徐麗譚鉞宗曉娟吳舉彬 魏海蓉

(1.山東省果樹研究所，山東 泰安 271000；2.沂源縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山東 沂源 256100)

WRKY家族是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，其成員具有一個或兩個高度保守的WRKY結構域，N端包含一個保守的WRKYGQK七肽序列，C端包含一個C2H2或C2HC鋅指基序[1，2]。根據(jù)WRKY結構域的數(shù)量和C端鋅指基序的結構，WRKY家族可分為三類:Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ類[1]。自第一個WRKY蛋白(SPF1)[3]被發(fā)現(xiàn)以來，WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物中的功能研究取得了很大進展，發(fā)現(xiàn)WRKY在響應生物和非生物脅迫以及在植物信號傳導、生長發(fā)育調(diào)控中發(fā)揮著重要作用[4-7]。例如擬南芥的AtWRKY18、AtWRKY33和AtWRKY46已被證明參與病原體和水楊酸(SA)介導的 防 御 反 應[8-11]；AtWRKY8、AtWRKY25、At-WRKY33和AtWRKY47參與非生物脅迫反應[12-15]；AtWRKY71結合到FT和LFY的啟動子上，通過上調(diào)其表達，加速擬南芥的開花[16]；At-WRKY71可被H2O2、ABA和甘露醇快速誘導，可能在植物對非生物脅迫的響應中發(fā)揮作用[17]；水稻的OsWRKY71和OsWRKY51共同參與GA和ABA信號通路，控制α-淀粉酶活性，調(diào)節(jié)種子休眠[18]；OsWRKY71可以通過調(diào)控下游基因OsTGFR和WSI76的表達來提高轉(zhuǎn)基因水稻植株的耐寒性[19]；轉(zhuǎn)小麥TaWRKY71的擬南芥通過促進IAA向MeIAA轉(zhuǎn)化，改變生長素穩(wěn)態(tài)水平，從而引起葉片休眠[20]；香蕉的MaWRKY31、MaWRKY33、MaWRKY60和MaWRKY71基因表達在冷藏期間受ABA處理誘導，并且能直接結合到MaNCED1和MaNCED2基因啟動子的W-box上激活其表達[21]。目前關于WRKY基因功能的研究主要集中在草本植物如擬南芥、小麥、煙草、水稻中，在木本植物中報道的非常少，關于WRKY71轉(zhuǎn)錄因子在甜櫻桃砧木中的功能研究尚未見報道。

砧木是限制甜櫻桃生產(chǎn)的關鍵問題之一。甜櫻桃矮化砧木吉塞拉(Prunus cerasus×Prunus canescens)是將酸櫻桃與灰毛葉櫻桃進行種間雜交培育出的三倍體雜種，目前是甜櫻桃生產(chǎn)中最受歡迎的矮化砧木[22，23]，但是該品種的根系發(fā)育較弱，對寒冷、干旱和鹽分等環(huán)境脅迫的抵抗力較差，因此改善其抗逆性迫在眉睫。由于雜交的雜合性和多倍體性，利用傳統(tǒng)的雜交育種方法改良甜櫻桃砧木比較困難，而且周期較長，利用單基因或多基因遺傳轉(zhuǎn)化是有效改善該品種存在問題的一種有效方法，其中關鍵基因的挖掘是前提。鑒于WRKY基因在植物抵抗生物和非生物脅迫中的重要性，我們以甜櫻桃砧木‘Gisela 6’為材料，對其WRKY71轉(zhuǎn)錄因子進行功能鑒定，可為甜櫻桃砧木抗逆品種選育提供理論依據(jù)和技術支持，并為甜櫻桃的分子設計育種提供基因資源。

1 材料與方法

1.1 植物材料培養(yǎng)與處理

本試驗于2021年在山東省果樹研究所完成。甜櫻桃砧木‘Gisela 6’組培苗在附加0.5 mg/L 6-BA、30 mg/L蔗糖和6 mg/L瓊脂的MS基本培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，置于26℃恒溫培養(yǎng)箱(光照16 h、黑暗8 h)中培養(yǎng)3周后，分別轉(zhuǎn)移到添加200 mmol/L甘露醇、200 mmol/L NaCl、200 mmol/L茉莉酸甲酯(MeJA)和150 mmol/L水楊酸(SA)的培養(yǎng)基上，另將部分組培苗置于4℃培養(yǎng)箱中進行低溫脅迫處理，每個處理重復3次，每個重復9瓶。分別于處理0、2、4、6、12、24、48 h取組培苗葉片。放入液氮冷凍后保存于-80℃冰箱備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA的提取與PcWRKY71基因的克隆利用植物總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)提取‘Gisela 6’葉片總RNA，然后按照One-Step gDNA removal and cDNA synthesis試劑盒(全式金生物技術有限公司，北京)說明書進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

根據(jù)甜櫻桃轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)，設計合成PcWRKY71基因全長引物PcWRKY71-F(5′-CTACTTCCATGTCTGATCATGAAC-3′)和Pc-WRKY71-R(5′-AAGATGATCGTGATGAGAGGAG-3′)。以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板PCR擴增PcWRKY71全長序列。PCR反應體系包括2×Phanta?Max Buffer 25μL、Phanta?Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1μL、10 mmol/L dNTP Mix 1μL、10μmol/LPcWRKY71-F 2μL、10μmol/LPc-WRKY71-R 2μL和cDNA 2μL，ddH2O補足至50 μL。PCR反應程序為95℃預變性3 min；95℃變性15 s，56℃退火15 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。

PCR擴增產(chǎn)物通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的片段用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)切膠回收，將回收的目的片段連接到pEASY-Blunt載體上(全式金生物技術有限公司，北京)，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，在氨芐青霉素抗性的LB平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑取單個菌落進行PCR擴增檢測，陽性菌落送生工生物工程(青島)股份有限公司測序。

1.2.2PcWRKY71基因的生物信息學分析 用NCBI在線ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)預測PcWRKY71基因的開放閱讀框。用ProtParam(http://us.expasy.org/tools/ProtParam.html)預測基因編碼蛋白的分子量和等電點等；利用ProtScale軟件(http://www.expasy.org/cgibin/protscale.pl)分析氨基酸序列的疏/親水性；用Plant-mPLoc軟件(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)預測其亞細胞定位；利用MEGA 7.0軟件鄰位相連法(Neighbor-Joining，NJ)構建不同物種WRKY71蛋白序列的系統(tǒng)進化樹。

1.2.3 qRT-PCR檢測PcWRKY71在不同處理下的表達模式 利用試劑盒分別提取甘露醇、NaCl、MeJA、SA和4℃低溫處理后‘Gisela 6’組培苗葉片的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后利用qRTPCR檢測PcWRKY71基因在不同處理下的表達量。qRT-PCR的引物為qF(5′-GATAAGCATCAATCACAAC-3′)和qR(5′-TGTAATCCATAGGTCCTT-3′)，以甜櫻桃β-actin基因(accession no.FJ560908)作為內(nèi)參，參照Ultra SYBR mixture with Rox試劑盒(康為)說明書，利用ABI7500型熒光定量PCR儀進行擴增。qRT-PCR反應條件:95℃變性10 min；95℃變性15 s，55℃退火1 min，72℃延伸40 s，40個循環(huán)?；蛳鄬Ρ磉_量根據(jù)2-ΔΔCt方法計算。

2 結果與分析

2.1 PcWRKY71基因克隆與序列分析

以甜櫻桃砧木‘Gisela 6’葉片提取RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，以PcWRKY71-F和Pc-WRKY71-R為引物擴增獲得約1 000 bp大小的目的片段，經(jīng)測序分析，該片段大小為1 095 bp。經(jīng)NCBI的ORF Finder分析表明，PcWRKY71基因起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA，開放閱讀框為1 014 bp，編碼氨基酸337個(圖1)。通過核苷酸序列分析發(fā)現(xiàn)PcWRKY71有1個WRKY保守結構域和1個C2H2的鋅指基序(圖1)，表明其屬于WRKY家族第Ⅱ類成員。Prot-Param軟件分析結果表明，PcWRKY71編碼蛋白分子量為37.41 kDa，理論等電點為6.72，不穩(wěn)定系數(shù)為57.13，屬于不穩(wěn)定蛋白；親水性平均數(shù)(GRAVY)為-0.960，表明該蛋白親水性氨基酸的數(shù)量高于疏水性氨基酸數(shù)量，預測該蛋白為親水性蛋白。經(jīng)Plant-mPLoc軟件預測，PcWRKY71定位在細胞核上。

圖1 PcWRKY71基因的cDNA序列及預測的氨基酸序列

利用NCBI的BLAST程序進行序列比對，Pc-WRKY71基因序列與梅(XP＿008225356)、碧桃(XP＿007214251)、蘋果(XP＿008383508)和白梨(XP＿009353824)的WRKY71基因的核苷酸序列相似性分別為96%、94%、76%和75%。綜上，分離得到的cDNA序列是甜櫻桃砧木‘Gisela 6’的WRKY71基因，GenBank登錄號為MG450655。

2.2 PcWRKY71系統(tǒng)進化分析

為了分析PcWRKY71蛋白與其它植物同源蛋白的進化關系，在NCBI下載甜櫻桃、櫻花、梅、扁桃、碧桃、蘋果、白梨、野草莓、可可、陸地棉和野茶樹的WRKY71蛋白序列，通過MEGA 7.0構建系統(tǒng)進化樹。結果表明，甜櫻桃砧木與甜櫻桃和櫻花親緣關系最近，與陸地棉和野草莓親緣關系較遠(圖2)。

圖2 PcWRKY71轉(zhuǎn)錄因子與其他植物的WRKY71轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列的進化樹分析

2.3 PcWRKY71基因在非生物脅迫下的表達分析

為探究PcWRKY71是否參與甜櫻桃砧木對干旱、鹽害和低溫脅迫的響應，利用qRT-PCR方法對其在不同逆境脅迫下的表達情況進行分析，結果顯示，在甘露醇脅迫下，PcWRKY71基因的表達量在處理2 h開始升高，12 h達到最大值，之后下降，每一個時間點的表達量均高于未處理時(圖3)。NaCl脅迫后，PcWRKY71基因上調(diào)表達，在處理2 h快速上升，48 h達到最大值(圖4)。4℃低溫脅迫2 h，PcWRKY71基因表達量開始升高，6 h時表達量低于對照(0 h)，24 h表達量達到最大值(圖5)。表明干旱、鹽和低溫脅迫均能誘導Pc-WRKY71表達，尤其受甘露醇和NaCl脅迫誘導明顯。

圖3 200 mmol/L甘露醇處理下PcWRKY71基因的表達

圖4 200 mmol/L NaCl處理下PcWRKY71基因的表達

圖5 4℃低溫處理下PcWRKY71基因的表達

2.4 PcWRKY71基因在激素處理下的表達分析

SA和MeJA是植物防御病原菌侵染的兩個重要信號分子。為了明確PcWRKY71基因表達是否受激素影響，我們分析了SA和MeJA處理下PcWRKY71的表達量變化，結果顯示，在SA處理48 h內(nèi)，PcWRKY71基因表達量逐漸增加，但均低于對照(0 h)，說明SA對PcWRKY71具有負調(diào)控作用(圖6)；MeJA處理對PcWRKY71表達具有正調(diào)控作用，表達量均高于對照(0 h)，且在處理48 h內(nèi)先上升后下降，在處理6 h達到最大值(圖7)。

圖6 150 mmol/L水楊酸處理下PcWRKY71基因的表達

圖7 200 mmol/L茉莉酸甲酯處理下PcWRKY71基因的表達

3 討論與結論

WRKY71作為WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的一員，在調(diào)控植物生長發(fā)育和逆境脅迫等方面具有重要功能[16，20，24]。本研究從甜櫻桃砧木中克隆得到PcWRKY71基因，其編碼的蛋白具有典型的WRKY結構域WRKYGQK，屬于第Ⅱ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族，預測是一個不穩(wěn)定的親水性蛋白，亞細胞定位于細胞核上，這與水稻和香蕉的WRKY71轉(zhuǎn)錄因子的核定位結果一致，說明它可能在細胞核中起作用[25，26]。系統(tǒng)進化分析顯示甜櫻桃砧木與甜櫻桃和櫻花的親緣關系最近，與其都屬于薔薇科櫻亞屬一致。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物對脅迫反應信號轉(zhuǎn)導的重要組成部分。在水稻中OsWRKY71特異受冷脅迫誘導，正向調(diào)控水稻的抗寒性，但不受ABA、鹽、干旱處理的影響[19]。紅麻的HcWRKY71基因受鹽、干旱和重金屬鎘脅迫誘導表達，轉(zhuǎn)Hc-WRKY71基因提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗的耐鹽性[27]。我們對甜櫻桃砧木進行干旱、鹽害和低溫脅迫處理，結果表明PcWRKY71表達受干旱和鹽脅迫上調(diào)表達，對兩種脅迫的響應模式基本一致，均在處理2 h開始上調(diào)表達，分別在12、48 h表達量最高。PcWRKY71對低溫處理的響應僅在處理6 h時下調(diào)表達，其它時間均上調(diào)表達。因此推測PcWRKY71表達受多種非生物脅迫影響，但對不同脅迫的響應程度不同。

通過低溫、脫水、鹽脅迫、ABA、H2O2、乙烯、SA和MeJA處理，香蕉幼苗中MusaWRKY71的表達顯著上調(diào)，表明MusaWRKY71能響應多種脅迫[26]。水稻的OsWRKY71能被SA、MeJA、ACC多種防御信號分子上調(diào)，并在損傷和病原菌感染時上調(diào)，表明OsWRKY71可能在水稻生物脅迫應答中起作用[25]。為分析激素對PcWRKY71表達模式的影響，對甜櫻桃砧木進行SA和MeJA處理，結果顯示SA處理顯著抑制了PcWRKY71表達，這與在香蕉和水稻中的研究結果不同，說明不同物種中WRKY71基因?qū)に氐膽鸫嬖谝欢ú町?。MeJA處理后PcWRKY71上調(diào)表達，處理6 h表達量達到最高值，說明PcWRKY71基因可能在植物MeJA介導的信號途徑中起正調(diào)控作用，這與WRKY71在香蕉和水稻中的研究結果一致。

綜上所述，本研究從甜櫻桃砧木中克隆了PcWRKY71轉(zhuǎn)錄因子序列，具有典型的WRKY結構域，屬于第Ⅱ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族。Pc-WRKY71基因受干旱、鹽害和低溫等非生物脅迫誘導表達，并受激素SA和MeJA影響。本研究結果可為進一步揭示PcWRKY71基因的功能以及研究其在調(diào)節(jié)櫻桃抗逆性和響應植物激素過程中的作用提供參考。