楊文軍，李尚書，楊建國，楊 萍*

（1.湘西州農(nóng)科院，湖南 吉首 416000；2.湘西州農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，湖南 吉首 416000）

在種植農(nóng)作物的準(zhǔn)備工作中，拌種、種子表面消毒等環(huán)節(jié)必不可少，可以有效滅殺種子攜帶的有害細(xì)菌、蟲卵、病毒等，大幅降低病蟲害傳播率[1]。水稻是主要的糧食作物之一，常見病蟲害有稻瘟病、白葉枯病、紋枯病、稻曲病、惡苗病、霜霉病、白背稻虱、稻縱卷葉螟等。忽視播種前的種子表面消毒工作會(huì)嚴(yán)重影響水稻生長。同時(shí)，水稻含有多種植物內(nèi)生菌。這類菌群會(huì)與宿主植物和諧共生，在固氮、抗病、促生等方面具有積極影響。

現(xiàn)階段存在多種水稻種子表面消毒技術(shù)，雖然部分技術(shù)對(duì)有害病原菌、蟲卵具有良好的滅殺作用，但會(huì)對(duì)植物內(nèi)生菌造成無差別攻擊，限制植物生長。本研究以水稻為主要分析對(duì)象，評(píng)估幾種常用水稻種子表面消毒技術(shù)應(yīng)用后產(chǎn)生的綜合效果，以確定最適合水稻種子表面消毒的技術(shù)、藥劑濃度、消毒時(shí)間。

1 材料與方法

1.1 材料分類

1.1.1 試驗(yàn)原材料選擇

湖南省吉首市是典型的中亞熱帶季風(fēng)濕潤性氣候，兼具大陸性氣候。全年四季分明，冬暖夏涼，春秋溫和，秋短冬長。該地區(qū)年降水日超過150 d，年降水量超過2 200 mm，年日照時(shí)長超過940 h，無霜期301 d。近年來，吉首市大力推廣水稻種植，粘兩優(yōu)4011 中秈遲熟兩系雜交水稻廣受好評(píng)。本研究初期準(zhǔn)備工作中，相關(guān)人員從吉首市有關(guān)農(nóng)業(yè)科研機(jī)構(gòu)獲取粘兩優(yōu)4011中秈遲熟兩系雜交水稻的試驗(yàn)樣本，取材時(shí)間為該品種水稻的成熟期——2021 年9 月。

1.1.2 藥品及試劑

1）牛肉膏。北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，產(chǎn)品批號(hào)20200826，生產(chǎn)日期2020 年8 月19 日，有效日期至2025 年7 月。該生物制劑的用途為制作培養(yǎng)基。

2）蛋白胨。濟(jì)南清玉元新材料有限公司代理銷售的大豆蛋白胨，執(zhí)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為行標(biāo)，產(chǎn)品等級(jí)為優(yōu)級(jí)品，用于制作培養(yǎng)基。

3）氯化鈉。選用市面上常見的食用鹽即可，用于制作培養(yǎng)基。

4）瓊脂。河南銘之鑫化工產(chǎn)品有限公司生產(chǎn)的瓊脂粉是從海藻中提取的多糖體，具有較強(qiáng)的凝固性、穩(wěn)定性，用于制作培養(yǎng)基。

5）蒸餾水（純化水）、無菌水。

6）氯化汞。上海市偉宏工貿(mào)有限公司銷售的濃度為0.1%氯化汞（升汞）。

7）硫酸銅。廊坊鵬彩精細(xì)化工有限公司生產(chǎn)的五水硫酸銅，性狀為藍(lán)色透明結(jié)晶，在干燥空氣中易風(fēng)化，相對(duì)密度為2.29，加熱至30 ℃時(shí)會(huì)轉(zhuǎn)化為三水鹽，加熱到190 ℃時(shí)會(huì)轉(zhuǎn)化為一水鹽，達(dá)到258 ℃高溫時(shí)會(huì)轉(zhuǎn)化成白色粉末狀無水鹽。本研究中需配制成0.1%硫酸銅溶液，是測定水稻種子表面消毒效果的試劑之一。

8）過氧化氫溶液。河北健寧藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的0.3%過氧化氫溶液，國藥準(zhǔn)字H13022648。在本研究中主要用于浸泡消毒水稻種子。

9）乙醇溶液。莞市喬科化學(xué)有限公司生產(chǎn)的無水乙醇，之后加入純化水，配制成70%乙醇溶液，用于水稻種子浸泡消毒。從藥房購買75%醫(yī)用酒精，用于對(duì)試驗(yàn)儀器、設(shè)備消毒。

10）高錳酸鉀溶液。鄭州萬友化工產(chǎn)品有限公司生產(chǎn)的高錳酸鉀粉末。在本研究中，需要將高錳酸鉀粉末與純化水按照1∶19 的比例配制成5%高錳酸鉀溶液，用于對(duì)水稻種子浸泡消毒。

11）次氯酸鈉溶液。鞏義市信合環(huán)?？萍加邢薰旧a(chǎn)的固體次氯酸鈉。在本研究中，需要將次氯酸鈉固體（結(jié)晶）與純化水按照1∶9 的比例配制成10%次氯酸鈉溶液，用于對(duì)水稻種子浸泡消毒。

12）氫氧化鈉溶液。中魯化工（濟(jì)南）有限責(zé)任公司銷售，濱化集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)的32%氫氧化鈉溶液，標(biāo)準(zhǔn)為GB 1886.20-2016。在本研究中主要用于調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的酸堿度。

1.1.3 試驗(yàn)所用器材

1）滅菌鍋。上海申安醫(yī)療器械廠生產(chǎn)，型號(hào)為LDZX-50FA，立式壓力蒸汽動(dòng)力[2]。容積為50 L，電源電壓為220 V，功率為3.5 kW，滅菌室設(shè)計(jì)體積φ350×520，總重量75 kg，總體積600 mm×580 mm×1 100 mm。工作溫度區(qū)間116～127 ℃，最大連續(xù)工作時(shí)間為70 min。

2）電子天平。上海精密儀器儀表公司生產(chǎn)的電子分析天平，型號(hào)為FA2104B，通過外校校準(zhǔn)，最大稱量計(jì)量210 g，讀數(shù)精度為0.1 mg。

3）電熱培養(yǎng)箱。上海博訊實(shí)驗(yàn)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn)的HPX-9082 MBE 數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱。容量規(guī)格為82 L，溫度均勻性為±0.5 ℃，控溫范圍為室溫+5～65 ℃，電源電壓為AC220 V±10%/50 Hz±2%，溫度分辨率為0.1 ℃，輸入功率為300 W，外形尺寸600 mm×480mm×740mm，內(nèi)膽尺寸450mm×400mm×450mm。

4）工作臺(tái)。南京艾賽特科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)的SW-CJ-2FD 雙人單面垂直凈化工作臺(tái)。送風(fēng)類型為垂直送風(fēng)，潔凈等級(jí)為100 級(jí)，外形尺寸為1 540 mm×680 mm×1 600 mm，工作區(qū)域尺寸為1 360 mm×650 mm×520 mm。該設(shè)備的優(yōu)勢在于空氣經(jīng)過側(cè)面的初效空氣過濾器、低噪聲離心式通風(fēng)機(jī)后，被壓入靜壓箱，之后經(jīng)過高效空氣過濾器，從工作臺(tái)的頂部被均勻吹出，形成高潔凈度的空氣幕，有效去除工作區(qū)域內(nèi)的原自然空氣，開機(jī)后5 min 即達(dá)到理想的高潔凈度空間。采用可調(diào)風(fēng)機(jī)雙速調(diào)節(jié)風(fēng)量大小，輕觸型開關(guān)調(diào)節(jié)電壓，保證工作區(qū)內(nèi)的風(fēng)速始終處于理想狀態(tài)。該設(shè)備的處理菌落數(shù)≤0.5 個(gè)/皿·時(shí)（φ90 mm 培養(yǎng)平皿）。

5）電子萬用爐。泰州市昊嘉電熱電器有限公司生產(chǎn)的cs-2 電子萬用爐，最大工作電壓220 V，功率2 kW，額定溫度600 ℃。

6）其他器材。500 mL 的燒杯若干、1 000 mL 燒杯若干、1 000 mL 帶塞錐形瓶若干、500 mL 量筒若干、1 000 mL 量筒若干、玻璃棒、表面皿、培養(yǎng)皿若干、酒精燈、鑷子、0.01 mL 帶槍頭的移液槍、涂布器棒若干。

1.2 試驗(yàn)方法及過程

1.2.1 培養(yǎng)基的制備及試驗(yàn)器具使用前的消毒處理

1）培養(yǎng)基的制備。本研究選用的培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基。牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、氯化鈉（食鹽）、水的用量分別是3.0 g、10.0 g、25 g、3.0 g、1 000 mL，培養(yǎng)基的pH 值預(yù)計(jì)為7.4～7.6。使用玻璃棒挑取牛肉膏之后放置在小燒杯中稱量。稱量過程中，完成一種物質(zhì)的稱量之后，如果不更換稱量工具，應(yīng)完成洗凈、擦干作業(yè)之后再對(duì)另一種物質(zhì)稱量。在培養(yǎng)基制備用燒杯中，可以加入少量純化水將稱量完畢后的物質(zhì)放入其中之后使用玻璃棒均勻攪拌，之后放置于電子萬用爐之上，加熱后使物質(zhì)溶解。等到所有物質(zhì)從固態(tài)轉(zhuǎn)變成液態(tài)（或全部溶解于水中）后，向燒杯中加入水分至目標(biāo)體積。調(diào)整培養(yǎng)基的pH 值。牛肉膏制備培養(yǎng)基的物質(zhì)全部溶化之后，研究人員應(yīng)使用pH 試紙測量培養(yǎng)基的原始pH 值。若結(jié)果顯示偏酸性，則使用滴管抽取少量氫氧化鈉溶液，之后逐滴向培養(yǎng)基中加入，每加入一滴均需使用玻璃棒攪拌，隨時(shí)測量酸堿值，最終將pH 值控制為7.4～7.6[3]。

2）試驗(yàn)儀器的消毒作業(yè)。超凈工作臺(tái)，使用清潔毛巾蘸取75%醫(yī)用酒精后擦拭超凈工作臺(tái)工作區(qū)域。之后開啟紫外線燈持續(xù)照射工作區(qū)域10 min。其他儀器設(shè)備使用之前均放置在添加醫(yī)用酒精的水溶液中浸泡10 min，之后放置于純化水中沖洗3 遍，最后放置于超凈工作臺(tái)上，在紫外光燈的照射下，烘干內(nèi)外表面水分后備用。完成對(duì)所有試驗(yàn)儀器的滅菌處理后，將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿之中，放置于無菌環(huán)境下靜置，待凝固成固體之后使用標(biāo)簽紙?jiān)谄渖蠘?biāo)注序號(hào)，以備后續(xù)試驗(yàn)使用。

1.2.2 水稻種子樣品表面消毒方法及分組比對(duì)方式

1）使用電子天平，稱取若干粘兩優(yōu)4011 中秈遲熟兩系雜交水稻種子，種子樣品應(yīng)飽滿、充盈、個(gè)大，按照每組1 g 的標(biāo)準(zhǔn)分成6 組[4]。

2）隨機(jī)選取一組種子樣品，放置于經(jīng)過滅菌處理的培養(yǎng)皿中。之后向該培養(yǎng)皿中加入適量無菌水，完成對(duì)種子樣品的清洗，確保種子樣品表面沒有肉眼可見的灰塵之后取出種子，使用吸水紙吸干種子表面的水分。

3）取培養(yǎng)皿中清洗過種子樣本的淋洗水0.1 mL，滴到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上，之后放置于28 ℃的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48 h。

4）將經(jīng)過處理后的多組水稻種子樣品分別放置于70%乙醇溶液、0.1%氯化汞溶液、0.1%硫酸銅溶液、5%過氧化氫溶液、5%高錳酸鉀溶液、10%次氯酸鈉溶液中浸泡3 min，之后取出種子樣本，放在無菌水中至少?zèng)_洗5 次，確保5 次沖洗使用干凈的無菌水。完成最后一次無菌水沖洗之后，使用移液槍工具取出0.1 mL放置于全新的培養(yǎng)基中，重復(fù)培養(yǎng)步驟。

5）根據(jù)最后一次沖洗所用無菌水中的細(xì)菌檢測結(jié)果，選取消毒效果最好的一組，之后將該組對(duì)應(yīng)的試劑作為主要分析對(duì)象，重新選取4 組水稻種子，按照所述步驟完成表面灰塵沖洗，放置于裝滿選定試劑的燒杯中，確保4 個(gè)燒杯中的試劑種類、濃度、劑量完全相同，但放置時(shí)間存在差異，分別設(shè)置成30 s、1 min、5 min、30 min，完成浸泡后重復(fù)浸泡、沖洗、培養(yǎng)步驟。

1.2.3 針對(duì)水稻種子樣品表面消毒效果的測定

1）對(duì)滴入水稻種子第一次淋洗液且經(jīng)過48 h 培養(yǎng)的培養(yǎng)基中的細(xì)菌種類及數(shù)量進(jìn)行測定。

2）對(duì)滴入水稻種子最后一次沖洗用無菌水且經(jīng)過48 h 培養(yǎng)的培養(yǎng)基中的細(xì)菌種類及數(shù)量進(jìn)行測定。

3）檢查基于消毒效果最好的試劑（單一試劑）在不同浸泡時(shí)間下呈現(xiàn)的消毒效果。

4）使用對(duì)應(yīng)的試劑水稻種子浸泡不同時(shí)間后，每間隔2 h 檢測種子內(nèi)生細(xì)菌菌落生成情況，比對(duì)并確認(rèn)在表面消毒效果最佳狀態(tài)下，消毒試劑的最佳浸泡時(shí)間。

2 結(jié)果與分析

2.1 多種種子表面消毒試劑的應(yīng)用效果分析

僅經(jīng)過表面灰塵清洗后的清洗水中檢測到雜菌，且雜菌量級(jí)為6，雜菌密度為6+；使用0.1%氯化汞溶液消毒后的水稻樣品，第五次無菌水沖洗液中檢測到雜菌，數(shù)量和密度分別為1 和1+；使用0.1%硫酸銅溶液消毒后的水稻樣品，第五次無菌水沖洗液中檢測到雜菌，數(shù)量和密度分別為2 和2+；使用5%高錳酸鉀溶液消毒后的水稻樣品，第五次無菌水沖洗液中的雜菌檢測結(jié)果與0.1%硫酸銅溶液基本一致；使用5%過氧化氫溶液消毒后的水稻樣品，第五次無菌水沖洗液中檢測到雜菌，數(shù)量和密度分別為3 和3+；使用70%乙醇溶液消毒后的水稻樣品，第五次無菌水沖洗液中檢測到雜菌，數(shù)量和密度分別為2 和2++；使用10%次氯酸鈉溶液消毒后的水稻樣品，第五次無菌水沖洗液中沒有檢測到雜菌，數(shù)量和密度均為0。

2.2 次氯酸鈉溶液消毒強(qiáng)度差異（浸泡時(shí)間差異）對(duì)水稻種子表面消毒效果造成的影響

10%次氯酸鈉溶液應(yīng)用于水稻種子表面消毒后，呈現(xiàn)出的殺菌效果最佳。圍繞10%次氯酸鈉溶液浸泡水稻種子樣品的時(shí)間開展對(duì)照分析，結(jié)果如下。

將水稻種子在10%次氯酸鈉溶液中浸泡30 s 后，對(duì)第五次無菌水沖洗液進(jìn)行檢測，在其中發(fā)現(xiàn)1.5%和2.5%的活性氯成分，密度均為1+；浸泡1 min 后，第五次無菌水沖洗液中只發(fā)現(xiàn)1.5%活性氯，密度為1+；浸泡5 min 后，第五次無菌水沖洗液中沒有發(fā)現(xiàn)任何活性氯；浸泡30 min 后，第五次無菌水沖洗液中沒有發(fā)現(xiàn)任何活性氯。

2.3 次氯酸鈉溶液消毒強(qiáng)度差異（浸泡時(shí)間差異）對(duì)水稻種子植物內(nèi)生有益菌生成造成的影響結(jié)果

使用10%次氯酸鈉溶液對(duì)水稻種子浸泡30 s 后，間隔12 h，水稻種子樣品中檢測到植物內(nèi)生菌，此時(shí)數(shù)量為4+；浸泡1 min 后，間隔12 h 發(fā)現(xiàn)植物內(nèi)生菌，此時(shí)數(shù)量為5+；浸泡5 min 后，間隔36 h 發(fā)現(xiàn)植物內(nèi)生菌，此時(shí)數(shù)量為4+；浸泡30 min 后，間隔48 h 發(fā)現(xiàn)植物內(nèi)生菌，此時(shí)數(shù)量為2+。

3 結(jié)論與討論

3.1 當(dāng)前幾種常用水稻種子表面消毒試劑的討論

1）根據(jù)結(jié)果可知，對(duì)水稻種子進(jìn)行簡單清洗，只是達(dá)到“人類肉眼看不到表面灰塵”的程度，無法有效清除種子表面的菌群，甚至可以理解為“基本沒有效果”。

2）評(píng)估70%乙醇溶液、0.1%氯化汞溶液、0.1%硫酸銅溶液、5%過氧化氫溶液、5%高錳酸鉀溶液、10%次氯酸鈉溶液的種子表面消毒效果。結(jié)果顯示，5%過氧化氫的消毒效果最差，細(xì)菌殘余量和密度最大；0.1%硫酸銅溶液、5%高錳酸鉀溶液、70%乙醇溶液3 種試劑的效果不佳，仍有一定量的細(xì)菌殘余；0.1%氯化汞的消毒效果尚可，但仍有微弱細(xì)菌殘余；10%次氯酸鈉溶液的消毒效果最好，經(jīng)過該溶液浸泡后，水稻種子表面無任何細(xì)菌殘存。

3.2 有關(guān)10%次氯酸鈉溶液的最佳浸泡時(shí)間的結(jié)論

同一種消毒溶液，浸泡時(shí)間的長短會(huì)在一定程度上影響水稻種子表面的消毒效果，對(duì)種子內(nèi)部生成植物內(nèi)生有益菌的速度、數(shù)量等造成影響。在病原菌滅殺方面，滅殺越徹底越好；在內(nèi)生有益菌方面，生成速度越快、數(shù)量越多越好。水稻種子浸泡10%次氯酸鈉溶液的時(shí)間必須基于上述兩種考量下，最終得出平衡結(jié)果。本研究結(jié)果顯示，使用10%次氯酸鈉溶液對(duì)水稻種子浸泡1 min 后，盡管內(nèi)生有益菌數(shù)量生成速度最快，且初步檢測到時(shí)的數(shù)量最多，但第五次無菌水沖洗液中依然含有一定量的細(xì)菌；浸泡5 min 后，盡管沒有任何細(xì)菌殘存，但內(nèi)生有益菌的生成速度和初步檢測到時(shí)的數(shù)量較慢、較少，故最佳浸泡時(shí)間應(yīng)介于二者之間。