條件。

三、神經(jīng)嵴來源的外胚間充質(zhì)細(xì)胞在形成相關(guān)牙性組織過程中的信號通路

1.FGF信號通路

成纖維生長因子超家族（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）是一種含有保守氨基酸序列的多肽類物質(zhì)，在哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育過程中大約檢測出了23個(gè)相關(guān)成員，大部分成員均參與了牙齒的發(fā)育過程，其中FGF3、FGF4、FGF8、FGF9、FGF10 是牙齒發(fā)生的關(guān)鍵信號分子[2,22]。FGF3 和FGF10 主要參與牙胚從蕾狀期向帽狀期的轉(zhuǎn)變過程，缺失FGF3和FGF10的小鼠模型多表現(xiàn)出牙齒體積減少，牙尖數(shù)量減少，頸環(huán)結(jié)構(gòu)無法形成等癥狀；FGF8是誘導(dǎo)牙胚發(fā)育的起始因子之一，參與誘導(dǎo)Lhx6、Lhx7、Pax9、Pitx2等基因的表達(dá)[22]，敲除FGF8的小鼠第一鰓弓大部分結(jié)構(gòu)缺失，而外源性FGF8 可以誘導(dǎo)退化牙胚體外成牙[23]；FGF4、FGF9 和FGF20 參與釉結(jié)的形成，調(diào)控牙齒的形態(tài)和牙尖的形成[22]。此外也有研究表明在NCCs 向外胚間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程中可能存在有來自咽上皮的FGF 信號分子的參與，但具體的分子通路還尚不明確[24]。

2.BMP信號通路

骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）是少數(shù)在上皮和間充質(zhì)組織之間傳遞雙向信號信號通路之一，在牙齒的的多個(gè)階段都起著重要的的作用。BMP 的傳導(dǎo)途徑有依賴Smad 的經(jīng)典通路和不依賴Smad 的非經(jīng)典通路兩種[25]。在小鼠實(shí)驗(yàn)研究中，發(fā)現(xiàn)BMP2、BMP4 協(xié)同F(xiàn)GF8 共同作用誘導(dǎo)Pax9，Pitx2 等基因的表達(dá)，參與牙胚在頜骨上的定位；在牙胚發(fā)育初期BMP4 調(diào)節(jié)Msx1、Msx2的表達(dá)，激活Tbx2從而誘導(dǎo)BMP4向間充質(zhì)轉(zhuǎn)移表達(dá)，以激活NCCs 衍生間充質(zhì)的牙源性潛力[3]。在牙胚自蕾狀期向帽狀期轉(zhuǎn)變的過程中，與BMP4 相似，BMP3 和BMP7 同樣表達(dá)上調(diào)[26]，BMP4、BMP3 和BMP7 的上調(diào)表達(dá)提示其活躍表達(dá)與牙胚的發(fā)育相關(guān)。有實(shí)驗(yàn)顯示，在牙齒的早期礦化期間BMP2 的存在與否與成釉細(xì)胞的分化及成牙本質(zhì)細(xì)胞的組織分化存在一定的聯(lián)系，并且BMP2 的缺失會導(dǎo)致成熟牙齒牙釉質(zhì)和牙本質(zhì)的量減少[27]。Mu 等[28]發(fā)現(xiàn)BMP2 和BMP4 在維持牙根發(fā)育過程中上皮-間充質(zhì)之間的相互作用至關(guān)重要，并且這是保證形成牙本質(zhì)細(xì)胞分化和成熟所必須的。

3.Wnt信號通路

Wnt 信號通路在組織、器官的生長發(fā)育過程中的作用十分重要，參與細(xì)胞的增殖，分化，凋亡等基本活動(dòng)。在牙齒發(fā)育過程中，Wnt主要在參與上皮-間充質(zhì)之間的信息傳導(dǎo)并參與調(diào)控牙齒的形態(tài)和數(shù)量[29]。在哺乳動(dòng)物牙胚從蕾狀期向帽狀期發(fā)育的過程中，牙源性上皮中的Wnt2，LEF1，TCF7 等Wnt 信號通路的成員的上調(diào)表達(dá)較其他信號通路多，同時(shí)Wnt信號通路的抑制性成員的表達(dá)下調(diào)[26]，提示W(wǎng)nt信號通路對于牙胚發(fā)育早期有著關(guān)鍵作用；在牙胚從鐘狀早期向鐘狀末期的發(fā)育過程中，Wnt2 的上調(diào)和Wnt9 的下調(diào)對于牙齒形態(tài)的發(fā)生也起著積極的作用，并且Wnt 通路信號部分成員不對稱分布造成的微調(diào)作用也許與牙齒頰舌側(cè)位置的確定相關(guān)[2,26]。在小鼠模型中顯示NCCs 衍生的間充質(zhì)中Wnt∕βcatenin 信號的低表達(dá)與牙列的延續(xù)性發(fā)展緊密相關(guān)，強(qiáng)行激活Wnt∕β-catenin 通路會導(dǎo)致第二磨牙及第三磨牙的缺失[21]。在NCCs的體外成牙試驗(yàn)中，成牙組也檢測到了Wnt 通路的表達(dá)[30]，進(jìn)一步證實(shí)了Wnt信號通路在牙齒發(fā)育過程中起到重要的作用。

4.SHH信號通路

SHH 信號是HH 家族中的一種分泌型多肽，SHH 也是通過上皮-間質(zhì)間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)牙齒的形態(tài)發(fā)生[31]，并在牙齒發(fā)育的不同階段扮演著不同的角色。Dacosta 等[32]在鵪鶉胚胎視線中發(fā)現(xiàn)，在NCCs遷移至第一鰓弓過程中，SHH參與協(xié)調(diào)并促進(jìn)NCCs 的存活及其多能性的維持。在牙齒發(fā)育的開始階段，可以在增厚的上皮組織中檢測到SHH 的高表達(dá)[33]。在牙冠形成階段，抑制SHH 信號的同時(shí)成釉細(xì)胞的分化也會受到抑制，從而導(dǎo)致正常牙齒形態(tài)的破壞[34]。也有研究表明，牙冠的大小取決于表達(dá)SHH 的內(nèi)釉上皮和間充質(zhì)之間的接觸面積大小[35]。在牙根形成階段，SHH 信號的缺失會造成牙根牙本質(zhì)的形成失敗，進(jìn)而導(dǎo)致牙根形成缺陷[36]。有研究表明當(dāng)GAS1 缺乏時(shí)可導(dǎo)致SHH 表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致多生牙的形成[3]，因此，對于SHH 信號在牙齒形成過程中的具體作用仍然還需要進(jìn)一步探究。

5.其他信號通路

Hippo 通路主要通過負(fù)調(diào)節(jié)Yap 效應(yīng)器和Taz（轉(zhuǎn)錄共激活因子）參與神經(jīng)嵴細(xì)胞的分化和牙齒形態(tài)的調(diào)節(jié)。小鼠模型中顯示Yap 和Taz 的過表達(dá)會導(dǎo)致牙齒形態(tài)的缺陷，而敲除Yap 的小鼠表現(xiàn)出神經(jīng)嵴細(xì)胞的異常分化[37]。同時(shí)，在NCCs的體外成牙實(shí)驗(yàn)中也檢測出Hippo 通路的表達(dá)[30]。Smad4 是TGF-β∕BMP 的共同介質(zhì)，其參與NCCs 向成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化、牙本質(zhì)的形成及TGF-β∕BMP 與Wnt信號之間的相互作用[38]。NCCs 來源的間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)外的成牙能力較非神經(jīng)嵴來源的間充質(zhì)干細(xì)胞更好，也有可能是由以Smad4 為核心的TGF-β∕Smad4 信號介導(dǎo)所導(dǎo)致[39]。Runx2 與BMP、Wnt 等信號通路的信號傳遞有著密切的關(guān)系[40]，Yu 等[13]發(fā)現(xiàn)BMP信號可通過Runx2依賴途徑影響牙齒的正常發(fā)育，而Runx2 缺失和重復(fù)則可能導(dǎo)致牙齒結(jié)構(gòu)的異常[41]。

四、神經(jīng)嵴細(xì)胞與牙再生研究展望

由于NCCs 的多能分化潛能[42]及其在牙齒發(fā)生發(fā)育過程中的重要地位[5]，在牙齒再生領(lǐng)域NCCs 也是一個(gè)很有趣的細(xì)胞模型。有研究利用8 周齡的小鼠建立了FGF8和牙本質(zhì)非膠原蛋白（DNCP）定向作用的NCCs 體外模型，實(shí)現(xiàn)了NCCs 向第一鰓弓外胚層細(xì)胞和成牙本質(zhì)樣細(xì)胞的分化[43]；也有研究表明將NCCs 與無成牙能力的小鼠牙胚上皮重組后置于小鼠腎包膜下培養(yǎng)可以形成較為完整的牙齒結(jié)構(gòu)[30]；Zhang 等[44]在最近的研究中發(fā)現(xiàn)NCCs 與小鼠口腔上皮組織重組后可以在體外分化形成成牙本質(zhì)細(xì)胞，并參與牙胚的形成，同時(shí)在裸鼠體內(nèi)植入經(jīng)過處理的人牙支架與NCCs 后可以形成組織良好的血管化牙本質(zhì)-牙髓復(fù)合體，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明了NCCs 將可能成為牙組織∕牙齒器官再生應(yīng)用中有希望的細(xì)胞來源。

由于神經(jīng)嵴在脊椎動(dòng)物中是暫時(shí)的胚胎結(jié)構(gòu)，有報(bào)道指出人神經(jīng)嵴干細(xì)胞仍然存在于牙齦、骨髓和牙周組織，目前的技術(shù)方法分離出大量用于研究基于干細(xì)胞的牙齒發(fā)育和再生的初級NCCs 比較困難[44]，但也有研究通過修改用于人胚胎干細(xì)胞的方法，將人乳牙牙髓來源的多能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為NCCs[45]。

NCCs 是一種胚胎干細(xì)胞，可以分化形成牙齒，但與此同時(shí)也可以分化形成其他組織結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)其成牙向分化的具體通路還尚不明確，并且在成牙向分化過程中誘導(dǎo)形成成釉細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞等功能細(xì)胞的介導(dǎo)因素也未可知。