劉玉龍，孫 敏，劉 科，顏貴明

（安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230012）

在先天免疫反應(yīng)期間，炎癥被激活以保護(hù)宿主組織和細(xì)胞免受病原體的損害，然而炎癥介質(zhì)持續(xù)刺激下的過度炎癥反應(yīng)已被證明會促進(jìn)組織損傷和慢性炎癥，此外持續(xù)的氧化應(yīng)激可以激活多種轉(zhuǎn)錄因子，這也可能導(dǎo)致慢性炎癥［1，2］。巨噬細(xì)胞是炎癥反應(yīng)的重要組成部分，并已被各種刺激物激活，如誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)的脂多糖（LPS），多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，LPS 通過激活toll 樣受體4（TLR4）激活巨噬細(xì)胞中的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、核因子（NF）?κB通路，引起機(jī)體氧化應(yīng)激和炎癥損傷［3，4］。丹皮酚（paeonol）來自于芍藥科植物牡丹的干燥根及根莖中的有效成分之一。多項(xiàng)研究表明，丹皮酚具有抗氧化、抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛、降脂、抗酒精性肝損傷等作用［5，6］。本課題組前期研究表明，酒精可破壞小鼠腸屏障，致使腸道中炎癥介質(zhì)經(jīng)門靜脈進(jìn)入引起肝臟損傷，丹皮酚干預(yù)組肝炎癥損傷減輕，腸屏障有所改善［7，8］。但丹皮酚改善炎性介質(zhì)LPS 致肝損傷機(jī)制目前尚不清楚，因此本研究使用LPS 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7 損傷，探究丹皮酚對TLR4/MAPK/NF?κB 通路的影響，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

巨噬細(xì)胞RAW264.7（上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞生物學(xué)研究所），DMEM 培養(yǎng)基購自武漢塞維爾生物科技有限公司，貨號（G4510）；丹皮酚（＆gt;99%）購自宣城市百草植物工貿(mào)有限公司，貨號（T1903202）；TAK242（TLR4 抑制劑）購自美國MedChemexpress 生 物 科 技 公 司 ，貨 號（HY?100523）；CCK8 試劑盒、脂多糖（LPS）購自合肥 Biosharp 生 物 公 司，貨 號 分 別（BS350B）（BS904）；胎牛血清購自天津康源生物技術(shù)有限公司，貨號（KY?01000S）；GSH、MDA 生化試劑盒購自南京建成生物工程研究所，貨號分別（A006?1?1）（A003?1?1）；線粒體膜電位檢測試劑盒（JC?1）購自北京索萊寶公司，貨號（M8650）；p38MAPK 抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，貨號（14064?1?AP）；TLR4 抗體購自美國Affinity 公司，貨 號（AF7017）；NF?κB、p?NF?κB、p?p38、JNK、p?JNK 抗體購自成都正能生物技術(shù)有限責(zé)任公司，貨 號 分 別（380172）（310052）（310091）（201001）（340810）；電泳儀購自北京六一儀器廠；K3 型酶標(biāo)儀購自美國賽默飛世爾科技公司；OLYMPUS?BX81 倒置顯微鏡購自日本奧林巴斯公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 巨噬細(xì)胞RAW264.7 培養(yǎng) 將RAW264.7細(xì)胞置于含有10%胎牛血清、1%青霉素?鏈霉素的DMEM 培 養(yǎng) 基 中，放 于37℃、5%CO2培 養(yǎng) 箱 中培養(yǎng)。

1.2.2 CCK8 法檢測不同濃度LPS 處理后的細(xì)胞活性 將巨噬細(xì)胞RAW264.7 種在96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，細(xì)胞種板濃度3×105/ mL，24 h 后分別用0、0.25、0.5、1、2、4 μg/mL LPS，每組3 個平行孔，置于培養(yǎng)箱中24 h 后，每孔加入10 μL CCK8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h 后使用酶標(biāo)儀在450 nm 波長處檢測每孔吸光度。

1.2.3 Western blotting 篩 選 丹 皮 酚 及TAK242 干預(yù)濃度 將巨噬細(xì)胞RAW264.7 3×105/ mL 接種于6 孔板中，每孔2 mL，培養(yǎng)24 h 后棄掉培養(yǎng)基，將細(xì)胞分成8 組，空白組加入2 mL 培養(yǎng)基、LPS（1 μg/mL）組加入2 mL LPS 濃度為1 μg/mL 培養(yǎng)基、丹皮酚各組加入2 mL LPS 濃度為1 μg/mL 及丹皮酚濃 度 分 別 為480、240、120 μmol/mL 培 養(yǎng) 基，TAK242 各組加入LPS 濃度為1 μg/mL 及TAK242濃度分別為20、10、5 μmol/mL 培養(yǎng)基，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)基，加入PBS 緩沖液清洗2 遍。加入1 mL PBS 溶液，使用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞，12 000 r/min 離心5 min，棄去PBS，加入含1% PMSF 及2% 磷酸酶抑制劑的裂解液中，提取組織蛋白。煮沸10 min 變性，冷卻后電泳。一抗稀釋比例TLR4、NF?κB、p?NF?κB 均1∶1 000，二抗稀釋比例（1∶5 000）。蛋白條帶顯色曝光后，使用Image?J 軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.2.4 細(xì)胞形態(tài)觀察 將巨噬細(xì)胞RAW264.7 3×105/ mL 接種于6 孔板中，每孔2 mL，培養(yǎng)24 h 后棄掉培養(yǎng)基，將細(xì)胞分成4 組，空白組加入2 mL 培養(yǎng)基、LPS（1 μg/mL）組加入2 mL LPS 濃度為1 μg/mL 培養(yǎng)基、丹皮酚（240 μmol/mL）組加入2 mL LPS 濃度為1 μg/mL 及丹皮酚濃度為240 μmol/mL 培養(yǎng)基和TAK242（10 μmol/mL）組加入2 mL LPS 濃 度 為1 μg/mL 及TAK242 濃 度 為10 μmol/mL 培養(yǎng)基，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后，使用倒置顯微鏡進(jìn)行拍照（×200）。

1.2.5 細(xì)胞培養(yǎng)液中GSH、MDA 含量檢測 造模方法同1.2.4，培養(yǎng)24 h 后，取出培養(yǎng)基3 000 r/min離心10 min，取上清，按照GSH、MDA 試劑盒說明書進(jìn)行測定。

1.2.6 細(xì)胞線粒體膜電位檢測 造模方法同1.2.4，培養(yǎng)24 h 后，棄去培養(yǎng)基，加入PBS 緩沖液清洗兩遍。加入1 mL 細(xì)胞培養(yǎng)液和1 mL JC?1 染色工作液，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育20 min。之后吸出上清，加入JC?1 染色緩沖液洗滌2 次，再加入2 mL 細(xì)胞培養(yǎng)基在倒置熒光顯微鏡下拍照（×200）。

1.2.7 免疫熒光法檢測F4/80 及p?NF?κB 蛋白表達(dá)分布 造模方法同1.2.4，培養(yǎng)24 h 后，棄去培養(yǎng)基，加入PBS 緩沖液清洗兩遍。4%多聚甲醛固定20 min，PBS 清洗3 次，0.1%Triton X?100 透 化5 min，PBS 清洗3 次，10%BSA 封閉30 min，滴加F4/80（1∶50）及p?NF?κB（1∶100）抗體于4℃冰箱孵育過夜，清洗3 次，滴加山羊抗兔IgG?FITC（1∶100），孵育1 h，PBS 洗3 次，滴加DAPI 工作液，染色5 min，PBS洗3 次，熒光扛衰減封片劑封片，倒置熒光顯微鏡拍照（×200）。

1.2.8 Western blotting 檢測TLR4/MAPK/NF?κB通路蛋白表達(dá) 造模方法同1.2.4，蛋白提取方法同1.2.3。一抗稀釋比例p38、p?p38、JNK、p?JNK、IκB、p?IκB 抗體均1∶1 000，二抗稀釋比例（1∶5 000）。蛋白條帶顯色曝光后，使用Image?J 軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 LPS 致巨噬細(xì)胞RAW264.7 活性最佳濃度篩選

當(dāng)LPS 濃度在1 μg/mL 時細(xì)胞活性O(shè)D 值為0.4972±0.061，且與空白組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＆lt;0.01、P＆lt;0.001），更 接 近 半 數(shù) 抑 制 率。見表1。

表1 LPS 致巨噬細(xì)胞RAW264.7 活性最佳濃度篩選（n=3）Tab1 Selection of the best concentration of LPS?induced macrophage RAW264.7 activity（n=3）

表1 LPS 致巨噬細(xì)胞RAW264.7 活性最佳濃度篩選（n=3）Tab1 Selection of the best concentration of LPS?induced macrophage RAW264.7 activity（n=3）

注：與0 組比較，##P＆lt;0.01、###P＆lt;0.001。

吸光度值1.676 7±0.002 0.694 4±0.057##0.587 3±0.062##0.497 2±0.061##0.261 6±0.015###0.039 0±0.001###525.134 0.027 LPS 濃度（μg/mL）0 0.25 0.50 1 2 4 F P

2.2 丹皮酚與TAK242 濃度篩選

為了檢測丹皮酚、TAK242 對于LPS 刺激下的巨噬細(xì)胞RAW264.7 的最佳濃度篩選，分別檢測了不同劑量下的丹皮酚、TAK242 預(yù)處理過的LPS 刺激 下 的 巨 噬 細(xì) 胞RAW264.7 的TLR4、NF?κB、p?NF?κB 蛋 白 的 表 達(dá)。與 空 白 組 比 較，LPS 組TLR4、p?NF?κB 蛋白表達(dá)顯著升高（P＆lt;0.01、P＆lt;0.001）。與LPS 組比較，丹皮酚在240 μmol/mL、TAK242 在10 μmol/mL TLR4、p?NF?κB 蛋白表達(dá)降低更顯著（P＆lt;0.05、P＆lt;0.01）。見圖1、2，表2。

表2 丹皮酚與TAK242 不同濃度下p?NF?κB/NF?κB 與TLR4 相對表達(dá)（n=3，）Tab2 Relative expressions of p?NF?κB/NF?κB and TLR4 at different concentrations of paeonol and TAK242（n=3）

表2 丹皮酚與TAK242 不同濃度下p?NF?κB/NF?κB 與TLR4 相對表達(dá)（n=3，）Tab2 Relative expressions of p?NF?κB/NF?κB and TLR4 at different concentrations of paeonol and TAK242（n=3）

注：與空白組比較，##P＆lt;0.01、###P＆lt;0.001，與LPS 組比較，*P＆lt;0.05、**P＆lt;0.01。

TLR4 0.34±0.056 0.63±0.106##0.39±0.072*0.35±0.080**0.42±0.138*4.476 0.363組別（μmol/mL）空白組LPS 組丹皮酚（480μmol/mL）丹皮酚（240μmol/mL）丹皮酚（120μmol/mL）組別（μmol/mL）空白組LPS 組TAK242（20μmol/mL）TAK242（10μmol/mL）TAK242（5μmol/mL）F P p?NF?κB/NF?κB 0.63±0.084 1.05±0.140###0.72±0.036**0.70±0.099**0.80±0.025**10.458 0.164 F P

圖1 丹皮酚不同濃度下p?NF?κB/NF?κB 相對表達(dá)Fig1 Relative expression of p?NF?κB/NF?κB in paeonol at different concentrations

圖2 TAK242 不同濃度下TLR4 相對表達(dá)Fig2 Relative expression of TLR4 at different concentra?tions of TAK242

2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

通過200 倍顯微鏡觀察，空白組細(xì)胞體積小，形態(tài)圓潤；LPS 組細(xì)胞分化嚴(yán)重，呈不規(guī)則形態(tài)，有形似偽足出現(xiàn)；丹皮酚組細(xì)胞分化明顯改善，細(xì)胞大部分恢復(fù)近圓潤形態(tài)。見圖3。

圖3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化Fig3 Morphological changes of cells

2.4 細(xì)胞培養(yǎng)液中GSH、MDA 含量水平

與空白組比較，LPS 組細(xì)胞培養(yǎng)液中GSH 含量顯著降低，MDA 含量升高（P＆lt;0.01、P＆lt;0.001）；與LPS 組比較，丹皮酚組細(xì)胞培養(yǎng)液中GSH 含量顯著增 高，MDA 含 量 降 低（P＆lt;0.01、P＆lt;0.001）。見表3。

表3 細(xì)胞培養(yǎng)液中GSH、MDA 含量水平（n=4，）Tab3 Content levels of GSH and MDA in cell culture medi?um（（n=4，）

表3 細(xì)胞培養(yǎng)液中GSH、MDA 含量水平（n=4，）Tab3 Content levels of GSH and MDA in cell culture medi?um（（n=4，）

注：與空白組比較，##P＆lt;0.01、###P＆lt;0.001，與LPS 組比較，**P＆lt;0.01、***P＆lt;0.001。

MDA(mmol/mg)3.23±1.05 9.34±1.25###4.52±1.83***3.87±0.75***18.935 0.522組別空白組LPS 組丹皮酚組TAK242 組F P GSH(μmol/mg)79.41±6.89 56.37±8.97##75.00±5.40**74.02±8.07**7.439 0.853

2.5 細(xì)胞線粒體膜電變化

JC?I 為熒光探針，可快速靈敏檢測細(xì)胞線粒體膜電位，在線粒體膜電位較高時產(chǎn)生紅色熒光，線粒體膜電位較低時產(chǎn)生綠色熒光。通過200 倍熒光倒置顯微鏡觀察，與空白組比較，LPS 組細(xì)胞紅色熒光弱，綠色熒光強(qiáng)（P＆lt;0.001）；與LPS 組比較，丹皮酚組紅色熒光相對變強(qiáng)，綠色熒光相對減弱（P＆lt;0.001）。見圖4，表4。

圖4 細(xì)胞線粒體膜電變化Fig4 Electrical changes of cell mitochondrial membrane

表4 細(xì)胞線粒體膜電變化紅綠熒光比值（n=3，）Tab4 Ratio of red?green fluorescence of electrical changes in mitochondrial membrane of cells（n=3，）

表4 細(xì)胞線粒體膜電變化紅綠熒光比值（n=3，）Tab4 Ratio of red?green fluorescence of electrical changes in mitochondrial membrane of cells（n=3，）

組別空白組LPS 組丹皮酚組TAK242 組F P紅綠熒光比值1.36±0.054 0.43±0.124###1.09±0.190***1.14±0.208***23.448 0.058

2.6 免 疫 熒 光 法 檢 測F4/80 及p?NF?κB 蛋 白 表 達(dá)分布

通過200 倍熒光倒置顯微鏡觀察，與空白組比較，LPS 組F4/80（紅色）、p?NF?κB（綠色）表達(dá)分布增多（P＆lt;0.001）；與LPS 組比較，丹皮酚組F4/80（紅色）、p?NF?κB（綠色）表達(dá)分布降低（P＆lt;0.01、P＆lt;0.001）。見圖5，表5。

圖5 免疫熒光法檢測F4/80 及p?NF?κB 蛋白表達(dá)分布Fig5 Expression distribution of F4/80 and p?NF?κB proteins detected by immunofluorescence assay

表5 免疫熒光法檢測F4/80 及p?NF?κB 蛋白表達(dá)AOD 值（n=3，）Tab5 AOD values of F4/80 and p?NF?κB protein expres?sions detected by immunofluorescence assay（n=3，）

表5 免疫熒光法檢測F4/80 及p?NF?κB 蛋白表達(dá)AOD 值（n=3，）Tab5 AOD values of F4/80 and p?NF?κB protein expres?sions detected by immunofluorescence assay（n=3，）

組別空白組LPS 組AOD（F4/80）3.67±0.149 5.35±0.146###AOD（p?NF?κB）4.8133±0.328 8.9733±0.551###丹皮酚組3.96±0.228***6.0267±0.399**TAK242 組4.06±0.243***6.2100±1.319**F P 43.284 0.569 23.448 0.055

2.7 Western blotting 檢測TLR4/MAPK/NF?κB 通路蛋白表達(dá)

與 空 白 組 比 較，LPS 組TLR4、p?p38、p?JNK、p?IκB、p?NF?κB 蛋白表達(dá)增高（P＆lt;0.01）；與LPS 組比 較，丹 皮 酚 組TLR4、p?p38、p?JNK、p?IκB、p?NF?κB 蛋白表達(dá)降低（P＆lt;0.05、P＆lt;0.01）。見圖6，表6。

圖6 Western blotting 檢測TLR4/MAPK/NF?κB 通路蛋白表達(dá)Fig6 Expression of TLR4/MAPK/NF?κB pathway pro?tein detected by Western blotting

表6 Western blotting 檢測TLR4/MAPK/NF?κB 通路蛋白相對表達(dá)（n=3，）Tab6 Relative expression of TLR4/MAPK/NF?κB pathway protein detected by Western blotting（n=3，）

表6 Western blotting 檢測TLR4/MAPK/NF?κB 通路蛋白相對表達(dá)（n=3，）Tab6 Relative expression of TLR4/MAPK/NF?κB pathway protein detected by Western blotting（n=3，）

組別空白組LPS 組丹皮酚組TAK242 組F P TLR4 0.49±0.007 0.83±0.123##0.62±0.087*0.64±0.110*6.778 0.060 p?p38/p38 0.81±0.124 1.34±0.064##0.85±0.224**0.94±0.081**9.473 0.281 p?JNK/JNK 0.47±0.144 1.16±0.335##0.60±0.215*0.61±0.164*5.289 0.466 p?IκB/IκB 0.67±0.137 1.26±0.290##0.78±0.158*0.70±0.113**6.495 0.157 p?NF?κB/NF?κB 0.30±0.035 0.53±0.037##0.36±0.030**0.35±0.090**10.809 0.068

3 討論

中藥具有功效多、多靶點(diǎn)、毒副作用小等優(yōu)勢，中藥單體成分清楚，質(zhì)量可控，往往起關(guān)鍵作用，現(xiàn)在，基于中藥單體的新藥研發(fā)，是開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)新藥的重要途徑之一［9］。多項(xiàng)研究表明，丹皮酚藥理學(xué)作用豐富，Li 等［10］研究發(fā)現(xiàn)，丹皮酚可通過NF?κB 途徑介導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡；Xu 等［11］研究發(fā)現(xiàn)，丹皮酚可改善LPS 誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷，其機(jī)制可能與改善線粒體功能和NF?κB 易核相關(guān)； Guo等［12］研究表明，丹皮酚通過激活Nrf2 信號通路保護(hù)黑素細(xì)胞免受H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷。RAW264.7 細(xì)胞在免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要功能，正常情況下，機(jī)體中的RAW264.7 細(xì)胞處于相對靜止的狀態(tài)，僅具有一定的趨化能力和非特異性吞噬能力。當(dāng)炎性介質(zhì)被RAW264.7 細(xì)胞膜表面受體識別并激活巨噬細(xì)胞，炎癥開始后，大量的炎癥介質(zhì)被合成并釋放到組織和血液中，引起細(xì)胞炎癥損傷和功能絮亂［13］。LPS 是革蘭陰性菌細(xì)胞壁主要成分，可被巨噬細(xì)胞膜表面受體識別誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)［14］。LPS 誘 導(dǎo) 的RAW264.7 細(xì) 胞 是 體 外 研 究 炎癥損傷經(jīng)典細(xì)胞模型，Cheng 等［15］研究發(fā)現(xiàn)，柑橘提取物對LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞具有抗炎作用。Han 等［3］研究發(fā)現(xiàn)，西咪替丁可抑制LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞RAW264.7 炎癥反應(yīng)，降低MAPKs 和NF?κB 信號通路相關(guān)的因子的表達(dá)。Zhu 等［4］研究發(fā)現(xiàn)，大黃素可通過siRNA PPARγ 轉(zhuǎn)染以降低細(xì)胞中PPARγ 的表達(dá)，從而降低細(xì)胞內(nèi)NF?κB 蛋白表達(dá)，降低LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞RAW264.7 炎癥損傷。目前，對于丹皮酚干預(yù)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥損傷國內(nèi)外鮮有報道，因此，本研究選用RAW264.7 細(xì)胞并使用LPS 刺激建立炎癥模型，觀察丹皮酚、TAK242 干預(yù)后細(xì)胞形態(tài)、線粒體膜電變化、GSH 水平、MDA 水平、TLR4/MAPK/NF?κB 通路蛋白表達(dá)，同時采用TLR4 抑制劑TAK242 來驗(yàn)證LPS 刺激效果，并探究丹皮酚抑制炎癥的分子作用機(jī)制。

GSH 是細(xì)胞中的Ⅱ項(xiàng)解毒酶，可清除超氧根離子、自由基及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其水平降低提示細(xì)胞清除自由基能力下降，機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷；MDA 是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，它水平變化反應(yīng)了機(jī)體氧化應(yīng)激受損程度；LPS 可誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥損傷和氧化應(yīng)激損傷，導(dǎo)致線粒體損傷，而線粒體在細(xì)胞代謝、自由基的生成、信號傳導(dǎo)及控制細(xì)胞膜電位中發(fā)揮重要作用，線粒體膜電位水平，提示線粒體受損程度［16，17］。本研究結(jié)果表明，丹皮酚可增加細(xì)胞培養(yǎng)液中GSH 水平、降低MDA 水平，細(xì)胞中線粒體膜電位熒光增強(qiáng)，減輕細(xì)胞損傷。多項(xiàng)研究表明，LPS 可被巨噬細(xì)胞膜表面受體CD14 分子識別并結(jié)合，隨之激活TLR4，通過TLR4 介導(dǎo)的重要的髓樣分化因子88（MyD88）依賴性途徑轉(zhuǎn)入核內(nèi)激活NF?κB［18］。NF?κB 在 細(xì) 胞 內(nèi) 與 其 抑 制 性 蛋 白（IκB）相結(jié)合不具有轉(zhuǎn)錄活性，當(dāng)受到上級刺激因子時，IκB 激酶（IKK）激活I(lǐng)κB，NF?κB 與IκB 發(fā)生脫離轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，與在DNA 上的κB 反應(yīng)元件相結(jié)合，調(diào)節(jié)其下游靶基因，轉(zhuǎn)錄表達(dá)炎癥因子，導(dǎo)致肝臟炎癥損傷［19］。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）是NF?κB 的上游調(diào)控因子，p38MAPK、JNK 是MAPK信號通路的重要組成部分，其在氧化應(yīng)激、炎癥介質(zhì)等刺激下通過磷酸化而激活，激活后可增加炎癥因子的釋放，進(jìn)一步加重細(xì)胞炎癥損傷、氧化應(yīng)激［20］。 免 疫 熒 光 結(jié) 果 顯 示，丹 皮 酚 可 以 抑 制RAW264.7 細(xì)胞激活、p?NF?κB 蛋白表達(dá)分布降低；Western blotting結(jié)果顯示，丹皮酚可以抑制TLR4、p?p38、p?JNK、p?IκB、p?NF?κB 蛋 白 表 達(dá)，降 低RAW264.7 細(xì)胞炎癥損傷和氧化應(yīng)激損傷。

綜上所述，丹皮酚干預(yù)可改善LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞RAW264.7 炎癥和氧化應(yīng)激損傷，其機(jī)制與TLR4/MAPK/NF?κB 通路蛋白表達(dá)下調(diào)相關(guān)。本研究有助于更好的理解丹皮酚保護(hù)炎癥與氧化應(yīng)激損傷，為丹皮酚進(jìn)一步開發(fā)、應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

作者貢獻(xiàn)度說明：

劉玉龍、顏貴明：全程參與、指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)操作并撰寫論文；孫敏，劉玉龍，劉科：參與數(shù)據(jù)分析、熒光拍照、Western blot?ting 實(shí)驗(yàn)等；顏貴明：所有實(shí)驗(yàn)試劑資金支持。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。