張威祁進(jìn)康吳江梅李晉芳胡世俊閆曉慧

(1.西南林業(yè)大學(xué)生物多樣性保護(hù)學(xué)院/云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224；2.西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，云南 昆明 650224)

植物病毒病是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常見的一種病害，被稱為“植物癌癥”。煙草花葉病毒(TMV)是最具代表性的植物病毒。該病毒寄主范圍廣泛，可侵染400多種植物，并引起重大病害[1]，常見于茄科植物中，最容易為害煙草和番茄。TMV侵染植物后葉片呈花葉和壞死斑，造成植株畸形、矮化，甚至死亡，導(dǎo)致農(nóng)作物大幅度減產(chǎn)[2]。已有研究表明，多種植物提取物具有良好的抗TMV活性，且資源豐富，對環(huán)境友好，因此，開發(fā)高效、低毒、環(huán)保的抗病毒藥物逐漸成為研究熱點(diǎn)[3-5]。

薇甘菊(Mikania micranthaH.B.K.)屬菊科假澤蘭屬(Mikania)植物，被列為世界上最具危害性的100種外來入侵物種之一。薇甘菊有很強(qiáng)的攀援能力，可影響植物的光合作用，并吸取植物生長所需養(yǎng)分，最終導(dǎo)致植物死亡，對入侵地的經(jīng)濟(jì)和生物多樣性造成嚴(yán)重破壞[6]。已有文獻(xiàn)報(bào)道薇甘菊含有豐富的化學(xué)成分，粗提物具有調(diào)節(jié)植物生長、抗菌、抗癌、抗炎、殺蟲等作用[7-9]。但目前有關(guān)薇甘菊提取物抗煙草花葉病毒作用的研究未見報(bào)道。為此，本研究對薇甘菊提取物進(jìn)行了抗TMV活性追蹤，篩選具有抗TMV的有效成分，以期為薇甘菊綜合開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試植物 薇甘菊地上部于2016年8月采自云南騰沖(98°05′～98°46′E、24°38′～25°52′N)，由西南林業(yè)大學(xué)胡世俊副教授鑒定。

1.1.2 供試病毒 TMV(U1)普通株系，由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所提供，繁殖于普通煙K326上，參照Gooding等[10]的方法進(jìn)行提純。

1.1.3 供試寄主 TMV枯斑寄主為心葉煙(Nicotiana glutinosa)、TMV系統(tǒng)侵染寄主為普通煙K326，本課題組自行培育，待煙苗長至4～6片真葉時(shí)進(jìn)行活性測定。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 提取與分離 薇甘菊地上部(13.05 kg)干燥粉碎，甲醇回流提取3次，每次30 L，每次3 h，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮得到甲醇提取物。將所得提取物溶于水，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，通過減壓濃縮得到石油醚萃取物(234.55 g)、乙酸乙酯萃取物(120.15 g)、正丁醇萃取物(213.00g)。乙酸乙酯萃取物經(jīng)硅膠(200～300目)柱色譜分離，用石油醚-丙酮(1∶0-0∶1)體系為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，經(jīng)TLC檢測，得到Fr1～Fr55個(gè)不同餾分。正丁醇萃取物經(jīng)大孔樹脂、乙醇-水(0∶95-95∶0)梯度洗脫，濃縮得到Fr1～Fr55個(gè)不同餾分。石油醚萃取物經(jīng)硅膠(200～300目)柱色譜分離，用石油醚-丙酮(1∶0-0∶1)梯度洗脫，濃縮得到Fr1～Fr55個(gè)不同餾分。

1.2.2 抗TMV活性測定 采用活體半葉枯斑法測定[4，11]。挑選健康長勢一致的心葉煙，每株挑選葉齡和葉片大小相似的3片上部葉，用提取物處理葉片的一半，另一半用相同濃度的DMSO處理作為對照，以市售寧南霉素作為陽性對照。采用三種處理方式:(1)先施藥:在接種病毒前6 h將提取物涂抹在葉片上；(2)后施藥:在接種病毒后6 h將提取物涂抹在葉片上；(3)混合施藥:將提取物與病毒充分混勻30 min后接種病毒。用金剛砂摩擦接種病毒，接種10 min后用蒸餾水將金剛砂洗凈，將煙苗放在無蟲溫室中培養(yǎng)，3～4 d后待枯斑癥狀明顯時(shí)，統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果，并計(jì)算抑制率。

抑制率(%)＝(對照平均枯斑數(shù)-處理平均枯斑數(shù))/對照平均枯斑數(shù)×100。

1.2.3 抑制病毒增殖活性測定 采用離體半葉枯斑法[11]測定。挑選葉齡和葉片大小適中的3片中上部葉，全葉摩擦接種TMV 200μL，接種病毒后6 h將葉片剪下，沿中脈將葉片一分為二，左半葉浸入盛有1 mg/mL供試提取物的培養(yǎng)皿中作為處理，右半葉浸入盛有1 mg/mL DMSO溶液的培養(yǎng)皿中作為對照，以市售寧南霉素作為陽性對照。每個(gè)提取物3次重復(fù)，放在室內(nèi)培養(yǎng)，48 h后統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果，按上述公式計(jì)算抑制率。

1.2.4 抑制病毒活性測定 采用葉圓片法測定[3]。噴施DMSO溶液作為對照，噴施1 mg/mL提取物作為處理，以寧南霉素為陽性對照。施藥24 h后接種TMV，48 h后打直徑為1 cm的圓片，每片葉打取10個(gè)置于離心管中。用ELISA法[12]測定OD405值，以健康煙苗作為陰性對照。以處理OD405/陰性對照OD405值＞2.1作為陽性判斷的標(biāo)準(zhǔn)[13]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，運(yùn)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件(One-Way ANOVA，Duncan post hoc testP＜0.05)進(jìn)行多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取物對TMV的抑制活性

由表1可知，先施藥結(jié)果表明，甲醇提取物、正丁醇萃取物對TMV的抑制活性最強(qiáng)，抑制率分別為60.03%、58.61%，均顯著高于寧南霉素；石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、水層均低于寧南霉素。后施藥結(jié)果表明，甲醇提取物、石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物對TMV侵染有較好的治療作用，抑制率均顯著高于寧南霉素；正丁醇萃取物和水層對TMV無治療活性?；旌鲜┧幗Y(jié)果表明，甲醇提取物、石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物對TMV有不同程度的鈍化活性(圖1)，其中甲醇提取物的鈍化活性顯著，抑制率為70.27%，顯著高于寧南霉素；乙酸乙酯萃取物的抑制率為50.00%，與寧南霉素相當(dāng)；石油醚萃取物低于寧南霉素；正丁醇萃取物和水層對TMV無體外鈍化活性。

表1 不同提取物對TMV侵染的抑制率 (%)

圖1 薇甘菊不同溶劑提取物對TMV的鈍化作用

2.2 萃取物餾分對TMV的抑制活性

在萃取物的活性測定中，由于正丁醇萃取物僅表現(xiàn)出保護(hù)作用，故僅篩選正丁醇萃取物各餾分的保護(hù)作用。萃取物餾分抗TMV活性見圖2，從保護(hù)活性的結(jié)果來看，正丁醇萃取物餾分Fr2對TMV侵染有較好的保護(hù)作用，抑制率為56.83%，高于寧南霉素(49.30%)，其他萃取物餾分的保護(hù)活性均低于寧南霉素。從治療活性的結(jié)果來看，乙酸乙酯萃取物餾分Fr4和餾分Fr5對TMV的治療活性顯著，抑制率分別為52.75%、52.11%，均高于寧南霉素(47.77%)；石油醚萃取物餾分Fr3和乙酸乙酯萃取物餾分Fr3的治療活性均相當(dāng)于寧南霉素；石油醚萃取物餾分Fr1、Fr4、Fr5對TMV無治療活性，其他萃取物餾分的治療活性均低于寧南霉素。從鈍化活性的結(jié)果來看，石油醚萃取物餾分Fr4和乙酸乙酯萃取物餾分Fr2～Fr4對TMV的鈍化活性顯著，抑制率分別為71.67%、63.27%、58.00%、58.52%，均顯著高于寧南霉素；石油醚萃取物餾分Fr1、Fr2和Fr5無鈍化作用，其他萃取物餾分的鈍化活性均低于寧南霉素。

圖2 萃取物餾分對TMV侵染的抑制作用

2.3 提取物對TMV增殖活性的影響

由表2可知，5種提取物均具有抑制TMV增殖的作用，其中甲醇提取物抑制活性較顯著，抑制率高達(dá)53.14%，略低于寧南霉素；正丁醇、乙酸乙酯、石油醚、水層4種提取物的抑制增殖活性均顯著低于寧南霉素。由表3可知，石油醚萃取物中餾分Fr4對TMV增殖抑制活性最強(qiáng)，抑制率高達(dá)61.42%，顯著高于寧南霉素；餾分Fr2次之；餾分Fr1、Fr3、Fr5對TMV增殖無抑制作用。乙酸乙酯萃取物中餾分Fr1～Fr5對TMV增殖有不同的抑制作用，抑制率在18.34%～48.95%之間，抑制率均低于寧南霉素。正丁醇萃取物中，餾分Fr1～Fr5對TMV增殖抑制活性較強(qiáng)，5個(gè)餾分間抑制活性差異不顯著，且均低于寧南霉素。

表2 不同提取物對TMV增殖的抑制作用

表3 萃取物餾分對TMV增殖的抑制率 (%)

2.4 葉圓片間接ELISA檢測結(jié)果

由圖3可知，除水層外，其他4種提取物對TMV增殖均有較好的抑制作用，高于寧南霉素；由圖4可知，石油醚萃取物餾分Fr1、乙酸乙酯萃取物餾分Fr5、正丁醇萃取物餾分Fr3和餾分Fr5對TMV增殖均有顯著的抑制作用，高于寧南霉素。試驗(yàn)結(jié)果顯示，處理OD405/陰性對照OD405值均小于2.1，即提取物及萃取物餾分的間接ELISA檢測結(jié)果均表現(xiàn)為陰性，說明提取物及萃取物餾分均具有抑制TMV增殖的活性。

圖3 提取物間接ELISA檢測結(jié)果

圖4 萃取物餾分間接ELISA檢測結(jié)果

3 討論與結(jié)論

植物源活性物質(zhì)具有低毒、低成本、對環(huán)境友好等特點(diǎn)，近年來，有關(guān)植物源抗TMV活性物質(zhì)的研究報(bào)道逐漸增加。郭文慧等[14]研究發(fā)現(xiàn)山蒼子、平姜、苦參、八角、白屈菜、余甘子和五倍子植物提取物對煙草具有顯著的誘抗活性。目前，從植物中分離得到的倍半萜內(nèi)酯、檸檬苦素、苦木素等化合物均有較強(qiáng)的抗TMV活性。因此，從植物中分離純化化合物、篩選具有抗病毒活性的化合物，已經(jīng)被證明是一種對抗植物病毒的有效方法[15-17]。

已有研究報(bào)道，薇甘菊提取物具有抗菌、抗腫瘤、抗病毒等作用[18，19]，但至今未見有關(guān)抗煙草花葉病毒的報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)薇甘菊甲醇提取物對TMV的侵染有較強(qiáng)的保護(hù)、治療和鈍化作用，且活性均顯著高于寧南霉素，表明薇甘菊中存在抑制煙草花葉病毒增殖的活性物質(zhì)。對薇甘菊提取物進(jìn)行活性追蹤發(fā)現(xiàn)，從保護(hù)活性的結(jié)果來看，正丁醇萃取物餾分Fr2對TMV侵染有較好的保護(hù)作用，高于寧南霉素，其他萃取物餾分的活性均低于寧南霉素。從治療活性的結(jié)果來看，乙酸乙酯萃取物餾分Fr4和餾分Fr5對TMV的治療活性顯著高于寧南霉素；石油醚萃取物餾分Fr3和乙酸乙酯萃取物餾分Fr3的治療活性相當(dāng)于寧南霉素；石油醚萃取物餾分Fr1、Fr4、Fr5無治療作用，其他萃取物餾分的治療活性均低于寧南霉素。從鈍化活性的結(jié)果來看，石油醚萃取物餾分Fr4和乙酸乙酯萃取物餾分Fr2～Fr4的鈍化活性均顯著高于寧南霉素；石油醚萃取物餾分Fr1、Fr2、Fr5無鈍化作用，其他萃取物餾分的鈍化活性均低于寧南霉素。結(jié)果顯示乙酸乙酯萃取物各餾分均表現(xiàn)出保護(hù)、治療和鈍化作用，表明抑制TMV增殖的活性成分主要集中在乙酸乙酯層，可能是因?yàn)橹械葮O性成分更容易被煙草吸收和利用，而各餾分對TMV的抑制作用有顯著差異，這可能與各餾分的化學(xué)成分和抗病毒物質(zhì)不同有關(guān)。提取物均具有抑制TMV增殖的作用，其中甲醇提取物抑制活性較顯著，高于寧南霉素；提取物及萃取物餾分能抑制TMV在烤煙K326中增殖。

植物中的抗病毒作用通常是多種成分綜合作用的結(jié)果。梁紅艷等[20]在從木瓜中分離抗TMV活性成分的過程中發(fā)現(xiàn)，隨著抗TMV活性成分的逐步分離，組分的抗TMV活性呈下降趨勢。沈建國等[21]在研究臭椿抗TMV活性的過程中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)硅膠柱層析分離得到的組分對TMV的抑制活性均低于原臭椿乙醇提取物。譚慶偉[22]對臭椿抗TMV活性的研究結(jié)果表明，臭椿抗TMV侵染和增殖的活性是由一類或幾類物質(zhì)的協(xié)同作用形成的。本研究發(fā)現(xiàn)薇甘菊甲醇提取物抗TMV活性顯著，隨著薇甘菊中抗TMV活性成分的逐步分離，組分對TMV的抗病毒活性呈下降趨勢，分析其原因可能是由于分離過程中部分活性成分丟失或抗TMV活性是多種成分的協(xié)同作用。本研究以薇甘菊為研究對象，擴(kuò)展了抗TMV活性物質(zhì)的研究范圍，進(jìn)一步豐富了薇甘菊的生物活性譜，下一步將對活性好的組分中具體起作用的化學(xué)成分進(jìn)行分析，為進(jìn)一步開發(fā)植物源生物農(nóng)藥提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。