周冰凌 邵 衛(wèi) 邱 昕 吳家順 徐 雷 李俐娟

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種誘因不明的神經(jīng)退行性疾病，其病理學(xué)特點為β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)沉積造成的神經(jīng)炎斑、神經(jīng)元纖維纏結(jié)、神經(jīng)元死亡，其主要臨床表現(xiàn)為記憶能力、認(rèn)知判斷能力、語言理解能力等功能的進行性衰退[1]。我國流行病學(xué)資料顯示，AD患病率日益增高，成為近年來威脅老年人群健康及生活質(zhì)量的重要疾病之一[2]。目前，有效預(yù)防和治療AD的手段較為有限。有研究[3-4]顯示，促炎因子水平與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞損傷程度呈正相關(guān)，且系統(tǒng)性炎癥能夠催生神經(jīng)毒素，進而促進AD的發(fā)生。因此，抗炎藥物對于延緩AD的發(fā)生、發(fā)展有一定的作用。微核糖核酸-125a(mircoRNA-125a，簡稱miR-125a)表達與腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)水平呈正相關(guān)，可調(diào)控神經(jīng)元的增殖和凋亡，并參與帕金森病、自身免疫性腦脊髓炎等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生[5-7]。此外，miR-125a通過磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)相關(guān)信號通路調(diào)控炎癥反應(yīng)[8-9]?；谏鲜鲎C據(jù)，本研究團隊假設(shè)miR-125a在AD的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，然而目前鮮見相關(guān)報道。本研究擬采用Aβ1-42毒化神經(jīng)生長因子(nerve growth factor, NGF)誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞株建立PC12 AD模型細(xì)胞，旨在探究miR-125a對PC12 AD模型細(xì)胞的凋亡、總神經(jīng)突生長長度和炎癥因子水平的影響。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) PC12細(xì)胞株購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2且飽和濕度條件下，以含5%胎牛血清(美國賽默飛世爾科技有限公司)和10%滅活馬血清(美國賽默飛世爾科技有限公司)的RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Sigma-Aldrich公司)培養(yǎng) PC12細(xì)胞株。

1.2 PC12 AD模型細(xì)胞構(gòu)建 參考文獻[10]的方法，建立PC12 AD模型細(xì)胞。首先，將PC12細(xì)胞株接種于24孔板，密度為1×105/mL。加入含20 ng/mL NGF(美國Sigma-Aldrich公司)、10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2條件下誘導(dǎo)細(xì)胞分化72 h。隨后，將已在37 ℃預(yù)先孵育(目的為促進多肽聚合)7 d的Aβ1-42(美國Sigma-Aldrich公司)溶解于二甲基亞砜(DMSO)中配制成1 mmol/L的溶液，儲存于-20 ℃待用。取1 μmol/L低聚Aβ1-42加入NGF誘導(dǎo)分化后的PC12細(xì)胞株中培養(yǎng)24 h以構(gòu)建PC12 AD模型細(xì)胞，作為Aβ1-42組；將NGF誘導(dǎo)分化后未經(jīng)Aβ1-42處理的PC12細(xì)胞株，作為對照組。

向上述兩組各孔中加入CCK-8[東仁化學(xué)科技(上海)有限公司]試劑10 μL, 37 ℃孵育2 h，應(yīng)用酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek公司)檢測波長為450 nm處的吸光度計算細(xì)胞活性，以百分?jǐn)?shù)表示。采用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)檢測對照組和Aβ1-42組中的miR-125a相對表達量。

1.3 轉(zhuǎn)染 miR-125a 模擬物(mimic)、對照mimic、miR-125a抑制劑(inhibitor)和對照inhibitor均由廣州市銳博生物科技有限公司合成。將PC12 AD模型細(xì)胞接種于24孔板中，密度為1×105/mL，使用Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司)將miR-125a mimic、對照mimic、miR-125a inhibitor及對照inhibitor分別轉(zhuǎn)染至PC12 AD模型細(xì)胞中，并在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2條件下孵育24 h后，采用RT-qPCR檢測各組細(xì)胞中miR-125a相對表達量。孵育48 h后，在顯微鏡下觀察、計算總神經(jīng)突生長長度；使用Hoechst/碘化丙啶(propidium iodide，PI；美國Sigma-Aldrich公司)試劑檢測細(xì)胞凋亡情況；同時，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照ELISA試劑盒(美國R&D Systems公司)操作說明書測定炎癥因子(TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17)水平。

1.4 RT-qPCR 使用TRIzolTMReagent(美國賽默飛世爾科技有限公司)提取總RNA，并使用iScriptTMcDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Bio-Rad公司)將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，使用QuantiNova SYBR Green PCR試劑盒(德國凱杰公司)進行RT-qPCR。以U6作為內(nèi)參，采用2-△△Ct方法計算miR-125a相對表達量；以β-actin作為內(nèi)參，采用2-△△Ct方法計算BDNF相對表達量。引物序列：miR-125a正向序列為5’-ACA CTC CAG CTG GGT CCC TGA GAC CCT TTA AC-3’；反向序列為5’-TGT CGT GGA GTC GGC AAT TC-3’。U6正向引物為5’-CGC TTC GGC AGC ACA TAT ACT A-3’；反向序列為5’-ATG GAA CGC TTC ACG AAT TTG C-3’。BDNF正向序列為5’-GAC GGT CAC AGT CCT GGA GAA-3’；反向序列為5’-GCA GCC TTC CTT CGT GTA ACC-3’。β-actin正向序列為5’-CTA TCG GCA ATG AGC GGT TCC-3’；反向序列為5’-GCA CTG TGT TGG CAT AGA GGT C-3’。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測 轉(zhuǎn)染48 h后，向PC12 AD模型細(xì)胞中加入8 mol/L Hoechst 33342 和1.5 mol/LPI在37 ℃下孵育0.5 h后，應(yīng)用倒置熒光顯微鏡(德國Leica公司)攝取細(xì)胞圖片。在200倍視野下，應(yīng)用Image Pro Plus軟件(美國Media Cybernetics公司)統(tǒng)計Hoechst 33342陽性和PI陽性細(xì)胞數(shù)量，計算細(xì)胞凋亡率。

1.6 神經(jīng)突生長測量 轉(zhuǎn)染48 h后，于顯微鏡(德國Leica公司)下觀察細(xì)胞形態(tài)，并應(yīng)用Imaging Software Presage軟件(美國Advanced Imaging Concepts公司)測量神經(jīng)突生長長度，以所有細(xì)胞神經(jīng)突生長長度之和除以細(xì)胞總數(shù)，計算每個細(xì)胞總神經(jīng)突生長長度。

1.7 乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)細(xì)胞毒性檢測 轉(zhuǎn)染48 h后，收集2組100 μL細(xì)胞培養(yǎng)基置于96孔板內(nèi)，并加入100 μL 預(yù)配置的LDH工作液[東仁化學(xué)科技(上海)有限公司]。37 ℃避光孵育30 min后，加入50 μL反應(yīng)終止液，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測波長為490 nm處的樣本吸光度。在空白組中加入20 μL Lysis緩沖液后[東仁化學(xué)科技(上海)有限公司] ，于37 ℃孵育30 min，收集100 μL上清液用于LDH毒性檢測。細(xì)胞毒性= [(Aβ1-42組吸光度-空白組吸光度)÷(對照組吸光度-空白組吸光度)]×100%。

1.8 免疫印跡實驗 轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞株并應(yīng)用RIPA lysis緩沖液(美國Sigma-Aldrich公司)在冰上對細(xì)胞進行裂解。收集上清液，使用BCA 蛋白定量試劑盒 (上海碧云天生物技術(shù)有限公司)對細(xì)胞蛋白質(zhì)進行定量。取10 μg總蛋白質(zhì)，經(jīng)熱變性后，以4%～20%預(yù)制膠(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)對蛋白質(zhì)進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)，后將目的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(美國Sigma-Aldrich公司)。在37 ℃下，硝酸纖維素膜經(jīng)5%小牛血清(BSA，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)封閉90 min后，在4 ℃，與一抗抗體共孵育過夜。收集一抗抗體后，滴加稀釋后的二抗抗體至硝酸纖維素膜，于37 ℃孵育1 h。洗去二抗抗體后，滴加增強化學(xué)發(fā)光法的發(fā)光試劑(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)至硝酸纖維膜對目的蛋白質(zhì)進行顯影。應(yīng)用Image J 1.8軟件對蛋白質(zhì)條帶進行定量。該實驗中所用抗體為BDNF一抗抗體(1∶1 000, 江蘇親科生物研究中心有限公司)、β-actin一抗抗體(1∶10 000，江蘇親科生物研究中心有限公司)、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔抗體(1∶10 000，江蘇親科生物研究中心有限公司)。

2 結(jié) 果

2.1 兩組細(xì)胞活性和miR-125相對表達量的比較 Aβ1-42組細(xì)胞活性為(35.60±4.38)%，較對照組的(100.30±4.51)%顯著降低(P<0.001)，表明成功構(gòu)建PC12 AD模型細(xì)胞。Aβ1-42組miR-125a相對表達量為0.86±0.04，顯著少于對照組的0.99±0.03(P<0.05)。

2.2 兩組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后miR-125a相對表達量的比較 miR-125a mimic組miR-125a相對表達量為3.95±0.24，較對照mimic組的1.00±0.13顯著增加(P<0.001)。miR-125a inhibitor組miR-125a相對表達量為0.31±0.08，較對照inhibitor組的0.99±0.10顯著減少(P<0.001)，表明轉(zhuǎn)染成功。

2.3 miR-125a對PC12 AD模型細(xì)胞凋亡的影響 miR-125a mimic組細(xì)胞凋亡率為(7.55±1.56)%，顯著低于對照mimic組的(13.00±1.11)%(P<0.05)；miR-125a inhibitor組細(xì)胞凋亡率為(19.34±2.41)%，顯著高于對照inhibitor組的(13.11±2.04)%(P<0.01)。miR-125a mimic組LDH毒性細(xì)胞比例為(6.14±1.20)%，顯著低于對照mimic組的(15.43±2.55)%(P<0.05)；miR-125a inhibitor組LDH毒性細(xì)胞比例為(23.07±3.86)%，顯著高于對照inhibitor組的(14.79±2.26)%(P<0.05)。

2.4 miR-125a對PC12 AD模型細(xì)胞總神經(jīng)突生長長度的影響 miR-125a mimic組總神經(jīng)突生長長度為(34.54±2.95) μm，較對照mimic組的(23.93±2.64) μm顯著增長(P<0.01)。miR-125a inhibitor組總神經(jīng)突生長長度為(18.47±2.27) μm， 較對照inhibitor組的(24.62±1.52) μm顯著縮短(P<0.05)。見圖1。

A miR-125a mimic組 B 對照mimic組 C miR-125a inhibitor組 D 對照inhibitor組圖1 熒光顯微鏡下觀察miR-125a對PC12 AD模型細(xì)胞總神經(jīng)突生長長度的影響(×40)

2.5 miR-125a對PC12 AD模型細(xì)胞炎癥因子水平的影響 miR-125a mimic組中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17水平分別為(22.72±4.06)、(18.32±3.50)、(12.52±1.47)和(21.12±1.81) pg/mL，相較對照mimic組的(42.48±2.59)、(38.01±3.29)、(24.81±3.82)和(44.38±4.15) pg/mL均顯著降低(P<0.01或0.001)。miR-125a inhibitor組中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17水平分別為(66.81±5.52)、(59.78±7.15)、(50.53±2.75)和(63.10±4.95) pg/mL，相較對照inhibitor組的(40.28±4.36)、(37.24±5.92)、(24.54±5.13)和(43.06±3.75) pg/mL均顯著增高(P<0.05或0.01)。

2.6 miR-125a對PC12 AD模型細(xì)胞BDNF水平的影響 miR-125a mimic組BDNF mRNA和蛋白質(zhì)相對表達量分別為1.69±0.25、1.73±0.30， 均較對照mimic組的1.00±0.18、0.94±0.11顯著增加(P值均<0.01)。miR-125a inhibitor組BDNF mRNA和蛋白質(zhì)相對表達量分別為0.43±0.14、0.25±0.14，均較對照inhibitor組的1.08±0.13、0.96±0.13顯著減少(P值均<0.01)。見圖2。

1 對照mimic組 2 miR-125a mimic組 3 對照inhibitor組 4 miR-125a inhibitor組圖2 miR-125a對PC12 AD模型細(xì)胞BDNF蛋白質(zhì)表達的影響

3 討 論

本研究通過使用低聚Aβ1-42加入NGF誘導(dǎo)分化后的PC12細(xì)胞株構(gòu)建PC12 AD模型細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在PC12 AD模型細(xì)胞中：①miR-125a表達水平較對照組更低；②miR-125a抑制細(xì)胞凋亡，并促進細(xì)胞總神經(jīng)突長度的增長；③miR-125a降低細(xì)胞炎癥因子水平。

AD是老年人群常見的疾病之一，據(jù)WHO不完全統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，全球65歲以上人群AD的患病率約4%～7%，且患病率隨著年齡增長而日益增高，85歲以上人群AD的患病率可高達30%[11]。AD典型的早期臨床特征包括學(xué)習(xí)、記憶能力損傷，隨之是注意力、行為能力、語言功能、空間視覺功能、感知力、社交能力的喪失[3]。此外，AD會造成患者逐漸失去日常生活自理能力，不僅給患者及其家庭帶來了沉重的精神壓力和經(jīng)濟負(fù)擔(dān)，對整個社會醫(yī)療資源都是巨大的挑戰(zhàn)[12]。目前，針對AD的具體發(fā)病機制存在多種假說，常見的包括膽堿能神經(jīng)元假說、Aβ毒性假說和Tau蛋白假說等。近年來，在早期研究的基礎(chǔ)上，炎癥假說越來越受到關(guān)注[3]。因此，亟須探究炎癥在AD發(fā)病機制或參與AD發(fā)生、發(fā)展過程中的生物標(biāo)志物。

研究[5-7, 13]結(jié)果表明，miR-125a可影響神經(jīng)元細(xì)胞的增殖與凋亡，并參與一些神經(jīng)退行性疾病的病理過程。例如，miR-125a表達與BDNF蛋白質(zhì)水平呈正相關(guān)，可通過調(diào)控BDNF蛋白質(zhì)的表達影響神經(jīng)元細(xì)胞的增殖與凋亡[5]。此外，miR-125a在自身免疫性腦脊髓炎的脊髓前角細(xì)胞中異常表達，通過調(diào)控維生素D受體活動，參與腦脊髓炎的發(fā)生[7]。近期的研究[6]顯示，帕金森病患者的腦脊液中miR-125a水平較健康人群顯著降低，miR-125a可作為早期診斷帕金森病的生物標(biāo)志物。此外，miR-125a在炎癥反應(yīng)中的作用也有所報道。炎性腸病的機制研究[14]發(fā)現(xiàn)，miR-125a通過靶向E-二十六轉(zhuǎn)錄因子1(E-twenty six transcription factor-1，ETS-1)蛋白，從而抑制IFN-γ、TNF-α和IL-17A等促炎因子的分泌，進而減少對腸黏膜的炎癥損傷。亦有研究[15]結(jié)果表明，miR-125a能夠減少巨噬細(xì)胞M1表型的表達，同時促進M2表型的表達，以調(diào)控巨噬細(xì)胞極化作用并激活巨噬細(xì)胞，參與膿毒癥、肺炎等相關(guān)疾病的病理過程，發(fā)揮抑制炎癥的作用。關(guān)于甲狀腺炎的研究[16]結(jié)果顯示，甲狀腺炎患者血清中miR-125a異常表達；進一步的機制研究結(jié)果表明，miR-125a通過調(diào)控PI3K/Akt/mTOR信號通路，抑制促炎因子的表達，并影響甲狀腺炎模型細(xì)胞的增殖與凋亡，參與細(xì)胞自噬?；趍iR-125a在神經(jīng)退行性疾病及炎癥中的重要調(diào)控作用，本研究假設(shè)miR-125a能夠影響AD細(xì)胞凋亡、總神經(jīng)突生長長度和炎癥因子水平，從而參與AD的病理過程。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在通過低聚Aβ1-42誘導(dǎo)神經(jīng)損傷的PC12 AD模型細(xì)胞中，miR-125a相對表達量較對照組更低?？赡苁怯捎诘途跘β1-42促進神經(jīng)炎癥，提高了總體炎癥水平，進而降低了miR-125a這一抑炎因素的水平，然而這一推論需要進一步的研究支持。

為了進一步探究miR-125a是否對PC12 AD模型細(xì)胞的細(xì)胞活性有調(diào)控作用，本課題組將miR-125a mimic、對照mimic、miR-125a inhibitor及對照inhibitor分別轉(zhuǎn)染至PC12 AD模型細(xì)胞，對各組細(xì)胞的總神經(jīng)突生長長度和凋亡進行了檢測。結(jié)果顯示，在PC12 AD模型細(xì)胞中，miR-125a促進總神經(jīng)突長度的增長，并抑制細(xì)胞凋亡?？赡艿脑虬ǎ孩僭赑C12 AD模型細(xì)胞中，miR-125a通過調(diào)控PI3K/Akt/mTOR信號通路，抑制炎癥的發(fā)生，進而延緩AD的進展，促進總神經(jīng)突的生長，抑制細(xì)胞凋亡。②在PC12 AD模型細(xì)胞中，miR-125a可能通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型極化，增強M2表型標(biāo)記物(包括CD163、CD209等)的基因表達，抑制促炎因子的形成，增加抗炎因子的分泌，從而形成一種抗炎的微環(huán)境，修復(fù)細(xì)胞損傷，繼而抑制細(xì)胞凋亡。同時，本課題組通過比較miR-125a mimic組與對照mimic組、miR-125a inhibitor組與對照inhibitor組的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17水平，發(fā)現(xiàn)在PC12 AD模型細(xì)胞中，miR-125a可調(diào)控降低炎癥因子水平。這一結(jié)果提示miR-125a可能通過降低炎癥因子水平延緩AD的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，miR-125a可能對Aβ1-42毒化的分化PC12細(xì)胞株具有保護作用，其有望為AD的預(yù)防和診斷提供新的思路，并為AD的治療提供新的靶點。