李成華，付艷艷，薛長松*，陳建宇，朱芳嬈

（1.通化師范學(xué)院長白山優(yōu)勢生藥資源開發(fā)與利用實驗室，吉林 通化 134001；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腎病科，吉林 長春 130021）

酸 漿 [Physalis alkekengi L.var.franchetii（Mast.）Makino]別名紅姑娘、燈籠草、菇蔫兒、姑娘兒、掛金燈，原產(chǎn)于我國，主要分布在吉林、遼寧、黑龍江、內(nèi)蒙古、四川、西藏等地[1]，是藥食兩用植物[2]。酸漿宿萼（果萼）性味甘、酸、性寒，有清涼、消腫、利尿等功效，糖尿病患者常用其代茶飲，能對血糖調(diào)節(jié)起到較好效果[3]。酸漿苦素是酸漿中一類重要的生物活性物質(zhì)。酸漿苦素A通過遏制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和抑制轉(zhuǎn)錄激活因子相關(guān)通路起到抗肺部腫瘤作用[4]。酸漿苦素A可以激活Nrf2以及靶基因來誘導(dǎo)醌還原酶的表達(dá)，而具有預(yù)防肝病以及癌癥的潛能[5]。酸漿苦素B能明顯抑制人乳腺癌細(xì)胞增殖、改變線粒體的膜電位和細(xì)胞活性氧水平、促進(jìn)細(xì)胞凋亡[6]。酸漿苦素B、D、J和P能抑制和殺滅枯草芽孢桿菌等，具有較好的抗菌作用[7]。酸漿提取物能夠抑制高血糖標(biāo)準(zhǔn)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和凋亡，而具有明顯的抗糖尿病活性[8]。

低共熔溶劑[9]（deep eutectic solvents，DESs）作為新型共熔混合溶劑，具有制備方法簡單、毒性低或無毒、生物相容性、生物可降解、可回收等多種優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為一種新型的離子液體取代劑。DESs的相關(guān)研究還是新興領(lǐng)域，正處在初步發(fā)展的階段。DESs通過與溶劑形成氫鍵可以表現(xiàn)出極其強(qiáng)大的溶解性。DESs的特殊溶解性為提取活性物質(zhì)提供了新鮮的有效途徑。DESs提取的銀杏萜烯內(nèi)酯[10]、核桃青皮多酚[11]、黃芩苷[12]均證明了該提取條件的切實可行性。超聲輔助提?。╱ltrasonic-assisted extraction，UAE）是一種高效的萃取技術(shù)，能夠減少溶劑及能量損耗，縮減提取時間[13]。超聲波輔助提取菊芋花青素[14]、七葉蓮多酚[15]均取得了較好的提取效果。因此，DESs-UAE提取植物中功能性成分成為新穎的高效提取手段。

甲醇提取是酸漿苦素的傳統(tǒng)提取方法[16-17]，甲醇有毒性，而DESs是一種新類型綠色溶劑。DESs-UAE提取酸漿宿萼中酸漿苦素提取工藝參數(shù)匱乏且有關(guān)酸漿苦素降糖活性研究甚少。本研究以酸漿宿萼為原料，采用DESs-UAE將酸漿苦素從原料組織中釋放出來，利用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，通過對α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶的抑制能力評價酸漿苦素體外降糖活性，為進(jìn)一步開發(fā)酸漿活性成分提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸漿宿萼：采自通化市，30℃低溫烘干，粉碎過60目篩，備用。

β-谷甾醇對照品：中國食品藥品檢定研究院；α-淀粉酶≥10 000 U/g、α-葡萄糖苷酶、磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）≥50 U/mg：上海伊卡生物技術(shù)有限公司；尿素、葡萄糖、甲醇（均為分析純）：天津市百世化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV1900紫外可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；JA5003N型電子天平：上海菁海儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；Thermo Forma酶標(biāo)儀：美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 酸漿苦素的提取

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：甲醇超聲溶解β-谷甾醇對照品1.0 mg并定容于5 mL容量瓶中，得0.2 mg/mL β-谷甾醇對照品貯備液，于波長200 nm～1 000 nm掃描，優(yōu)選386 nm 為測定波長[18]。用甲醇定容，配制 0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL系列濃度對照品溶液于容量瓶中，于優(yōu)選的波長處測量吸光度，甲醇作參比，以吸光度A對濃度C做回歸方程得A=0.791 7C-0.051 2，R2=0.999 3。結(jié)果顯示，β-谷甾醇對照品溶液在0.1 mg/mL～1.0 mg/mL具備良好線性關(guān)系。

低共熔溶劑的制備及其低共熔溶劑體系的選擇：氯化膽堿參考司悅悅[19]的方法測定，分別與乳酸、尿素、1，4-丁二醇、檸檬酸、葡萄糖按一定摩爾比混合，置于85℃水浴中長時間攪拌至混合物清澈透明。具體低共熔溶劑的分類及摩爾比例見表1。

表1 低共熔溶劑的種類及比例Table 1 Types and ratios of deep eutectic solvents

樣品中酸漿苦素的含量測定：取酸漿宿萼粉末1.0g于燒瓶中，料液比按照1∶20（g/mL）加入含水率20%的低共熔溶劑（低共熔溶劑16 mL+蒸餾水4 mL），80℃下超聲30 min，萃取液用微孔膜過濾，即得酸漿苦素提取液。準(zhǔn)確吸取酸漿苦素樣品溶液2 mL于離心管中，加入石油醚2 mL，渦旋10 min，去石油醚層，加入乙酸乙酯2 mL，渦旋10 min，取乙酸乙酯層吹干，加入甲醇完成純化于與5mL容量瓶中定容，在波長386nm處測吸光度[20]，求出濃度，計算出酸漿苦素提取量（mg/g）。

1.3.2 單因素試驗

在超聲功率200 W、含水量30%、超聲時間40 min的條件下，考察料液比[1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1∶25（g/mL）]對酸漿苦素提取量的影響；在料液比1∶10（g/mL）、含水量 30%、超聲時間 40 min的條件下，考察超聲功率（150、200、250、300、350 W）對酸漿苦素提取量的影響；在料液比1∶10（g/mL）、超聲功率300 W、超聲時間40 min的條件下，考察含水量（10%、20%、30%、40%、50%）對酸漿苦素提取量的影響；在料液比1∶10（g/mL）、超聲功率300 W、含水量20%的條件下，考察超聲時間（10、20、30、40、50 min）對酸漿苦素提取量的影響。每組均進(jìn)行3次平行試驗。

1.3.3 優(yōu)化超聲輔助低共熔溶劑提取條件

依據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇料液比（A）、超聲功率（B）、超聲時間（C）、含水量（D）4個因素，利用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助低共熔溶劑提取酸漿苦素工藝條件。以樣品酸漿苦素提取量為響應(yīng)值（Y）進(jìn)行試驗設(shè)計，因素水平見表2。

表2 因素水平設(shè)計Table 2 Factors and levels of test design

1.3.4 降糖活性測定

制備 0.062 5、0.125、0.25、0.5、1 mg/mL 的酸漿苦素樣品溶液，0.031 25、0.062 5、0.125、0.25、0.5 mg/mL 的阿卡波糖陽性對照溶液，進(jìn)行酸漿苦素體外降糖活性研究。

1.3.4.1 對α-葡萄糖苷酶的抑制能力測定

抑制α-葡萄糖苷酶試驗設(shè)計見表3。

表3 抑制α-葡萄糖苷酶試驗設(shè)計Table 3 Experimental design for α-glucosidase inhibition

參照表3完成相關(guān)試驗，其中加入樣品和對硝基苯基-β-D吡喃葡萄糖苷后分別在37℃反應(yīng)15 min，加入碳酸鈉終止反應(yīng)后，于540 nm處檢測吸光度，計算IC50值。

α-葡萄糖苷酶的抑制率/%=[A對照-（A樣品-A空白）]/A對照×100

式中：A對照為對照組吸光度；A樣品為樣品組吸光度；A空白為空白組吸光度。

1.3.4.2 對α-淀粉酶的抑制能力測定

抑制α-淀粉酶試驗設(shè)計見表4。

表4 抑制α-淀粉酶試驗設(shè)計Table 4 Experimental design for α-amylase inhibition

參照沈鵬等[21]的方法制備3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）溶液。參照表4進(jìn)行相關(guān)試驗，其中加入α-淀粉酶后在37℃反應(yīng)10 min，加入DNS后，于540 nm處檢測吸光度，計算IC50值。α-淀粉酶的抑制率計算公式如下。

α-淀粉酶的抑制率/%=[（A對照-A空白對照）-（A樣品-A樣品對照）]/（A對照-A空白對照）×100

式中：A對照為對照組吸光度；A樣品為樣品組吸光度；A空白對照為空白對照組吸光度；A樣品對照為樣品對照組吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用 Design-Expert 8.0.6、Excel、SPSS13.0 軟件處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 最優(yōu)低共熔溶劑的篩選

氯化膽堿和有機(jī)酸、胺、糖和多元醇按相應(yīng)的摩爾比配制5種類型的DESs。常溫下，DESs均呈清澈透明狀，考慮DESs黏度對提取物的作用效果，酸漿苦素提取所選取的DESs含水量為20%。以75%乙醇做參比[22]，不同DESs對酸漿苦素提取量的影響如圖1所示。

圖1 不同溶劑對酸漿苦素提取量的影響Fig.1 Effect of different solvents on physalin yield

由圖1可知，在5種DESs中，氯化膽堿∶葡萄糖=2∶1（摩爾比）合成的DESs-5提取效果最好，酸漿苦素提取量為（6.37±0.19）mg/g。這可能是由于氯化膽堿、葡萄糖合成的DESs-5與酸漿苦素的極性更接近。DESs組酸漿苦素提取量高于75%乙醇組可能由于DESs能與酸漿苦素之間形成更強(qiáng)烈的氫鍵作用[23]。優(yōu)選氯化膽堿∶葡萄糖=2∶1（摩爾比）制備的DESs-5用于后續(xù)的提取工藝優(yōu)化。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 料液比對酸漿苦素提取量的影響

料液比對酸漿苦素提取量的影響見圖2。

圖2 料液比對酸漿苦素提取量的影響Fig.2 Effect of solid-to-liquid ratio on physalin yield

由圖2可知，一定范圍內(nèi)酸漿苦素提取量隨著DESs體積的增加而增加，提取溶劑量的增加，能夠增加酸漿宿萼和溶劑之間酸漿苦素的濃度差，從而提升傳質(zhì)推動力，有益于酸漿苦素的溶出[24]。DESs體積過大導(dǎo)致酸漿苦素提取量下降，可能是隨著提取溶劑的增加，酸漿苦素被充分浸提，當(dāng)料液比達(dá)到1∶10（g/mL）而繼續(xù)增加溶劑體積時，超聲波能量作用在物料上相對減少，在溶劑上相對增加，從而導(dǎo)致酸漿苦素提取量下降[25]。因此，選擇料液比 1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15（g/mL）進(jìn)行后續(xù)試驗。

2.2.2 超聲功率對酸漿苦素提取量的影響

超聲功率對酸漿苦素提取量的影響見圖3。

圖3 超聲功率對酸漿苦素提取量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on physalin yield

由圖3可知，酸漿苦素提取量隨著超聲功率的增加呈先上升后下降的趨勢。超聲功率為300 W時，酸漿苦素提取量達(dá)到最高，隨后開始下降。這可能與超聲振動能產(chǎn)生空化和剪切效應(yīng)有利于內(nèi)容物釋放有關(guān)，但超聲功率過大，反而破壞內(nèi)容物結(jié)構(gòu)[26]。因此，選擇超聲功率為250、300、350 W進(jìn)行后續(xù)試驗。

2.2.3 低共熔溶劑含水量對酸漿苦素提取量的影響

低共熔溶劑含水量對酸漿苦素提取量的影響見圖4。

圖4 含水量對酸漿苦素提取量的影響Fig.4 Effect of water content on physalin yield

由圖4可知，含水量為20%時，酸漿苦素提取量達(dá)到最高。DESs含水量的多少與DESs的黏度和極性有關(guān)，進(jìn)而影響DESs的提取性能[27]。分析原因可能是水的加入降低了DESs的黏度。適當(dāng)降低黏度能夠有效提升傳質(zhì)速率，增進(jìn)內(nèi)容物的溶出。當(dāng)含水量大于20%時，酸漿苦素提取量走勢下降。DESs含水量過大會削弱甚至損害氫鍵供體和氫鍵受體之間的氫鍵作用，進(jìn)而損壞DESs的超分子結(jié)構(gòu)，使有效溶劑DESs的含量減低，從而導(dǎo)致酸漿苦素得率降低[25]。因此，選擇含水量15%、20%、25%進(jìn)行后續(xù)試驗。

2.2.4 超聲時間對酸漿苦素提取量的影響

超聲輔助提取工藝耗時短、效率高，適用于DESs等溶劑提取中藥成分[28]。超聲時間也是影響酸漿苦素提取量的重要因素。超聲時間對酸漿苦素提取量的影響見圖5。

圖5 超聲時間對酸漿苦素提取量的影響Fig.5 Effect of ultrasound time on physalin yield

由圖5可知，超聲時間為10 min～30 min時，酸漿苦素提取量呈上升趨勢，繼續(xù)延長超聲時間，提取量趨于平緩。30 min的提取時間能夠?qū)⒋蟛糠值乃釢{苦素從酸漿宿萼中提取出來，考慮到節(jié)能問題，選擇超聲時間為25、30、35 min進(jìn)行后續(xù)試驗。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化酸漿苦素提取工藝試驗結(jié)果

試驗設(shè)計方案與結(jié)果見表5。

表5 擬合設(shè)計試驗方案及結(jié)果Table 5 Results of fitting test

采用響應(yīng)面分析法分析試驗結(jié)果，以酸漿苦素提取量為響應(yīng)值，對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項式回歸擬合，得回歸方程：酸漿苦素提取量=8.77-0.23A+0.093B+0.057C-0.12D-0.35AB+0.11AC-0.18AD+0.64BC+0.048BD+0.25CD-0.87A2-0.37B2-0.11C2-0.020D2，R2=0.991 5。響應(yīng)面法對酸漿苦素提取量的方差分析見表6。

表6 響應(yīng)面法對酸漿苦素提取量的方差分析Table 6 Analysis of variance of orthogonal test

由表6可知，回歸方程顯著性檢測P=0.000 6，表明該二次方程模型顯著（P＜0.05），回歸方程模型與實際擬合性較好，試驗誤差小，證明可用該模型對酸漿苦素的提取量進(jìn)行分析與預(yù)測。各因素對酸漿苦素提取量的影響能力大小依次為A（料液比）＞D（含水量）＞B（超聲功率）＞C（超聲時間）。

將表6中的數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)曲面分析，考察2個工藝參數(shù)對酸漿苦素提取量的交互作用。依照回歸方程，考察響應(yīng)曲面和相應(yīng)的等高線的形狀，分析4個因素對酸漿苦素提取量的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 酸漿各因素交互作用對多糖提取影響的響應(yīng)面Fig.6 Response contour plots and surface plots showing the effect of factor interaction on physalin yield

3D響應(yīng)曲面圖和熱圖可以直觀反映各因素交互作用對酸漿苦素提取量影響的顯著程度。在3D圖中，曲面的坡度越大，曲面頂端顏色越深，交互作用越顯著。在等高線圖中，等高線形狀越接近橢圓則兩個工藝參數(shù)之間的交互作用越顯著。由圖6可知，與其它考察因素比較，A料液比和B超聲功率、A料液比和C超聲時間、A料液比和D含水量、B超聲功率和C超聲時間分別與酸漿苦素提取量所形成的三維曲面圖形較陡，響應(yīng)值波動較明顯，且等高線圖為橢圓形，交互作用對酸漿苦素提取量影響相對大[29]，與表6方差分析結(jié)果相符合。

2.4 驗證試驗結(jié)果

由Design-Expert 8.0.6軟件分析，得出酸漿苦素提取的最佳條件。結(jié)果顯示，酸漿苦素提取的最佳條件為料液比 1∶10（g/mL）、超聲功率 322 W、超聲時間30.45 min、含水量15.35%，此時得到的酸漿苦素提取量為9.070 77 mg/g。結(jié)合試驗操作性，試驗條件優(yōu)化為料液比 1∶10（g/mL）、超聲功率 320 W、超聲時間 30 min、含水量15%。在此優(yōu)化工藝條件下，進(jìn)行3次驗證，酸漿苦素提取量平均值為（8.96±0.15）mg/g，與模型預(yù)期值的誤差為1.22%，說明該方程與酸漿苦素提取試驗情況擬合較好。

2.5 酸漿苦素降糖活性結(jié)果

酸漿苦素降糖活性結(jié)果見表7。

表7 酸漿苦素降糖活性結(jié)果Table 7 Sugar-lowering activity of physalin

由表7可知，酸漿苦素與阿卡波糖對照品均有降糖活性，兩者對α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶的抑制結(jié)果進(jìn)行兩樣本T檢驗，兩者對α-葡萄糖苷酶的抑制能力差異不顯著（t=3.599、P=0.069），對 α-淀粉酶的抑制能力差異顯著（t=8.477、P=0.014）。

3 結(jié)論

DESs-UAE提取酸漿宿萼中的酸漿苦素，以氯化膽堿∶葡萄糖=2∶1（摩爾比）合成的DESs-5為最佳提取溶劑。響應(yīng)面分析法使得試驗優(yōu)選工藝參數(shù)明確，通過回歸方程擬合幾種試驗考察因素間的函數(shù)關(guān)系尋得各交互考察因素的最確切組合以及響應(yīng)值的最佳值。本文運(yùn)用DESs提取酸漿宿萼中的酸漿苦素，結(jié)合響應(yīng)面分析法優(yōu)化了DESs-UAE提取酸漿苦素的工藝。相比傳統(tǒng)甲醇提取酸漿苦素，DESs-UAE提取酸漿苦素綠色環(huán)保、酸漿苦素提取量高，高于75%乙醇組。α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶抑制劑，能降低2型糖尿患者升糖指數(shù)和餐后高血糖。醫(yī)治2型糖尿病的常規(guī)藥物阿卡波糖等容易引起如胃腸脹氣、腹瀉等不良副作用，將常規(guī)藥物與具備生物效用的天然活性產(chǎn)物聯(lián)合使用是減少藥物副作用的可行途徑。酸漿苦素有很好的降糖活性，可以與醫(yī)治2型糖尿病的常規(guī)藥物聯(lián)合使用。本試驗為酸漿苦素的進(jìn)一步分離純化、調(diào)節(jié)血糖、創(chuàng)造經(jīng)濟(jì)價值等深化研究奠定了基礎(chǔ)。