紀慧杰，朱彩平

(陜西師范大學 食品工程與營養(yǎng)科學學院，陜西 西安，710119)

石榴，為石榴科石榴屬的漿果，在我國具有悠久的栽培歷史[1]。我國現(xiàn)有石榴種質(zhì)資源230余個[2]，目前主要是鮮食或榨汁，每年都會產(chǎn)生大量的石榴皮, 這些石榴皮只有很小一部分被作為藥用，其余大多被丟棄，造成了石榴皮的嚴重浪費。石榴皮多糖(polysaccharides from pomegranate peel, PPP)是石榴皮中的一種活性成分，目前PPP的提取方法主要有水提醇沉法[3]、微波輔助提取法[4]、超聲波輔助提取法[5]和酶輔助提取法[6]，對于內(nèi)部沸騰法提取PPP的研究還未見報道。內(nèi)部沸騰法是指先用少量低沸點有機溶劑充分浸潤原料，然后再加入高溫度的提取劑使低沸點的有機溶劑發(fā)生內(nèi)部沸騰引起對流擴散，從而使有效成分快速溶出進入溶液中的一種提取方法[7]。該方法具有操作簡單、省時高效、產(chǎn)物雜質(zhì)少等優(yōu)點[8]。

隨著生活水平的提高，高血脂癥發(fā)病率越來越高。高血脂癥的臨床表現(xiàn)是高水平的總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白和低水平的高密度脂蛋白膽固醇，其易誘導發(fā)生脂肪肝、動脈粥樣硬化和心血管等疾病[9-10]。因此，迫切需要一些有效、安全的口服藥物來控制和治療高血脂癥及其并發(fā)癥。然而，一些研究表明控制和治療高脂血癥的傳統(tǒng)藥物價格昂貴且有副作用[11]。因此，開發(fā)天然低價的降脂藥物已成為醫(yī)學領(lǐng)域的熱門話題。目前，已有研究表明多糖具有一定的降血脂能力[12]，但對于PPP的生理活性研究多集中在抗氧化[13]、免疫[14]、保肝[15]等方面，尚未見關(guān)于PPP降血脂活性的報道。

因此，本文以石榴皮為原料，對內(nèi)部沸騰法提取PPP的工藝進行優(yōu)化，得到最佳工藝參數(shù)，同時，研究PPP對膽固醇酯酶和胰脂肪酶的抑制能力、結(jié)合膽酸鹽的能力，探究PPP的體外降脂活性，為開發(fā)天然無毒副作用的降脂功能食品提供理論依據(jù)，為石榴皮資源的綜合利用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

粉紅石榴(陜西咸陽)購于陜西西安回民街，石榴皮干燥粉碎后過60目篩，于密封袋中密封保存，備用。

無水乙醇、氯仿、月桂酸-4-硝基苯酯均為分析純，天津市富宇精細化工有限公司;單糖標品，上海源葉生物科技有限公司；甘氨膽酸鈉、?；悄懰徕c均為分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司;胰蛋白酶、胃蛋白酶均為分析純，北京奧博星生物科技有限公司；胰脂肪酶、乙酸鈉、膽固醇酯酶、4-硝基苯丁酸酯均為分析純，西安市晶博生物科技有限公司；乙腈、磷酸二氫鉀、三乙胺、三氟乙酸均為色譜級，美國賽默飛世爾公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LGJ-10型真空冷凍干燥機，鞏義市予華儀器有限公司；RE301旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，雅馬拓科技貿(mào)易(上海)有限公司；HH-S4電熱恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司；SC-3 610低速離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司；THZ-4恒溫振蕩器，蘇州培英設(shè)備有限公司；PHS-3C型精密pH計，上海雷磁儀器廠；Multisacn Go酶標儀、高效液相色譜儀，美國賽默飛世爾公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 石榴皮粗多糖的提取工藝

石榴皮粗多糖提取工藝如下：

石榴皮干粉→乙醇解吸→熱水浸提→抽濾→二次提取→合并提取液→旋蒸濃縮→冷凍干燥

1.3.2 石榴皮粗多糖得率計算

石榴皮粗多糖得率的計算如公式(1)所示：

(1)

式中：R，石榴皮粗多糖得率；m1，石榴皮粗多糖的質(zhì)量，g；m2，石榴皮粉末的質(zhì)量，g。

1.3.3 單因素試驗

選擇乙醇體積分數(shù)(50%、60%、70%、80%、90%、100%)、液料比(20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1， mL∶g)、提取溫度(75、80、85、90、95、100 ℃)、提取時間(20、30、40、50、60、70 min)進行單因素試驗，并進行3次重復試驗。

1.3.4 響應(yīng)面設(shè)計試驗

由單因素試驗的結(jié)果，進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

1.3.5 單糖組成的HPLC分析

PPP用3 mol/L的三氟乙酸溶液水解。將含有100 μL已水解多糖樣品和單糖混標、200 μL 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one，PMP)(0.5 mol/L)、300 μL NaOH溶液(0.3 mol/L)的混合液置于70 ℃恒溫水浴中反應(yīng)1 h，反應(yīng)結(jié)束后加入300 μL HCl溶液(0.3 mol/L)終止反應(yīng)，氯仿萃取后，過膜備用。HPLC的色譜條件為：Thermo U-3000 HPLC系統(tǒng)，C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，Venusil，美國)在35 ℃下進行高效液相色譜試驗分析樣品單糖組成。流動相A為乙腈(色譜級)，流動相B為3.3 mmol/L KH2PO4+3.9 mmol/L三乙胺+10%乙腈水溶液，流速為1.0 mL/min，進樣量為10 μL。洗脫梯度為：在0、5、15、25、30、40 min時流動相B的比例分別為98%、98%、91%、88%、86%、99%[16]。

1.3.6 PPP對膽固醇酯酶的影響

1.3.6.1 PPP對膽固醇酯酶抑制率的測定

根據(jù)文獻方法[17]稍作修改。將4-硝基苯基丁酸酯(4-nitrophenyl butyrate，PNPB)預先溶解在乙腈中，配制成4 mmol/L的溶液，-20 ℃保存?zhèn)溆?，所有反?yīng)均在含有牛磺膽酸鈉(5.16 mmol/L)、NaCl(0.1 mol/L)的磷酸緩沖溶液(0.1 mol/L，pH=7.0)中進行。試管中加入1 mL緩沖液、50 μL膽固醇酯酶(500 U、20 μg/mL)、50 μL PPP溶液(5、10、15、20、25、30 mg/mL)和20 μL PNPB，在25 ℃下反應(yīng)30 min，于405 nm處測定吸光值。對照組用超純水代替PPP，PPP對膽固醇酯酶的抑制率計算如公式(2)所示：

(2)

式中：A，PPP存在時酶活性;A0，PPP不存在時酶活性。

1.3.6.2 PPP對膽固醇酯酶抑制類型的測定

固定PNPB底物濃度為4 mmol/L，PPP濃度IC50值(25.00 mg/mL)不變，加入不同質(zhì)量濃度膽固醇酯酶溶液(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL)，按1.3.6.1中的體系進行反應(yīng)，25 ℃反應(yīng)10 min，于405 nm處測定吸光值，作抑制類型圖，判斷反應(yīng)的可逆型。固定膽固醇酯酶質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL，PPP濃度為IC50值不變，改變底物PNPB濃度(0.5、1、2、3、4 mmol/L)，按1.3.6.1中的體系進行反應(yīng)，25 ℃反應(yīng)10 min，反應(yīng)結(jié)束后于405 nm處測定吸光值，作Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線圖，確定抑制類型。

1.3.7 PPP結(jié)合膽酸鹽試驗

取1 mL各質(zhì)量濃度PPP(5、10、15、20、25 mg/mL)于50 mL離心管中，加入1 mL 0.01 mol/L的HCl溶液、3 mL 10 mg/mL的胃蛋白酶溶液，37 ℃下恒溫振蕩1 h，模擬胃消化；然后加入4 mL胰脂肪酶溶液，調(diào)節(jié)pH至6.3，37 ℃恒溫振蕩1 h，模擬腸道消化。然后分別向其中加入4 mL的膽酸鹽溶液，于37 ℃恒溫振蕩20 min，結(jié)束后4 000 r/min 離心20 min，取2.5 mL上清液于試管中，加入7.5 mL體積分數(shù)為60% H2SO4溶液，70 ℃水浴加熱20 min，冷卻至室溫后于387 nm處測吸光值，PPP與各膽酸鹽的結(jié)合率計算如公式(3)所示[18]：

(3)

1.3.8 PPP對胰脂肪酶的抑制試驗

1.3.8.1 PPP對胰脂肪酶抑制率的測定

根據(jù)文獻方法[19]稍作修改。0.8 mg/mL的月桂酸-4-硝基苯酯溶液由5 mmol/L的乙酸鈉溶液(含1%Trition X-100)配制，在96孔板中加入60 μL的胰脂肪酶、60 μL PBS緩沖液、20 μL的各梯度濃度的PPP溶液和80 μL的月桂酸-4-硝基苯酯，37 ℃反應(yīng)30 min，于405 nm測定吸光值。對照組用PBS緩沖液代替胰脂肪酶，按照公式(2)計算PPP對胰脂肪酶的抑制率。

1.3.8.2 PPP對胰脂肪酶抑制類型的測定

固定月桂酸-4-硝基苯酯底物質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL，PPP濃度為IC50值(9.46 mg/mL)不變，加入不同濃度胰脂肪酶溶液(2、4、6、8、10 mg/mL)，按1.3.8.1中的體系進行反應(yīng)，37 ℃反應(yīng)10 min，反應(yīng)結(jié)束后于405 nm處測定吸光值，作抑制類型圖，判斷反應(yīng)的可逆型。固定胰脂肪酶濃度為10 mg/mL，PPP濃度為IC50值不變，改變底物月桂酸-4-硝基苯酯濃度(0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L)，按1.3.8.1中的體系進行反應(yīng)，37 ℃反應(yīng)10 min，反應(yīng)結(jié)束后于405 nm處測定吸光值，作Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線圖，確定抑制類型。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

圖1呈現(xiàn)了乙醇體積分數(shù)、料液比、提取溫度和提取時間的單因素試驗結(jié)果。分析PPP的提取率隨各單因素不同水平的變化規(guī)律并綜合考慮，選擇乙醇解吸濃度為90%、液料比(mL∶g)為40∶1、提取溫度為95 ℃、提取時間為60 min作為最佳條件，并在乙醇體積分數(shù)80%～100%、液料比(mL∶g)35∶1～45∶1、提取溫度90～100 ℃、提取時間50～70 min的條件下進行響應(yīng)面試驗。

a-乙醇體積分數(shù)；b-液料比；c-溫度；d-時間

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

表1為本試驗響應(yīng)面設(shè)計的因素水平。

表1 響應(yīng)面設(shè)計試驗因子與水平

根據(jù)表1響應(yīng)面試驗因子水平表，對乙醇體積分數(shù)、液料比、提取溫度、提取時間4個因素的交互作用對PPP得率的影響進行了試驗，試驗結(jié)果如表2所示。

通過Expert Design軟件對表2中的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到如下回歸方程：Y=16.07-0.068X1+0.61X2+1.37X3+0.27X4+0.31X1X2-0.021X1X3+0.092X1X4-0.016X2X3+0.069X2X4+8.750×10-3X3X4-0.25X12-0.81X22-0.98X32-0.82X42。

表2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

對回歸模型進行方差分析，如表3所示。

表3 響應(yīng)面試驗的方差分析

由圖2可知，乙醇體積分數(shù)和提取溫度、液料比和提取溫度、液料比和提取時間、提取溫度和提取時間的交互作用的響應(yīng)面3D圖曲面變化較陡峭，表明它們的交互作用對PPP的得率有一定的影響，但結(jié)合方差分析結(jié)果來看，其作用不顯著。

圖2 各因素的交互作用對PPP得率影響的響應(yīng)面圖

通過Design-Expert 軟件分析，得到了內(nèi)部沸騰法提取PPP的最佳條件為：乙醇溶液體積分數(shù)為91.2%，提取溫度為98.5 ℃，提取時間為61.9 min，液料比為41.95∶1(mL∶g)，在此條件下，PPP得率的理論值為16.689 9%。根據(jù)實際情況，將提取條件調(diào)整為：乙醇溶液體積分數(shù)91%，提取溫度96 ℃，提取時間62 min，液料比42∶1(mL∶g)，實際得率為(16.32±0.21)% (n=3)，接近預測值，說明該模型可以較好的預測PPP的實際得率。

2.3 單糖組成分析

由圖3所示，根據(jù)各單糖標準品的保留時間可以確定PPP的單糖種類，根據(jù)峰面積確定每種單糖在相應(yīng)多糖中所占的百分比。經(jīng)計算，PPP由9種單糖組成，分別是5.57%的甘露糖、2.41%的鼠李糖、4.21%的葡萄糖醛酸、26.10%的半乳糖醛酸、1.74%的葡萄糖、2.20%的木糖、4.40%的半乳糖、16.86%的阿拉伯糖和36.51%的巖藻糖。

1-甘露糖；2-核糖；3-鼠李糖；4-葡萄糖醛酸；5-半乳糖醛酸；6-葡萄糖；7-木糖；8-半乳糖；9-阿拉伯糖；10-巖藻糖

2.4 PPP對膽固醇酯酶抑制作用

2.4.1 PPP對膽固醇酯酶抑制率的測定

膽固醇酯酶可以將膽固醇酯水解成游離膽固醇和脂肪酸[20]，通過抑制膽固醇酯酶活性，可以減少機體對膽固醇的吸收，達到降脂目的。由圖4可知，PPP對膽固醇酯酶的抑制率隨著PPP濃度的增加而增加，表明PPP對膽固醇酯酶有較好的抑制效果。通過SPSS軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析，得出PPP對膽固醇酯酶的半抑制濃度IC50=25.00 mg/mL。

圖4 PPP對膽固醇酯酶的抑制率

2.4.2 PPP對膽固醇酯酶作用的抑制類型

酶的抑制作用分為可逆性抑制和不可逆抑制，可逆性抑制又分為競爭性抑制、非競爭性抑制和反競爭性抑制，通過Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線可以直觀地判斷可逆抑制類型。當含有抑制劑的曲線和不含抑制劑的曲線相交于縱軸，則為競爭性抑制；當2條曲線相交于橫軸，為非競爭性抑制；當2條直線平行時，則為反競爭性抑制[21]。由圖5-a可知，2條直線相交于原點，且加入PPP后直線斜率變小，表明PPP對膽固醇酯酶的抑制類型為可逆性抑制，PPP與膽固醇酯酶以非共價鍵結(jié)合導致酶活力降低。由圖5-b可知，對照組和PPP組2條直線相交于橫軸，且加入PPP后vmax(最大反應(yīng)速率)減小，Km基本不變，說明石榴多糖對膽固醇酯酶的抑制類型為非競爭性抑制，PPP和底物可以同時結(jié)合在膽固醇酯酶上，形成酶-底物-抑制劑三元復合物，使膽固醇酯酶活性降低。

a-抑制類型；b-可逆性抑制Lineweaver-Burk曲線

2.5 PPP結(jié)合膽酸鹽試驗結(jié)果

機體內(nèi)的膽固醇主要是以膽汁酸的形式排出體外，而膽汁酸一般都以鹽及結(jié)合型的形式存在，PPP通過其形成的黏性網(wǎng)絡(luò)吸附膽酸鹽，加快了膽汁酸的排泄，促進了膽固醇向膽汁酸轉(zhuǎn)化的過程，減少了機體內(nèi)的膽固醇含量，從而達到降脂的效果[22]。如圖6所示，隨著PPP濃度的增加，PPP對膽酸鹽的結(jié)合率呈現(xiàn)先增加后穩(wěn)定的趨勢，在PPP質(zhì)量濃度為0～15 mg/mL時，結(jié)合率迅速增加，在多糖質(zhì)量濃度為15 mg/mL時，兩種膽酸鹽的結(jié)合率均達到最大，甘氨膽酸鈉和?；悄懰徕c的最大結(jié)合率可分別達到40.09%和34.90%。

圖6 PPP添加量對膽酸鹽結(jié)合率的影響含量

2.6 PPP對胰脂肪酶的抑制作用

2.6.1 PPP對胰脂肪酶的抑制率

胰脂肪酶可以將脂肪水解成游離脂肪酸和單酰甘油酯[23]，通過抑制胰脂肪酶活性，可以減少機體對脂肪的吸收，達到降脂目的。由圖7可知，PPP對胰脂肪酶的抑制率隨著PPP濃度的增加而增加，最后趨于穩(wěn)定，表明PPP對胰脂肪酶有較好的抑制效果。通過SPSS軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析，得出PPP對胰脂肪酶的半抑制濃度IC50=9.46 mg/mL。

圖7 PPP對胰脂肪酶的抑制率

2.6.2 PPP對胰脂肪酶作用的抑制類型

由圖8-a可知，2條直線相交于原點，且加入PPP后直線斜率變小，表明PPP對胰脂肪酶的抑制類型為可逆性抑制，PPP與胰脂肪酶以非共價鍵結(jié)合導致酶活力降低。由圖8-b可知，2條直線相交于縱軸，加入PPP后vmax基本不變，Km增大，說明石榴多糖對胰脂肪酶的抑制類型為競爭性抑制，PPP與胰脂肪酶的活性中心進行可逆性結(jié)合，與底物競爭同一部位，妨礙底物和酶的結(jié)合，減少胰脂肪酶的作用機會，從而降低了酶的活性。

a-抑制類型；b-可逆性抑制Lineweaver-Burk曲線

3 結(jié)論

本文以石榴皮為原料，通過內(nèi)部沸騰法提取PPP，得到PPP的最佳提取條件為：乙醇溶液體積分數(shù)91%，液料比(mL∶g)為42∶1，提取時間62 min，提取溫度96 ℃，在最佳條件下，PPP的平均得率為(16.32±0.21)%(n=3)，此方法操作簡單且PPP的得率高。高效液相色譜結(jié)果表明，PPP主要由巖藻糖(36.51%)、半乳糖醛酸(26.10%)、阿拉伯糖(16.86%)組成，除此之外還含有少量的甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、木糖和半乳糖。體外降脂試驗結(jié)果顯示，PPP對膽固醇酯酶和胰脂肪酶均具有較好的抑制作用，對膽酸鹽也具有一定的結(jié)合能力，表明PPP具有一定的體外降脂活性，后期還需要對PPP的體內(nèi)降脂活性進行進一步的研究，開發(fā)天然低價的降脂藥物，從而有利于石榴皮資源的綜合開發(fā)利用。