申小冉趙慶張相倫李川皓趙紅波胡悅盛清凱

(1.泰安巴夫巴夫農(nóng)業(yè)科技有限公司，山東 泰安 271000；2.平陰縣畜牧獸醫(yī)局，山東 平陰 250400；3.山東省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所/山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽生物組學重點實驗室，山東 濟南 250100；4.山東省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)作物種質(zhì)資源研究所，山東 濟南 250100)

龍葵素又名茄堿，主要存在于茄科植物(番茄、茄子和馬鈴薯等)的根、莖、葉及果實中，在百合科、菊科植物中也有發(fā)現(xiàn)[1]。作為一種有毒糖苷類生物堿，龍葵素是植物生長過程中的次生代謝物質(zhì)，由茄啶與葡萄糖、木糖、鼠李糖以及半乳糖形成，其結(jié)構與人類的甾體激素如雄激素、雌激素、孕激素等性激素類似。龍葵素常引起家畜及人類食物中毒[2]。隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展，番茄等茄科植物大面積種植。因含有龍葵素等毒性物質(zhì)，番茄秧、馬鈴薯秧等常被丟棄，不但浪費資源，而且導致產(chǎn)業(yè)鏈斷鏈，阻礙了循環(huán)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。作為一種飼料原料，番茄秧等秸稈可以經(jīng)青貯后飼用[3，4]。青貯時添加枯草芽孢桿菌、乳酸菌等外源菌[5]，不但能夠改變青貯飼料的菌群，而且可以提高青貯質(zhì)量[6]，但無形中增加飼料生產(chǎn)成本。Lastochkina等[7]報道枯草芽孢桿菌浸泡霉變馬鈴薯后可以降低其中龍葵素的含量?？莶菅挎邨U菌作為一種常用益生菌，對青貯番茄秧中龍葵素的影響尚不清楚。本試驗研究了外源枯草芽孢桿菌對青貯番茄秧中菌群及龍葵素的影響，以期為茄科植物的飼料化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

果實青綠時的新鮮番茄秧，由山東省費縣胡陽鎮(zhèn)農(nóng)場提供。枯草芽孢桿菌(1×108cfu/g)，由山東省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所提供。麩皮及呼吸膜塑料袋，市場購買。細菌基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司。pMD18-T Vector試劑盒以及EX TaqHS DNA熱啟動聚合酶，寶生物工程(大連)有限公司。GenEluteTMGel Extraction Kit膠回收試劑盒，美國Sigma Aldrich公司。植物龍葵素ELISA Kit，武漢默沙克生物科技有限公司。α-茄堿，上海源葉生物科技有限公司。

1.2 試驗設計及方法

采用單因素試驗設計。將新鮮番茄秧粉碎至粒度0.2～0.4 cm，分為對照組(粉碎的番茄秧)、麩皮組(粉碎的番茄秧＋麩皮)、菌麩組(粉碎的番茄秧＋麩皮＋枯草芽孢桿菌)。麩皮加入量為番茄秧重量的10%，枯草芽孢桿菌制劑加入量為0.1%，混勻后快速裝入呼吸膜塑料袋中厭氧發(fā)酵。每袋裝填1.5 kg，每組8袋。發(fā)酵5 d后開袋，進行16SrDNA及龍葵素等指標檢測。

精準稱取α-茄堿，將其溶于枯草芽孢桿菌含量為1×106cfu/mL的馬鈴薯培養(yǎng)液中，分裝入24個培養(yǎng)瓶中，每瓶100 mL，37℃厭氧培養(yǎng)。培養(yǎng)0、12、24、36 h分別從6個培養(yǎng)瓶中取樣，檢測培養(yǎng)液中龍葵素的含量。

1.3 16SrDNA克隆、轉(zhuǎn)化和文庫構建

1.3.1 DNA提取及PCR擴增 每組取發(fā)酵后的番茄秧樣品4個，混勻后按試劑盒要求抽提DNA。

利用引物27F/16SF:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R/16SR:5′-GGYTACCTTGTTACGACT T-3′擴增16SrDNA。PCR擴增體系:10×TaqBuffer 2.5μL，dNTPs(2.5 mmol/L)2.0μL，TaqDNA聚合酶0.2μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1.0μL，DNA模板2.0μL，雙蒸水補足至25μL。PCR反應條件:94℃預變性3 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸90 s，35個循環(huán)；72℃終延伸5 min，16℃保存。

1.3.2 PCR產(chǎn)物連接、轉(zhuǎn)化和克隆文庫構建 根據(jù)pMD18-T Vector試劑盒說明和分子克隆方法連接PCR產(chǎn)物并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞DH5α中。用X-gal/IPTG AMP抗性篩選平板選擇具有氨芐抗性的單克隆轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，通過M13通用引物(正反方向)進行PCR擴增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，選取擴增片段大小在1 700bp左右的陽性克隆構建16SrDNA文庫。

1.3.3 16S rDNA克隆文庫測序及分析 對構建的3個16SrDNA克隆文庫中經(jīng)M13通用引物鑒定后的陽性克隆質(zhì)粒(每個克隆文庫篩選110個陽性克隆子)進行測序。對每個克隆子的正反向測序結(jié)果使用DNAStar軟件進行拼接，去除載體序列。將序列在Unix系統(tǒng)服務器上進行本地BLAST數(shù)據(jù)庫比對鑒定。

1.4 檢測指標及方法

發(fā)酵后的番茄秧每袋取樣品約100 g，用4層紗布裹包后擠壓，將擠壓出的發(fā)酵液3 000 r/min離心5 min，檢測發(fā)酵液pH值，根據(jù)試劑盒要求測定培養(yǎng)液中龍葵素的含量。

根據(jù)BLAST數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果，計算相應菌種克隆子數(shù)所占百分比。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SAS(V9.1)軟件對數(shù)據(jù)進行處理，采用ONE-WAY ANOVA進行方差分析，采用Student-Newmnan-Keuls法進行多重比較，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源枯草芽孢桿菌對發(fā)酵液中龍葵素含量的影響

由表1看出，與對照組相比，麩皮組、菌麩組龍葵素的含量和pH值均顯著降低，且菌麩組顯著低于麩皮組(P＜0.05)。麩皮組、菌麩組龍葵素的含量分別下降約37%和67%。表明番茄秧添加麩皮后青貯可以降低龍葵素的含量，添加枯草芽孢桿菌可進一步降低龍葵素的含量和pH值。

表1 枯草芽孢桿菌對番茄秧中龍葵素含量和pH值的影響

2.2 外源枯草芽孢桿菌對培養(yǎng)液中龍葵素含量的影響

由表2看出，隨著培養(yǎng)時間的延長，枯草芽孢桿菌對培養(yǎng)液中的龍葵素含量均無顯著影響(P＞0.05)。

表2 枯草芽孢桿菌對培養(yǎng)液中龍葵素含量的影響 (nmol/L)

2.3 外源枯草芽孢桿菌對青貯番茄秧中菌群的影響

從表3、表4、表5看出，對照組主要菌群為氣味沙雷氏菌，麩皮組和菌麩組主要菌種分別為戊糖片球菌和植物乳桿菌。成團泛菌含量由對照組的11%降低至麩皮組中的2.04%、菌麩組的1.45%；對照組中未檢測出植物乳桿菌，麩皮組和菌麩組中植物乳桿菌的含量分別為6.12%、27.54%。與對照組相比，麩皮組和菌麩組中番茄秧菌群發(fā)生了明顯變化。

表3 對照組中的菌群

由表4、表5看出，麩皮組乳桿菌(植物乳桿菌、彎曲乳桿菌、短乳桿菌、乳酸桿菌、棒狀乳桿菌亞種、銀酸乳桿菌)的含量為42.84%，而菌麩組乳桿菌(植物乳桿菌、彎曲乳桿菌、短乳桿菌、副營養(yǎng)乳桿菌)的含量為57.98%；麩皮組中戊糖片球菌為40.82%，而菌麩組為4.35%。和麩皮組相比，菌麩組的菌群發(fā)生了明顯變化，表明枯草芽孢桿菌改變了青貯番茄秧中的菌群組成。

表4 麩皮組中的菌群

表5 菌麩組中的菌群

3 討論與結(jié)論

隨著番茄、馬鈴薯等的廣泛種植，茄科植物的秸稈利用問題日益突出。目前未見番茄秧青貯的研究報道。本試驗中番茄秧與麩皮混貯后，番茄秧菌群發(fā)生變動，植物乳桿菌等菌群顯著增加，發(fā)酵液由中性變?yōu)樗嵝?，這與在苜蓿[5]中的研究結(jié)果一致。本試驗番茄秧與麩皮混貯降低了龍葵素含量，這與馬鈴薯秧和全株玉米混合青貯可以提高青貯品質(zhì)的結(jié)果相似[3]。推測青貯降低龍葵素含量的機理可能為青貯后番茄秧上植物乳桿菌等乳酸菌[8]厭氧擴繁，在乳酸菌的作用下淀粉、葡萄糖等碳水化合物降解轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗?、乙酸等有機酸，降低發(fā)酵液的pH值，酸解龍葵素，從而降低龍葵素的毒性[9，10]。

本試驗發(fā)現(xiàn)，添加枯草芽孢桿菌后，青貯番茄秧的菌群進一步發(fā)生變化，這與枯草芽孢桿菌改變青貯全株青綠玉米菌群結(jié)構的結(jié)果相似[3，11]，其原因可能在于枯草芽孢桿菌作為一種好氧菌，加快了青貯袋內(nèi)厭氧環(huán)境的形成，促進了植物乳桿菌等乳酸菌的擴繁，抑制了有害菌的生長[12]。本試驗發(fā)現(xiàn)添加枯草芽孢桿菌也降低了番茄秧中龍葵素的含量，這與枯草芽孢桿菌降低霉變馬鈴薯龍葵素含量的結(jié)果[7]相似，推測其機理可能在于:其一，提高番茄秧上植物乳桿菌等細菌對龍葵素的抵抗能力，促進其擴繁。龍葵素作為一種有毒物質(zhì)，同時具有抗瘧疾、抗炎等功效[13]。植物乳桿菌和融合魏斯氏乳酸菌等土著菌對龍葵素具有一定的抵抗能力[14]?？莶菅挎邨U菌可能增強了植物乳桿菌等對龍葵素的抵抗能力，并進一步擴繁，酸解龍葵素。本試驗發(fā)現(xiàn)菌麩組的乳桿菌含量高于麩皮組，且pH值低于麩皮組。研究表明外源型植物乳桿菌等微生物結(jié)合可以降低未成熟番茄中的龍葵素含量及改進其發(fā)酵品質(zhì)[15]。本試驗中發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌對培養(yǎng)液中的龍葵素無影響，表明枯草芽孢桿菌對龍葵素的降解可能通過植物乳桿菌等土著微生物間接發(fā)揮作用，而非直接作用，這與枯草芽孢桿菌降低霉變馬鈴薯龍葵素含量的結(jié)果[7]存在差異，原因可能在于菌種不同。其二，可能促進青貯番茄秧中真菌等微生物分泌鼠李糖苷酶等酶，酶解龍葵素[16，17]，這有待進一步研究。龍葵素主要成分為茄堿和卡茄堿兩種[17]，本試驗只對馬鈴薯培養(yǎng)液中α-茄堿進行了研究，對于卡茄堿的影響尚不清楚。

本試驗表明，添加外源枯草芽孢桿菌有助于降低青貯番茄秧中龍葵素的含量，促進番茄秧的飼料化利用。建議番茄秧青貯時添加外源枯草芽孢桿菌。