李澤鳳向南星魏春梅李新藝孟丹晨黃海泉黃美娟

(西南林業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院/國家林業(yè)和草原局西南風(fēng)景園林工程技術(shù)工程研究中心/云南省功能性花卉資源及產(chǎn)業(yè)化技術(shù)工程研究中心/西南林業(yè)大學(xué)園林園藝花卉研發(fā)中心，云南 昆明 650224)

植物木質(zhì)化是指木質(zhì)素形成并沉積在細(xì)胞壁中的一種生物學(xué)過程[1，2]，一般在次生細(xì)胞壁中發(fā)生，且木質(zhì)素與植物的進(jìn)化歷程緊密相關(guān)，這可能對植物從水生環(huán)境登陸到陸地環(huán)境生活發(fā)揮著關(guān)鍵作用[3]。較高的木質(zhì)化程度不僅可以提高植物的抗旱性[4]，而且能提高植物的觀賞價值。木質(zhì)素是細(xì)胞壁的重要組分之一，主要在細(xì)胞次生壁中沉積，如導(dǎo)管、纖維和表皮等[5]，具有硬度強(qiáng)、不溶水性以及不易被降解的化學(xué)特性，在植物生長和發(fā)育過程中起機(jī)械支撐作用，也是植物防御的屏障和水分運(yùn)輸所必需的[6-8]。關(guān)于木質(zhì)素的合成調(diào)控已有研究表明，MYB46可直接對木質(zhì)素途徑進(jìn)行調(diào)控[9]；小麥中的TaMYB[10]以及玉米中的ZmMYB46和ZmMYB31等[11]基因參與了調(diào)控木質(zhì)素的生物合成；火炬松(Pinus taedaL.)中的MYB4[12]能與木質(zhì)素合成基因的啟動子區(qū)的AC元件結(jié)合；桉樹(Eucalyptus grandis)中的MYB2會下調(diào)結(jié)構(gòu)基因CCR的表達(dá)[13]，推測會抑制木質(zhì)素的生物合成；除此之外，AtWRKY12可與NST2的啟動子區(qū)域結(jié)合，進(jìn)而負(fù)調(diào)控植物細(xì)胞中木質(zhì)素的表達(dá)[14]。MYB、NAC和WRKY類轉(zhuǎn)錄因子都參與了木質(zhì)素的表達(dá)調(diào)控，但尤以MYB轉(zhuǎn)錄因子報道得最多。

按照MYB結(jié)構(gòu)域數(shù)目，MYB類轉(zhuǎn)錄因子被分為R1-MYB、R2R3-MYB、R1R2R3-MYB以及4R的MYB[15]。已有眾多研究表明MYB4的N端具有特定的R2、R3結(jié)構(gòu)域，因此可以推測其屬于R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子。在木質(zhì)素合成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，郭亞玉等[16]認(rèn)為SND1S作用于MYB轉(zhuǎn)錄因子，其中MYB轉(zhuǎn)錄因子不僅可以作為轉(zhuǎn)錄激活因子，還可以作為轉(zhuǎn)錄抑制因子來調(diào)控木質(zhì)素的合成。MYB4轉(zhuǎn)錄因子通過參與木質(zhì)素的調(diào)控過程而影響植物木質(zhì)部細(xì)胞壁的加厚，如在轉(zhuǎn)BpMYB4基因擬南芥(Arabidopsis thaliana)植株中木質(zhì)素含量降低，因此BpMYB4可作為木質(zhì)素生物合成的抑制因子[17]；Shen等[18]研究表明，在煙草和柳枝稷中過表達(dá)PvMYB4基因，木質(zhì)素含量顯著減少，從而影響其生長發(fā)育質(zhì)量；擬南芥的MYB4轉(zhuǎn)錄因子會抑制木質(zhì)素的合成，其同源基因MYB32和MYB7則負(fù)調(diào)控木質(zhì)素的相關(guān)合成途徑[19，20]。由此可見MYB4轉(zhuǎn)錄因子在植物中的過表達(dá)可能負(fù)調(diào)控植物木質(zhì)素的合成，進(jìn)而影響植物的木質(zhì)化程度及次生細(xì)胞壁加厚。

鳳仙花屬植物具有經(jīng)濟(jì)、藥用、觀賞和園藝價值[21]。綠萼鳳仙花(Impatiens chlorosepala)是鳳仙花科(Balsaminaceae)鳳仙花屬(Impatiens)的一年或多年生植物，生于山谷水旁陰處或疏林溪旁，其花形奇特，花淡黃色或橘黃色，低矮，分枝能力強(qiáng)，莖肉質(zhì)實(shí)心。綠萼鳳仙花觀賞價值極高，可以作為園林地被植物予以開發(fā)。木質(zhì)素含量能影響植株木質(zhì)化程度，木質(zhì)化程度高的植物株型挺拔、抗逆性強(qiáng)、觀賞價值高。迄今為止，國內(nèi)外尚未見有關(guān)綠萼鳳仙花木質(zhì)素調(diào)控基因MYB4的相關(guān)報道。

本研究克隆了綠萼鳳仙花MYB4基因，并對其序列進(jìn)行相關(guān)分析；在此基礎(chǔ)上，采用qRTPCR探究其在綠萼鳳仙花不同部位的表達(dá)模式，進(jìn)而探究MYB4基因在木質(zhì)素合成過程中的功能和作用，以期為進(jìn)一步研究綠萼鳳仙花中MYB4基因在木質(zhì)素合成中的分子機(jī)制提供理論支持，并為后期增加鳳仙花木質(zhì)化程度及品種改良提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

綠萼鳳仙花于2020年7月種植于西南林業(yè)大學(xué)樹木園溫室大棚，2021年10月取其生長健壯的根尖、地上5 cm的莖基部及從上往下第四片成熟葉。

試劑材料:RNA提取試劑盒(OMEGA)、凝膠回收試劑盒(昆明碩陽科技有限公司)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(昆明云科生物技術(shù)有限公司)、DH5α菌株(TAKARA)、pMD19-T載體(TAKARA)等。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取與MYB4基因的克隆 根據(jù)RNA提取試劑盒說明書提取綠萼鳳仙花根、莖和葉的總RNA；采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20℃保存?zhèn)溆?。使用課題組已有的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對綠萼鳳仙花MYB4基因設(shè)計(jì)特異性引物，詳見表1。以逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA第一鏈為模板進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系(50μL):10×Easy TaqBuffer(Mg2＋)6μL，dNTP 4μL，Easy TaqDNA Polymerase 0.5μL，上下游引物各2.5μL，cDNA 2.5 μL，ddH2O 32μL。擴(kuò)增程序:95℃5 min；95℃50 s，55℃1 min，72℃1 min，35個循環(huán)；72℃10 min。對目的片段進(jìn)行回收并純化后克隆連接到pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞后，挑選陽性克隆進(jìn)行驗(yàn)證、測序。

表1 綠萼鳳仙花MYB4基因cDNA序列擴(kuò)增引物

1.2.2MYB4基因序列分析 運(yùn)用ExPasy-Prot-Param軟件對MYB4基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行理化性質(zhì)分析；利用CDD工具對目的基因的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測；使用BLAST功能找出與綠萼鳳仙花MYB4基因同源性相對較高的其他植物的氨基酸序列，通過DNAMAN軟件完成相關(guān)序列的同源性分析，并使用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.3MYB4基因表達(dá)模式分析 將綠萼鳳仙花根、莖和葉3個部位的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA并稀釋10倍備用。設(shè)計(jì)qRT-PCR引物(表2)，qRTPCR擴(kuò)增體系(20μL):qPCR SYBR Green Master Mix 10μL，ddH2O 8.2μL，上下游引物各0.4μL，cDNA 1μL。擴(kuò)增程序:95℃5 min；95℃15 s，60℃30 s，72℃1 min，40個循環(huán)；95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s。內(nèi)參基因?yàn)镮cActin，每個樣品3個重復(fù)，并將根定義為1個單位作為對照，采用2-△△Ct對目的基因在根、莖和葉3個部位的相對表達(dá)量進(jìn)行計(jì)算，利用SPSS對其進(jìn)行顯著性分析。

表2 綠萼鳳仙花MYB4基因qRT-PCR擴(kuò)增引物

2 結(jié)果與分析

2.1 綠萼鳳仙花MYB4基因的克隆

通過PCR擴(kuò)增，獲得IcMYB4-1、IcMYB4-2和IcMYB4-3基因全長cDNA序列，分別為666、888、771 bp(圖1)，編碼221、295、256 aa。將其cDNA序列與基因組gDNA比較發(fā)現(xiàn)，IcMYB4-1、IcMYB4-2和IcMYB4-3基因組序列均在ATG下游263 bp處含有長度分別為83、107、117 bp的內(nèi)含子。

圖1 綠萼鳳仙花MYB4基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 綠萼鳳仙花MYB4基因的序列結(jié)構(gòu)分析

綠萼鳳仙花MYB4基因編碼蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)分析結(jié)果(表3)表明，IcMYB4-1、IcMYB4-2和IcMYB4-3的不穩(wěn)定指數(shù)均高于40，為不穩(wěn)定蛋白，平均親水指數(shù)為負(fù)值，屬于親水性蛋白。通過CDD工具分析結(jié)果表明，3個MYB4蛋白均屬于MYB超家族蛋白成員，具特有的SANT結(jié)構(gòu)域和穩(wěn)定的PLN03091結(jié)構(gòu)域(圖2)。

表3 綠萼鳳仙花MYB4蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)

圖2 綠萼鳳仙花MYB4蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域

2.3 綠萼鳳仙花MYB4基因的同源性及系統(tǒng)進(jìn)化分析

對綠萼鳳仙花及其他物種MYB4基因的氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明，IcMYB4-1、IcMYB4-2和IcMYB4-3與其他物種的相似性在62%左右(圖3)。N端存在保守的R2和R3 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，同源性較高；C端同源性相對較低，且同時具有抑制型的保守基序EAR。系統(tǒng)親緣關(guān)系結(jié)果(圖4)表明，進(jìn)化樹分為兩大分支，IcMYB4-1和IcMYB4-2處于一個分支，推測其可能為直系同源關(guān)系，而IcMYB4-3與前兩者分屬兩個分支，推測其可能為旁系同源關(guān)系。

圖3 MYB4基因的同源氨基酸序列比對

圖4 基于綠萼鳳仙花MYB4基因氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 綠萼鳳仙花MYB4基因的表達(dá)分析

研究發(fā)現(xiàn)，3個IcMYB4基因在綠萼鳳仙花的3個不同部位(根、莖和葉)均有表達(dá)(圖5)。以根為參照，IcMYB4-1在綠萼鳳仙花不同部位的表達(dá)均為最低，表現(xiàn)為在根中最多，葉次之，莖最少；IcMYB4-2和IcMYB4-3基因在綠萼鳳仙花不同部位的表達(dá)趨勢一致，表現(xiàn)為在根、莖和葉中依次升高。在綠萼鳳仙花的3個不同部位中，根木質(zhì)化程度相對較高，含木質(zhì)素較多，而葉含木質(zhì)素較少，推測IcMYB4-1基因可能對綠萼鳳仙花木質(zhì)素合成起正調(diào)控作用，而IcMYB4-2和IcMYB4-3對綠萼鳳仙花的木質(zhì)素合成起負(fù)調(diào)控作用。

圖5 MYB4基因在綠萼鳳仙花3個不同部位的表達(dá)模式分析

3 討論與結(jié)論

MYB轉(zhuǎn)錄因子參與了植物的整個生長過程及其響應(yīng)生物和非生物脅迫的過程[22]。在MYB家族中，R2R3-MYB蛋白在木質(zhì)素合成及次生壁增厚等方面發(fā)揮著重要作用[23，24]。本研究從綠萼鳳仙花中成功克隆了木質(zhì)素合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子IcMYB4-1、IcMYB4-2和IcMYB4-3，cDNA全長分別為666、888、771 bp，編碼221、295、256 aa，均屬于不穩(wěn)定親水性蛋白，與李嘉哲等[25]在山新楊中的研究結(jié)果一致；且都含有一個內(nèi)含子，與趙佳等[26]對月季花青素相關(guān)R2R3-MYB蛋白的研究結(jié)果一致。3個MYB4蛋白均屬于MYB超家族蛋白成員，含有MYB家族R2和R3的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，在N端同源性較高，C端差異較大，并且存在保守抑制型基序EAR[27]，與已有研究結(jié)果一致[28]；IcMYB4-1、IcMYB4-2和IcMYB4-3與其他物種MYB4基因的氨基酸序列同源性在62%左右。上述研究均證明在各物種之間MYB轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)構(gòu)域是高度保守的[29]。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明IcMYB4-1和IcMYB4-2處于一個分支，推測其可能為直系同源關(guān)系；而IcMYB4-3與前兩者分屬不同分支，因此推測可能為旁系同源關(guān)系。

已有研究表明，MYB4基因在不同植物中的拷貝數(shù)不同，且在大多數(shù)植物的各個部位均有表達(dá)；即使在同一物種，不同部位的表達(dá)量也具有顯著差異。例如在茶樹兩個MYB轉(zhuǎn)錄因子的克隆及功能驗(yàn)證中，CsMYB4-5與CsMYB4-6都在根中表達(dá)量較高，在莖中表達(dá)量較低[30]。本研究分析發(fā)現(xiàn)，IcMYB4-1、IcMYB4-2和IcMYB4-3在綠萼鳳仙花的3個部位均有表達(dá)；其中，IcMYB4-1的表達(dá)量在根中最多，莖和葉的表達(dá)量較少，與李嘉哲等[25]的研究結(jié)果一致；IcMYB4-2和IcMYB4-3的表達(dá)趨勢一致，均為在葉中最多，莖次之，根最少，與對當(dāng)歸MYB4轉(zhuǎn)錄因子的研究結(jié)果一致[31]。以上結(jié)果表明，MYB4轉(zhuǎn)錄因子在不同植物甚至是同一植物的不同部位中可能發(fā)揮著不一樣的功能和作用。

有研究證明小麥的TaMYB4轉(zhuǎn)錄因子在煙草中異源過表達(dá)時，其總木質(zhì)素含量下降[10]；象草PpMYB4基因在煙草中過表達(dá)時，轉(zhuǎn)基因煙草的木質(zhì)素含量顯著低于野生型[13]。這些研究表明MYB4基因在木質(zhì)素的合成調(diào)控中起到了抑制作用。在山新楊中PdPapMYB4在木質(zhì)化莖中大量表達(dá)，遠(yuǎn)高于幼莖[25]，說明MYB4基因可能在不同植物中對木質(zhì)素的調(diào)控作用不同。IcMYB4基因在綠萼鳳仙花的木質(zhì)素合成調(diào)控中起到了重要的作用，但其具體調(diào)控機(jī)制和功能還需進(jìn)一步驗(yàn)證。