董飛王燁楠朱嬌王傳增馬蕾齊宇王成鵬溫超張冀華呂曉惠

(1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院休閑農(nóng)業(yè)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華東都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/生態(tài)園藝植物育種山東省工程研究中心，山東 濟(jì)南 250100；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院黃河三角洲現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究院，山東 東營 257000；3.濟(jì)南麒麟花卉有限公司，山東 濟(jì)南 250100)

黃河三角洲是我國鹽堿地的集中分布區(qū)域，面積高達(dá)5 700 km2[1，2]，而且正在以每年1 300～2 000 hm2的速度遞增[3]。其近海地區(qū)土壤含鹽量較高，以濱海潮鹽土為主，林木分布受到土壤、地形限制，以致植物種類貧乏、植被類型單一，嚴(yán)重制約黃河三角洲地區(qū)的生態(tài)健康和農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[4]。挖掘植物自身的耐鹽能力，篩選和培育耐鹽品種，是現(xiàn)階段開發(fā)利用鹽漬土最為經(jīng)濟(jì)有效的途徑[5]。

草花包括一年生、二年生、多年生草花和宿根花卉、球根花卉以及草坪植物等。草花因其花色艷麗、花型多樣、種植周期短、觀賞期長(zhǎng)、管理粗放等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用到草坪鑲嵌、立體美化和花壇中，并廣泛應(yīng)用于休閑農(nóng)業(yè)與美麗鄉(xiāng)村景觀的打造和布置，被稱為“活的花藝”[6，7]。隨著美麗鄉(xiāng)村和花園城市建設(shè)的深入推進(jìn)和人民生活水平的不斷提高，國家對(duì)城市綠化美化越來越重視，草花產(chǎn)業(yè)得以蓬勃發(fā)展。有研究發(fā)現(xiàn)，向日葵[8]、錦葵[9]、鼠尾草[10，11]、大花金雞菊[12]、茶用菊[13]等草花不僅可以美化環(huán)境還具有一定的耐鹽性，在鹽漬土上生長(zhǎng)良好。因此，篩選和鑒評(píng)出較耐鹽的草花品種，對(duì)于豐富黃河三角洲的植被類型、有效利用鹽漬土，推動(dòng)黃河流域生態(tài)保護(hù)和高質(zhì)量發(fā)展具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

植物幼苗期對(duì)鹽脅迫較為敏感，如果能夠順利度過苗期就能夠迅速成景，因此常在幼苗期對(duì)植物進(jìn)行耐鹽性方面的研究[14，15]。國內(nèi)外學(xué)者已針對(duì)植物的耐鹽性及耐鹽品種的篩選進(jìn)行過大量研究[5，16-19]，但是對(duì)草花苗期耐鹽性鑒定及綜合評(píng)價(jià)的相關(guān)研究還未見報(bào)道。本試驗(yàn)采用NaCl對(duì)草花幼苗進(jìn)行鹽脅迫處理，以預(yù)試驗(yàn)方式研究不同濃度NaCl對(duì)草花幼苗鮮重干重、根冠比等生長(zhǎng)指標(biāo)以及葉片抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性、脯氨酸含量等生理指標(biāo)的影響，并在預(yù)試驗(yàn)篩選確定適宜鹽脅迫濃度的基礎(chǔ)上測(cè)定計(jì)算該濃度脅迫下15種草花的植株生長(zhǎng)和生理指標(biāo)，并對(duì)兩類指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性、主成分及聚類分析，以期確定苗期耐鹽性鑒定指標(biāo)，篩選出耐鹽性較強(qiáng)的草花種類，為草花耐鹽育種和生產(chǎn)上的應(yīng)用推廣提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試草花共15種，分別為向日葵(Helianthus annuusL.)、波斯菊(Cosmos bipinnataCav.)、百日草(Zinnia elegansJacq.)、地被菊(Chrysanthemum morifoliumRamat.)、常夏石竹(Dianthus plumariusL.)、蒲公英(TaraxacummongolicumHand.-Mazz.)、假龍頭(Physostegia virginiana)、耬斗菜(Aquilegia viridifloraPall.)、半枝蓮(Scutellaria barbataD.Don)、金盞菊(Calendula officinalisL.)、松果菊 [Echinaceapurpurea(Linn.)Moench]、蜀葵[Alcea rosea(Linn.)Cavan.]、小麗花(Dahlia pinnatecv.)、須苞石竹(Dianthus barbatusL.)、萬壽菊(Tagetes erectaL.)，均購自山東壽禾種業(yè)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

選取草花籽粒飽滿、大小一致的自然風(fēng)干種子，分別用HgCl2于種子表面消毒10 min，再用蒸餾水漂洗3次。之后25℃溫水浸種12 h，再將種子置于含有蛭石的育苗盤中，移至光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度400μmol/(m2·s)、晝夜光照周期各12 h、晝/夜溫度25℃/18℃和濕度70%～80%。每天用1/2Hoagland營養(yǎng)液(pH 5.7)澆透，直至兩葉一心時(shí)，取整齊度一致的幼苗移栽到盛有相同基質(zhì)的塑料盆(規(guī)格:高8 cm，上口徑9.2 cm，下口徑8.1 cm)中。每盆栽種1株，每種草花30盆。

為確定15種草花苗期耐鹽性篩選的適宜濃度，先進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)。待幼苗長(zhǎng)至四葉一心時(shí)，分別用含0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%NaCl的1/2Hoagland營養(yǎng)液進(jìn)行處理，以不含鹽1/2Hoangland營養(yǎng)液(pH 7.48)為對(duì)照。外施鹽溶液以剛滲出塑料盆為準(zhǔn)，保證鹽溶液滲透基質(zhì)，之后損失的水通過稱重法補(bǔ)充1/2Hoangland營養(yǎng)液，使基質(zhì)含水量維持在60%～70%。1/2Hoangland營養(yǎng)液每隔1 d換1次。處理20 d時(shí)全株取樣進(jìn)行株高、莖粗、植株鮮重干重等形態(tài)指標(biāo)和超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)活性及丙二醛(MDA)含量等生理指標(biāo)測(cè)定。通過分析得出0.8%NaCl脅迫下草花間生長(zhǎng)指標(biāo)和生理指標(biāo)差異最顯著，能有效辨別出草花苗期的差異，因此將耐鹽篩選的適宜濃度確定為0.8%NaCl，并以該濃度脅迫為準(zhǔn)測(cè)定計(jì)算植株生長(zhǎng)和生理指標(biāo)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.3.1 植株生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定 測(cè)定植株地上部鮮重干重、地下部鮮重干重、植株含水量，計(jì)算其相對(duì)地上部鮮重干重、相對(duì)地下部鮮重干重、相對(duì)根冠比和相對(duì)植株含水量。公式如下:

相對(duì)地上部鮮重(%)＝處理平均地上部鮮重/對(duì)照平均地上部鮮重×100；

相對(duì)地上部干重(%)＝處理平均地上部干重/對(duì)照平均地上部干重×100；

相對(duì)地下部鮮重(%)＝處理平均地下部鮮重/對(duì)照平均地下部鮮重×100；

相對(duì)地下部干重(%)＝處理平均地下部干重/對(duì)照平均地下部干重×100；

根冠比(%)＝植株地下部鮮重/植株地上部鮮重×100；

相對(duì)根冠比(%)＝處理平均根冠比/對(duì)照平均根冠比×100；

植株含水量(%)＝(植株鮮重-植株干重)/植株鮮重×100；

相對(duì)植株含水量(%)＝處理平均植株含水量/對(duì)照平均植株含水量×100。

1.3.2 生理指標(biāo)測(cè)定 過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)、脯氨酸含量各指標(biāo)測(cè)定參照王學(xué)奎的方法[20]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)法對(duì)15種草花鹽脅迫的耐受性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。隸屬函數(shù)值X(μ)如下式:

如果某一指標(biāo)與抗性指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)，則可以通過反隸屬函數(shù)計(jì)算其抗性隸屬函數(shù)值X(v):

式中:x為指標(biāo)測(cè)定值，xmin、xmax分別為所有參試草花某一指標(biāo)的最小值、最大值，最后再將每種草花各個(gè)指標(biāo)的隸屬值累加求其平均值[5]。

利用Microsoft Excel 2013和SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)整理與分析。采用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對(duì)草花苗期生長(zhǎng)的影響

NaCl脅迫下，15種草花各生長(zhǎng)指標(biāo)變化幅度不同，為了更客觀評(píng)價(jià)其耐鹽性，采用各指標(biāo)的相對(duì)值進(jìn)行比較分析。結(jié)果(表1)表明，相對(duì)地上部鮮重的變化范圍為13.96%～125.17%，其中金盞菊地上部鮮重高于對(duì)照；相對(duì)地下部鮮重的變化范圍為16.57%～77.78%，15種草花地下部鮮重均受到不同程度的抑制；相對(duì)地上部干重的變化范圍為10.13%～108.96%，只有金盞菊地上部干重高于對(duì)照；相對(duì)地下部干重的變化范圍為12.08%～66.67%，蜀葵受到抑制最嚴(yán)重，波斯菊受抑制程度最輕；相對(duì)根冠比的變化范圍為42.15%～127.03%，半枝蓮的根冠比超過對(duì)照；相對(duì)含水量的變化幅度很小，范圍為93.28%～110.39%，說明NaCl脅迫對(duì)15種草花的含水量影響較小。

表1 鹽脅迫下15種草花苗期各生長(zhǎng)指標(biāo)的相對(duì)值 (%)

2.2 鹽脅迫對(duì)草花苗期生理指標(biāo)的影響

15種草花苗期生理指標(biāo)的變化結(jié)果(表2)表明，鹽脅迫使地被菊、蒲公英、假龍頭、小麗花、萬壽菊的SOD活性低于對(duì)照，其它10種草花的SOD活性高于對(duì)照。鹽脅迫降低地被菊、常夏石竹、蒲公英、松果菊、蜀葵的脯氨酸含量，提高其它10種草花的脯氨酸含量。鹽脅迫下向日葵、常夏石竹、金盞菊、蜀葵、須苞石竹、萬壽菊的MDA含量低于對(duì)照，其它9種草花的MDA含量高于對(duì)照。鹽脅迫下15種草花的POD、CAT活性均低于對(duì)照，相對(duì)POD活性的變化范圍為26.78%～78.37%，其中金盞菊的POD活性僅為對(duì)照的26.78%；相對(duì)CAT活性的變化范圍為61.22%～86.08%，其中假龍頭的CAT活性僅為對(duì)照的61.22%。

表2 鹽脅迫下15種草花苗期各生理指標(biāo)的相對(duì)值 (%)

2.3 鹽脅迫下草花苗期各指標(biāo)間的相關(guān)性分析

對(duì)鹽脅迫下15種草花幼苗生長(zhǎng)和生理各指標(biāo)間進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果(表3)表明，植株地上部鮮重與地下部鮮重、地上部干重、地下部干重、POD活性呈極顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.643**、0.944**、0.691**、-0.792**；與脯氨酸含量呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.605*。地下部鮮重與地上部干重呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.662**；與MDA含量、POD活性呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.515*、-0.557*。地上部干重與地下部干重、POD活性呈極顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.726**、-0.756**；與脯氨酸含量呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.516*。地下部干重與POD活性呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.658**；與脯氨酸含量呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.600*。幼苗根冠比、植株含水量、SOD活性、CAT活性與其它指標(biāo)之間的相關(guān)性均沒有達(dá)到顯著水平。

表3 鹽脅迫下15種草花幼苗生長(zhǎng)和生理指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)

2.4 鹽脅迫下草花苗期各指標(biāo)的主成分分析

對(duì)11個(gè)生長(zhǎng)指標(biāo)和生理指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，結(jié)果(表4)顯示，5個(gè)主成分(第Ⅰ至第Ⅴ)的貢獻(xiàn)率分別為40.232%、16.453%、12.395%、8.646%和6.821%，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到84.547%，能代表統(tǒng)計(jì)指標(biāo)的絕大部分信息。各綜合指標(biāo)(y)的對(duì)應(yīng)特征向量為:

表4 鹽脅迫下15種草花幼苗各指標(biāo)的主成分分析及貢獻(xiàn)率

第Ⅰ主成分yⅠ＝0.445X1＋0.358X2＋0.439X3＋0.391X4-0.039X5-0.029X6＋0.021X7＋0.305X8-0.229X9-0.396X10＋0.151X11；

第Ⅱ主成分yⅡ＝0.057X1-0.206X2＋0.014X3＋0.143X4-0.299X5＋0.602X6-0.221X7＋0.209X8＋0.438X9＋0.082X10＋0.437X11；

第Ⅲ主成分yⅢ＝-0.176X1＋0.165X2-0.144X3-0.021X4＋0.468X5-0.251X6-0.626X7＋0.187X8-0.086X9＋0.074X10＋0.446X11；

第Ⅳ主成分yⅣ＝-0.020X1＋0.045X2-0.093X3-0.106X4＋0.563X5＋0.422X6＋0.556X7-0.062X8-0.181X9-0.049X10＋0.367X11；

第Ⅴ主成分yⅤ＝0.073X1-0.327X2＋0.050X3＋0.222X4＋0.456X5-0.152X6＋0.154X7＋0.540X8＋0.416X9＋0.084X10-0.331X11。

對(duì)第Ⅰ至第Ⅴ主成分的分析表明:第Ⅰ主成分表達(dá)式中，地上部鮮重(X1)和地上部干重(X3)的特征向量較大；第Ⅱ主成分表達(dá)式中，相對(duì)含水量(X6)的特征向量較大；第Ⅲ主成分表達(dá)式中，SOD活性(X7)的特征向量較大；第Ⅳ主成分表達(dá)式中，根冠比(X5)和SOD活性(X7)的特征向量較大；第Ⅴ主成分表達(dá)式中，脯氨酸含量(X8)的特征向量較大。綜上可提取SOD活性(X7)、相對(duì)含水量(X6)、根冠比(X5)、脯氨酸含量(X8)作為草花幼苗耐鹽性的鑒定指標(biāo)。

2.5 用模糊隸屬函數(shù)法綜合評(píng)價(jià)草花的耐鹽性

隸屬函數(shù)值反映了不同草花幼苗受NaCl影響的程度，其值越大，NaCl造成的影響越小，幼苗的耐鹽性越強(qiáng)。利用隸屬函數(shù)值的平均值對(duì)15種草花進(jìn)行耐鹽性排序，結(jié)果(表5)表明，幼苗耐鹽性最強(qiáng)的是金盞菊，最弱的是小麗花。

表5 鹽脅迫下15種草花幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)和生理指標(biāo)的隸屬值

2.6 15種草花幼苗耐鹽性聚類分析

采用歐氏距離平均連鎖法對(duì)15種草花耐鹽性進(jìn)行聚類分析(圖1)，共劃分為四類。其中，第一類包括小麗花、萬壽菊和蜀葵，其耐鹽性最弱；第二類包括耬斗菜、假龍頭、須苞石竹和百日草，其耐鹽性較弱；第三類包括蒲公英、波斯菊、松果菊、半枝蓮、常夏石竹和地被菊，其耐鹽性較強(qiáng)；第四類有金盞菊和向日葵，其耐鹽性最強(qiáng)。

圖1 15種草花耐鹽性聚類圖

3 討論

形態(tài)變化和生長(zhǎng)指標(biāo)是維持植物生物活性和反映受鹽脅迫程度的重要指標(biāo)[21，22]。鹽脅迫下野菊[15]、菊芋[5]、棉花[23，24]、番茄[25]等植物幼苗的根長(zhǎng)、鮮重、干重等均受到明顯抑制。但是也有研究表明，一定濃度的鹽溶液會(huì)促進(jìn)植物生長(zhǎng)。本試驗(yàn)中，金盞菊的地上部鮮重干重均高于對(duì)照，其它草花的地上部鮮重干重、地下部鮮重干重均受到不同程度的抑制。

在正常條件下，植物體內(nèi)活性氧(ROS)的產(chǎn)生和清除處于一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡，而鹽脅迫導(dǎo)致植物積累大量的活性氧，且活性氧的積累通常會(huì)破壞細(xì)胞膜的完整性，破壞氧化還原體系平衡。植物細(xì)胞膜的透性和丙二醛(MDA)含量被認(rèn)為是細(xì)胞膜受傷害程度的重要指標(biāo)[26，27]。研究表明，耐鹽性強(qiáng)的小麥[28]、黃瓜[29]、木槿[30]、番茄[25，31]的MDA含量較鹽敏感植物增加的少。本研究中，耐鹽草花金盞菊和向日葵的MDA含量低于對(duì)照，鹽敏感草花小麗花的MDA含量是對(duì)照的3.5倍。另外，植物在極端條件下還能通過調(diào)整SOD、POD、CAT活性等來保護(hù)自身。本試驗(yàn)表明，鹽脅迫下地被菊、蒲公英、假龍頭、小麗花、萬壽菊等鹽敏感草花的SOD活性低于對(duì)照，其它10種草花的SOD活性高于對(duì)照，而且15種草花的POD、CAT活性均低于對(duì)照。

脯氨酸可以保護(hù)膜系統(tǒng)、維持膜結(jié)構(gòu)，受到鹽脅迫時(shí)能夠平衡細(xì)胞中的高濃度鹽分、避免細(xì)胞脫水、抑制蛋白質(zhì)降解，從而防止酶失活，是一種十分重要的有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[30，31]。研究發(fā)現(xiàn)，高鹽脅迫下，紫羅蘭[32]、鹽角草、堿蓬、冰草[33]、菊芋[5]的脯氨酸含量均高于對(duì)照。本試驗(yàn)結(jié)果表明，耐鹽性強(qiáng)的向日葵、金盞菊其脯氨酸含量增加程度極顯著高于鹽敏感草花(蜀葵、蒲公英等)。

植物幼苗的耐鹽性涉及生理生化等多方面因素，也是一個(gè)綜合性狀的表現(xiàn)，確定其鑒定指標(biāo)至關(guān)重要。主成分分析顯示，全株干重、地上部鮮重、根長(zhǎng)、地下部含水量和地下部鮮重可以作為蕓豆幼苗耐鹽堿的主要鑒定指標(biāo)[19]；地上部鮮重、植株干重、SOD活性和脯氨酸含量可作為菊芋耐鹽性的鑒定指標(biāo)[5]；脯氨酸、丙二醛、可溶性蛋白含量及電解質(zhì)外滲率，都可作為評(píng)判番茄耐鹽性的重要指標(biāo)[25]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，幼苗SOD活性、相對(duì)含水量、根冠比、脯氨酸含量可作為草花幼苗耐鹽性的鑒定指標(biāo)。通過聚類分析可將15種草花苗期的耐鹽性劃分為四類，其中金盞菊、向日葵的耐鹽性最強(qiáng)，小麗花、萬壽菊、蜀葵的耐鹽性最弱。也有研究表明，小麗花、萬壽菊耐鹽性較強(qiáng)[9，34]。這可能是由于本試驗(yàn)的鹽脅迫是在苗期進(jìn)行，而之前的試驗(yàn)是進(jìn)行種子處理，也說明同一種草花不同時(shí)期耐鹽性的強(qiáng)弱不同。

4 結(jié)論

為了確定15種草花苗期耐鹽性篩選的適宜濃度，本研究先進(jìn)行相應(yīng)的預(yù)試驗(yàn)并通過試驗(yàn)結(jié)果分析得出，0.8%NaCl脅迫下草花間生長(zhǎng)指標(biāo)和生理指標(biāo)差異最顯著，能有效辨別出草花苗期的差異，因此將耐鹽篩選的適宜濃度確定為0.8%。在此濃度鹽脅迫條件下，主成分分析結(jié)果得出，SOD活性、相對(duì)含水量、根冠比、脯氨酸含量可作為草花幼苗耐鹽性的鑒定指標(biāo)。通過隸屬函數(shù)和聚類分析得出，金盞菊、向日葵的耐鹽性最強(qiáng)，其次是蒲公英、波斯菊、松果菊、半枝蓮、常夏石竹、地被菊。篩選出的較耐鹽草花可為耐鹽機(jī)理研究、黃河三角洲等含鹽量較高地區(qū)的生態(tài)保護(hù)和高質(zhì)量發(fā)展提供技術(shù)支撐。