時(shí)煥軍陳婕妤高鑠皓崔明晨林嘉龍何建昆賈樂張建軍

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 泰安 271018)

食用菌多糖系由10個(gè)以上的單糖以糖苷鍵連接而成的高分子多聚物，是從子實(shí)體、菌絲體、發(fā)酵液等組織中分離出的，具有控制細(xì)胞分裂分化、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長衰老[1]、抗氧化[2]、抗腫瘤[3]、降血糖[4]等多種生物活性，成為近年來生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的熱門。自由基學(xué)說是Denhan Harman提出的有關(guān)衰老的氧自由基理論，其研究表明自由基是具有高度活性的物質(zhì)，能夠使細(xì)胞和細(xì)胞器膜脂類產(chǎn)生過氧化損傷，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞膜功能喪失。伴隨人體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)能力下降，自由基可對(duì)組織器官造成傷害，危害人類健康，因此尋找外源性自由基清除劑具有十分重要的意義[5]。鋅作為人體的必需微量元素，與300多種酶的活性密切相關(guān)，在免疫反應(yīng)中起著非常重要的作用[6]。鋅缺乏會(huì)導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)發(fā)育遲緩、免疫和抗氧化防御功能紊亂、學(xué)習(xí)記憶能力下降和皮膚不完全角化等癥狀。人體主要是從藥物或食物中獲取鋅元素，但補(bǔ)鋅藥物價(jià)格偏高，而提高鋅在食物中的富集度可改善鋅攝取不足。食用菌多糖具有良好的抗氧化活性[7]和自由基清除能力[8]，且真菌多糖配合鋅化合物修飾的抗氧化能力更強(qiáng)[9]。

紅平菇(Pleurotus djamor)是食用菌中的珍稀菌類[10]，具有較大的開發(fā)潛力。本試驗(yàn)以經(jīng)過液體發(fā)酵和固體富鋅培養(yǎng)的紅平菇為材料，在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇對(duì)鋅化多糖得率影響大的鋅濃度、培養(yǎng)時(shí)間、接種量3因素利用響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳制備工藝，并評(píng)估鋅化多糖在體內(nèi)外的潛在抗氧化能力，為紅平菇在大健康領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅平菇菌種為本實(shí)驗(yàn)室自主分離、鑒定并保存。Kunming雄性小鼠50只[(20±2)g]，購于泰安泰邦生物制品有限公司。其他常規(guī)試劑均為化學(xué)純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 紅平菇鋅化多糖制備工藝優(yōu)化 采用液體發(fā)酵和固體培養(yǎng)技術(shù)，在單因素預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇鋅濃度、培養(yǎng)時(shí)間和接種量3個(gè)因素，以多糖得率為指標(biāo)，利用響應(yīng)面法優(yōu)化紅平菇鋅化多糖的制備工藝。3因素及水平見表1。

表1 多糖得率的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

工藝流程:以醋酸鋅為鋅源配制不同鋅濃度培養(yǎng)基，按設(shè)計(jì)接種量將菌塊接入盛有相應(yīng)鋅濃度的150 mL培養(yǎng)基的三角瓶中，25℃靜置24 h，130 r/min振蕩培養(yǎng)相應(yīng)培養(yǎng)時(shí)間。離心，將菌絲體60℃烘干至恒重，備多糖提取。

1.2.2 紅平菇鋅化多糖提取 參照張建軍[11]的方法，將烘干的菌絲體放入離心管內(nèi)，加入20倍體積的去離子水，90℃水浴鍋內(nèi)水浴2 h，3 000r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移到250 mL三角瓶中，反復(fù)浸提2次，加入3倍體積的乙醇進(jìn)行醇沉，冷凍干燥。

1.2.3 多糖含量測定 采用苯酚-硫酸法。標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法:將葡萄糖置于100℃烘箱中干燥2h，準(zhǔn)確稱取干燥后的葡萄糖20 mg，加水定容至500 mL，分別精確量取0.4、0.8、1.0、1.2、1.6、1.8、2.0 mL葡萄糖溶液于10 mL具塞試管中，補(bǔ)水至2 mL，加入5%苯酚溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用)1 mL后立即加入5 mL濃硫酸，沸水浴20 min后冷卻至室溫，于490 nm下測吸光值。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)、吸光值為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線R2值大于0.9900方可使用。準(zhǔn)確量取2 mL樣品按上述方法測定吸光值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量。

1.2.4 紅平菇鋅化多糖的紅外光譜掃描分析利用傅里葉紅外光譜分析方法。取1 mg干燥紅平菇鋅化多糖樣品，加150 mg KBr充分研磨后壓片，使用Nicolet Nexus 470紅外光譜儀在500～4 000 cm-1范圍內(nèi)掃描，根據(jù)紅外光譜中各特征峰的位置和形狀，推斷多糖官能團(tuán)的特征。

1.2.5 紅平菇鋅化多糖的體內(nèi)抗氧化能力評(píng)估

(1)小鼠衰老模型:將Kunming種雄性小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、陽性對(duì)照組、鋅化多糖高劑量組和鋅化多糖低劑量組，每組10只小鼠。其中，空白組:腹腔注射pH為4.5的檸檬酸緩沖液10 mL/kg＋灌胃去離子水10 mL/kg；模型組:腹腔注射D-半乳糖(D-gal)0.2 mL＋灌胃去離子水10 mL/kg；陽性對(duì)照組:腹腔注射D-半乳糖0.2mL＋灌胃葡萄糖酸鋅10 mL/kg；高劑量組:腹腔注射D-半乳糖0.2 mL＋灌胃鋅化多糖溶液400 mg/kg；低劑量組:腹腔注射D-半乳糖0.2 mL＋灌胃鋅化多糖溶液200 mg/kg。

每天小鼠自由飲食和飲水，定時(shí)腹腔注射和灌胃各1次，持續(xù)45 d。每日記錄小鼠的體重及飼料和水的消耗量。

(2)樣品制備:所有小鼠禁食過夜后稱量體重，麻醉處死后眼眶取血，5 000 r/min離心5 min后取上清液(血清)備用。取血后將小鼠在無菌環(huán)境中解剖，摘取肝、腎、腦等組織放進(jìn)0.9%的生理鹽水中進(jìn)行清洗，用濾紙吸干表面水分，稱重并記錄。取1 g組織迅速加入9 mL預(yù)冷的PBS緩沖液(0.2 mol/L，pH 7.4，4℃)進(jìn)行研磨，于5 000 r/min離心20 min，取上清即得組織勻漿，冷藏保存待用。另外取小鼠的肝、腎、腦組織，浸泡于4%的中性甲醛溶液進(jìn)行固定，進(jìn)行組織病理標(biāo)本及切片的制備。

(3)指標(biāo)分析:利用全自動(dòng)生化分析儀測定小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)。通過紫外可見分光光度計(jì)平行測定各組小鼠組織勻漿液中過氧化氫酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)的含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 22.0軟件(IBM Institute，USA)進(jìn)行顯著性分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以3次獨(dú)立平行試驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，同時(shí)采用單因素方差分析(ANOVA)及LSD、Tukey事后多態(tài)性檢驗(yàn)來評(píng)估組間差異，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅平菇鋅化多糖制備工藝優(yōu)化

2.1.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果 對(duì)表2中各組合鋅化多糖得率進(jìn)行Design-Expert 7.0數(shù)據(jù)分析，獲得多糖得率與鋅濃度(X1)、接種量(X2)、培養(yǎng)時(shí)間(X3)的二次擬合回歸方程:

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由方程中3因素的一次項(xiàng)數(shù)值可以得出，鋅濃度、接種量和培養(yǎng)時(shí)間的正向變化在一定程度上可以引起多糖得率的增加；3因素的二次項(xiàng)系數(shù)為負(fù)值，開口向下，說明該模型條件范圍內(nèi)能夠得到最大值。因此，可以利用該模型對(duì)多糖的得率進(jìn)行優(yōu)化。

表3、表4顯示，該模型的F值為464.09，P值＜0.0001，說明模型極顯著，可用來進(jìn)行響應(yīng)面預(yù)測。失擬值的F值為0.21，P值為0.8860(＞0.05)，表明失擬項(xiàng)與純誤差之間差異不顯著。模型的R2值為0.9983，說明模型的擬合程度良好；噪聲比為54.725，PRESS為0.68，表明該模型自變量與響應(yīng)值之間的線性關(guān)系顯著。綜上所述，模型的擬合程度很好，誤差較小，可以用此模型對(duì)紅平菇鋅化多糖的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化。

表3 BBD的中心組合設(shè)計(jì)模型及方差分析

表4 多糖得率擬合方差分析

二次模型中回歸系數(shù)的顯著性分析結(jié)果見表5。可知，一次項(xiàng)中X1、X3及交互項(xiàng)、二次項(xiàng)均在P＜0.01水平上對(duì)多糖得率有顯著影響，其中X3、的影響較大。一次項(xiàng)因素對(duì)多糖得率的影響順序依次是X3＞X1＞X2，即培養(yǎng)時(shí)間＞鋅濃度＞接種量。

表5 多糖得率二次模型回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)

2.1.2 模型的準(zhǔn)確性和異常值分析 多糖得率正態(tài)概率隨機(jī)分布在直線的兩側(cè)，并且靠近直線，表明該模型的方差無偏差(圖1A)；殘差與方程預(yù)測值的對(duì)應(yīng)關(guān)系(圖1B)顯示，響應(yīng)值隨機(jī)分布在限定線(紅色)以內(nèi)。綜上說明模型設(shè)計(jì)精確度高，可用于多糖得率的響應(yīng)分析。

圖1 多糖得率模型準(zhǔn)確性分析

如圖2所示，所有多糖得率的外部學(xué)生化殘差分析均落到限制線(圖2A中的紅線)內(nèi)，杠桿值遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于1(圖2B)?？捎迷撃Ｐ头治鲇绊懚嗵堑寐首兞恐g的關(guān)系。

圖2 不同多糖得率間異常值的分析

2.1.3 因素間交互作用分析 從圖3和表5看出，鋅濃度和接種量交互作用對(duì)多糖得率影響顯著，曲面較緩和并且隨著鋅濃度的上升，多糖得率先升高后降低。軸向等高線密集變化顯示鋅濃度對(duì)多糖得率的影響較接種量更大，這與方差分析結(jié)果一致。

圖3 鋅濃度和接種量對(duì)多糖提取率交互作用影響的等高線圖及響應(yīng)面圖

由圖4和表5看出，鋅濃度和培養(yǎng)時(shí)間交互作用對(duì)多糖得率影響顯著，鎖定一個(gè)變量可以看出另一個(gè)為先增加后平緩的趨勢。軸向等高線密集變化顯示培養(yǎng)時(shí)間對(duì)多糖得率的影響較鋅濃度更大，這與方差分析結(jié)果一致。

圖4 鋅濃度和培養(yǎng)時(shí)間交互作用對(duì)多糖提取率影響的等高線圖及響應(yīng)面圖

由圖5和表5可知，接種量和培養(yǎng)時(shí)間交互作用對(duì)多糖得率影響顯著，隨著培養(yǎng)天數(shù)增加，多糖得率緩慢上升。軸向等高線密集變化顯示培養(yǎng)時(shí)間對(duì)多糖得率的影響較接種量更大，這與方差分析結(jié)果一致。

圖5 接種量和培養(yǎng)時(shí)間交互作用對(duì)多糖提取率影響的等高線圖及響應(yīng)面圖

綜合上述分析，通過回歸方程可得鋅濃度為163.90 mg/L、接種量為2.39 cm2、培養(yǎng)時(shí)間為8 d時(shí)，鋅化多糖理論得率最高，為6.70%。對(duì)該條件下的富鋅率進(jìn)行火焰原子吸收分光光度法檢測，結(jié)果為(90.22±4.35)%，富鋅率較高，可用于后續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

2.2 紅平菇鋅化多糖體內(nèi)抗氧化能力評(píng)估

2.2.1 血清生化指標(biāo)分析 血清中CREA、BUN為檢測腎功能是否被損傷的生化指標(biāo)。由圖6可知，注射D-gal后模型組小鼠CREA、BUN含量比空白組顯著升高，表明小鼠腎臟發(fā)生了損傷，腎小球過濾能力下降，無法正常代謝，導(dǎo)致血清中CREA、BUN積累，造成機(jī)體器官組織功能障礙。當(dāng)灌胃紅平菇鋅化多糖后，小鼠腎臟中CREA、BUN含量降低，說明紅平菇鋅化多糖對(duì)衰老引起的腎臟損傷有一定緩解作用。

ALT、AST被臨床認(rèn)為是監(jiān)測肝損傷的生化指標(biāo)。由圖6可知，注射D-gal后模型組小鼠ALT、AST活性比空白組明顯升高，表明發(fā)生了特征性肝臟損傷。當(dāng)灌胃紅平菇鋅化多糖后，小鼠肝組織中ALT、AST活性分別有不同程度降低，但差異不顯著(P＞0.05)。結(jié)果表明紅平菇鋅化多糖可一定程度上減輕衰老引起的肝臟損傷。

圖6 紅平菇鋅化多糖對(duì)衰老小鼠血清生化指標(biāo)的影響

2.2.2 體內(nèi)抗氧化指標(biāo)分析 由圖7可知，模型組腎組織和肝組織CAT活性比空白組明顯降低，表明小鼠產(chǎn)生了不同程度的肝損傷。灌胃鋅化多糖后CAT活性皆有明顯提高，且高于陽性對(duì)照，可以證明紅平菇鋅化多糖能夠提高D-gal誘導(dǎo)的衰老小鼠肝組織及腎組織中CAT活性，緩解氧化應(yīng)激損傷。

圖7 紅平菇鋅化多糖對(duì)衰老小鼠組織內(nèi)CAT活性的影響

由圖8可知，相比空白組，D-gal誘導(dǎo)的衰老模型組小鼠肝、腎組織中MDA含量升高，且肝組織中升高顯著(P＜0.05)。鋅化多糖處理組MDA含量顯著降低，說明紅平菇鋅化多糖能有效降低肝及腎組織中MDA含量，有效抑制D-gal誘發(fā)的衰老，且效果高于陽性對(duì)照組。

圖8 紅平菇鋅化多糖對(duì)衰老小鼠組織內(nèi)MDA含量的影響

2.3 紅平菇鋅化多糖的紅外光譜掃描分析

掃描結(jié)果(圖9)顯示，在光譜3 278.17 cm-1處出現(xiàn)多糖特征吸收峰，由羥基(-OH)伸縮振動(dòng)引起；在2 917.94 cm-1附近的吸收峰是糖類C-H鍵伸縮振動(dòng)；在1 644.49 cm-1處出現(xiàn)顯著吸收峰，由多糖中乙酰胺基(-NHCOCH3)的(C＝O)非對(duì)稱伸縮振動(dòng)引起；在1 324.10 cm-1附近是糖醛酸特征吸收峰，以上幾組吸收峰結(jié)果表明該物質(zhì)屬于糖類化合物。在光譜1 024.51、888.84、666.10 cm-1處出現(xiàn)吸收峰，推測為Zn-O的外彎彎曲振動(dòng)峰，因此紅平菇鋅化多糖為β-呋喃糖。由于紅外光譜給出的結(jié)構(gòu)信息僅為相關(guān)官能團(tuán)連接方式及類型，對(duì)紅平菇鋅化多糖的結(jié)構(gòu)反映并不全面，因此，還需對(duì)其具體結(jié)構(gòu)進(jìn)一步研究。

圖9 紅平菇鋅化多糖紅外光譜分析結(jié)果

3 討論與結(jié)論

多糖是生物體的重要組成成分，是具有抗衰老、抗病毒、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等功能的天然活性物質(zhì)[12]。MDA是氧自由基損傷和脂質(zhì)過氧化作用的主要代謝產(chǎn)物，存在于血清和組織中的MDA含量高低能反映機(jī)體自由基代謝的情況[13]。CAT存在于機(jī)體過氧化物體內(nèi)，其活性高低間接反映細(xì)胞遭到自由基攻擊的受損程度[14]。本試驗(yàn)結(jié)果表明紅平菇鋅化多糖相比于同濃度的未富鋅多糖[15]及其他部分側(cè)耳屬多糖有更好的抗氧化能力[16]，且抗氧化能力隨著多糖濃度的增加而增加，可在一定程度上緩解氧化應(yīng)激所帶來的肝損傷和腎損傷，從而抑制衰老，延長壽命。

本試驗(yàn)采用醇沉浸提方式，在單因素預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法確定了紅平菇鋅化多糖的最佳提取條件為鋅濃度163.90 mg/L，接種量2.39 cm2，培養(yǎng)時(shí)間8 d。在此條件下，紅平菇鋅化多糖提取率可以優(yōu)化至6.70%。本研究結(jié)果可為建立紅平菇有機(jī)鋅轉(zhuǎn)化、鋅化多糖制備生產(chǎn)體系以及補(bǔ)鋅食物、藥物開發(fā)提供參考和依據(jù)。