黃國帥 袁和興 劉浩然 劉昊鵬

蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，江蘇蘇州 215006

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤，在惡性腫瘤中位列第10位，男性膀胱癌的發(fā)病率和病死率大約是女性的4倍[1]。膀胱癌分為非肌層浸潤性膀胱癌（non muscle invasive bladder cancer，NMIBC）和肌層浸潤性膀胱癌（muscle invasive bladder cancer，MIBC），NMIBC占絕大多數(shù)，大約為75%，而MIBC約占剩下的25%[2-3]。NMIBC復(fù)發(fā)率較高，5年復(fù)發(fā)率近50%[4]，給家庭和社會帶來巨大的經(jīng)濟負擔。因此，需要開發(fā)一種簡單、廉價、無創(chuàng)的癌癥檢測方法來診斷與監(jiān)測膀胱癌。液體活檢具有樣本易得、創(chuàng)傷小甚至無創(chuàng)等優(yōu)點，液體活檢的樣本通常有血液、尿液、唾液及乳液等[5]。尿液由于可進行無創(chuàng)收集，收取尿量的限制相對較小，認為是液體活檢的理想體液。尿液中常見的生物分子包括細胞DNA、游離DNA、不同種類的RNA、蛋白質(zhì)和外泌體。尿液上清液與腫瘤組織的標本一致性強于尿沉渣，尿液游離DNA（urinary cellfree DNA，ucfDNA）可能是尿液沉積物更敏感的替代品[6]。ucfDNA的應(yīng)用較為廣泛，不僅可以用于膀胱癌的診斷，而且在區(qū)分不同階段的膀胱癌、監(jiān)測術(shù)后復(fù)發(fā)中起積極作用。

1 尿液游離DNA的起源與特征

ucfDNA按來源可分為三類：尿路細胞DNA、經(jīng)腎DNA以及來源泌尿系感染的細菌與病毒DNA。尿路細胞DNA是從泌尿生殖道進入尿液的細胞產(chǎn)生的DNA[7-8]，而經(jīng)腎DNA是指循環(huán)中經(jīng)腎小球濾過進入尿液的無細胞DNA。泌尿系統(tǒng)腫瘤可將癌變細胞釋放到尿液中?；诮?jīng)腎DNA的假設(shè)，多項研究證明非泌尿系統(tǒng)的疾?。ńY(jié)直腸癌、肺癌等[9-10]）可以使用尿液游離DNA進行診斷。根據(jù)ucfDNA片段大小可進一步分為兩類：高分子量ucfDNA和低分子量ucfDNA。高分子量ucfDNA片段長于1 kbp，它們主要來自泌尿生殖道上的壞死細胞或通常存在于尿液中的淋巴細胞。低分子量ucfDNA片段通常來自循環(huán)或與尿液接觸的凋亡細胞，其片段長度的主要范圍在10～400 bp[11]。正常細胞凋亡的DNA呈高度片段化，而來自壞死癌細胞的DNA能保持其完整性[12]。泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤中ucfDNA的來源可能是泌尿道細胞和經(jīng)腎cfDNA。在泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤中，ucfDNA的研究甚為廣泛，其中關(guān)于膀胱癌的研究較多，有希望成為膀胱癌的診斷、分期、預(yù)后、監(jiān)測進展的新興標志物。

2 尿液的收集與儲存

由于夜間會有更多的泌尿系統(tǒng)的細胞和細胞碎片脫落到尿液中，第一次晨尿中具有更高的DNA產(chǎn)量，絕大多數(shù)研究會收集第一次晨尿。有學(xué)者建議選擇第二次晨尿（第一次晨尿后2～3 h）進行研究[13]，有兩方面原因：①可以標準化尿液在膀胱中停留時間；②選擇第二次晨尿可以避免高濃度和高水平的細胞溶解。由于尿液中核酸酶活性高且種類復(fù)雜，尿中ucfDNA容易降解，收集到的尿液進行合理儲存也很重要。Li等[14]開發(fā)了標準化的尿液收集管，尿液可以在環(huán)境溫度下完整保存長達7 d，保持尿細胞的原始形態(tài)，確保了ucfDNA的原始比例和完整性。但尿液的收集與保存的方法仍需要繼續(xù)探究，效果較好且各實驗室統(tǒng)一的尿液收集、保存方法是為接下來的ucfDNA的提取、分析提供保障。

3 尿液游離DNA的分離、定量方法

ucfDNA的分離和定量對于研究ucfDNA在膀胱癌中的臨床價值具有至關(guān)重要的意義。ucfDNA臨床應(yīng)用的可靠性在很大程度上取決于ucfDNA分離和檢測過程中檢測方法的靈敏度和重現(xiàn)性，技術(shù)的發(fā)展主要集中在提高尿液中短DNA片段的分離和檢測靈敏度[15]，這是因為尿液中cfDNA的濃度相對較低，且ucfDNA的片段大多較短[16]。

尿液游離DNA來自尿液上清液，需要從中分離游離DNA，DNA提取方案的選擇應(yīng)盡可能的獲取充足和高質(zhì)量的DNA?？梢愿鶕?jù)要處理的尿量進行選擇，對于＞3 ml的尿液，Quick-DNA尿液試劑盒是最佳選擇，而對于1 ml或更少的尿液，可以使用其他方法（如Qiagen的DNA Mini試劑盒）。由于ucfDNA的濃度較低，1 ml的尿液可能不足以進行下游分析（如基因拷貝數(shù)分析和基因突變）[13]。未來的研究需要確定獲得標準化、可重復(fù)的ucfDNA提取方法。ucfDNA的定量方法通常使用分光光度法、熒光法以及擴增法，有研究證實各個熒光法得出的結(jié)果較為類似，如研究需要進行精確的定量，不推薦使用分光光度法[13，17]?？傊瑄cfDNA定量方法需要進一步的開發(fā)與研究。

4 膀胱癌的臨床應(yīng)用

尿液作為診斷生物標志物理想來源具有巨大潛力，其中ucfDNA應(yīng)用價值研究越來越受歡迎，大量研究表明ucfDNA可以用來診斷膀胱癌，大體可從兩個層面研究：①分子水平上主要從ucfDNA的濃度及完整性上來判斷患者是否患有膀胱癌；②遺傳水平上主要從DNA的表達、突變和甲基化進行分析。ucfDNA除了可以鑒別是否為膀胱癌，還可以用于膀胱癌的早期診斷和復(fù)發(fā)監(jiān)測等，ucfDNA在膀胱癌中應(yīng)用值得關(guān)注。

4.1 從分子水平上研究

4.1.1 尿液中游離DNA濃度 最早的研究發(fā)現(xiàn)膀胱癌患者尿液中游離DNA的濃度比健康受試者更高[18]，是否能夠區(qū)分膀胱癌，此團隊繼續(xù)擴大樣本進一步進行研究，而研究結(jié)果表明，ucfDNA在膀胱癌患者和健康個體之間沒有顯著差異[19]，因此得出ucfDNA濃度不能夠診斷膀胱癌。而Brisuda等[20]使用ucfDNA濃度乘以尿量的體積（即ucfDNA總量）進行研究，不但可以區(qū)分出膀胱癌的患者，而且在腫瘤低分期與高分期之間有顯著差異。作者認為ucfDNA總量有希望區(qū)分不同分期的膀胱癌。

由于尿液生化物質(zhì)的值廣泛受到尿肌酐（Ucr）值的影響，因此，有學(xué)者嘗試通過將ucfDNA除以Ucr濃度（ucfDNA/Ucr）來確定相對ucfDNA濃度，結(jié)果表明ucfDNA/Ucr可用作膀胱癌的潛在腫瘤標志物，尤其是用于檢測更長的DNA片段[21]。上述各項研究表明ucfDNA在診斷膀胱癌方面結(jié)果較為滿意，而ucfDNA濃度來診斷膀胱癌的結(jié)果不一致可能與使用各種非標準化方法有關(guān)。

4.1.2 尿液中游離DNA完整性 凋亡細胞產(chǎn)生的DNA片段較為均勻，而腫瘤細胞由于壞死，會產(chǎn)生較長的DNA片段。Chang等[21]基于400 bp實時PCR的檢測方法進行研究，結(jié)果對膀胱癌的診斷更加準確、可靠，證明了ucfDNA完整性是可以用于診斷膀胱癌。有學(xué)者通過ucfDNA的長度超過250 bp（c-MYC、BCAS1和HER2）的序列完整性成功診斷出膀胱癌[12]。與脫落細胞學(xué)檢查相比，其在區(qū)分低級別和早期膀胱癌中展現(xiàn)出明顯優(yōu)勢，而此三者基因序列的值相加更能準確診斷出膀胱癌。因此，通過檢測尿液中游離DNA完整性來診斷膀胱腫瘤是可靠的，甚至可以用于膀胱腫瘤的早期檢測。

4.2 從遺傳水平上研究

4.2.1 尿液中游離DNA序列改變 除了分子水平外，ucfDNA在遺傳水平上具有較大的診斷價值。一直以來，檢測ucfDNA基因組改變的方法主要是基于PCR的檢測方法。一項新型的低頻突變液體活檢檢測技術(shù)降低了ucfDNA液體活檢的PCR偏差[22]。最近，新型分子檢測技術(shù)的快速發(fā)展，如微滴數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）技術(shù)和二代測序（next-generation sequencing，NGS），極大地提高了ucfDNA檢測的靈敏度[23]。這些新開發(fā)的檢測方法已被證明可以更深入地了解ucfDNA在癌癥中的臨床效用[24]。

在ucfDNA和尿沉淀DNA中，TERT突變等位基因頻率（mutation allele frequencies，MAF）高度相關(guān)，來自富含白細胞的尿液中的MAF在ucfDNA中高于尿沉淀DNA，這表明ucfDNA在此類尿液中具有診斷優(yōu)勢[25]。由此可見，尿液游離DNA受其他細胞DNA的影響較小。在膀胱癌組織中TERT啟動子和FGFR3突變較為常見，同樣ucfDNA中TERT啟動子和FGFR3突變不僅可以準確地診斷膀胱癌，而且在監(jiān)測術(shù)后復(fù)發(fā)方面也具有價值。有研究利用TERT突變等位基因頻率進行術(shù)后復(fù)發(fā)監(jiān)測，突變陽性患者具有明顯的復(fù)發(fā)傾向[23]，ucfDNA在監(jiān)測膀胱癌復(fù)發(fā)方面具有積極作用。為進一步提高膀胱癌診斷的準確性，多基因聯(lián)合診斷膀胱癌也被應(yīng)用于ucfDNA上，尿液上清液的五個基因[26]（TERT、FGFR3、TP53、PIK3CA和KRAS）膀胱癌診斷模型不僅可以準確識別血尿人群中膀胱癌患者，而且在無血尿患者的膀胱癌篩查中具有巨大潛力。

有學(xué)者對ucfDNA進行低深度全基因組測序（shallow whole-genome sequencing，sWGS），評估基因拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV），利用支持向量機開發(fā)了一個基于CNV配置文件的診斷分類器[6]，檢測尿路上皮癌準確度高。值得注意的是，該分類器可用于監(jiān)測膀胱癌的復(fù)發(fā)和評估治療效果。但研究的樣本量相對較少，需要更多的案例來捕捉CNV異質(zhì)性并提高該方法的準確性。Cheng等[27]通過尿液cfDNA的低深度全基因組亞硫酸氫鹽測序進行甲基化和拷貝數(shù)分析，使用甲基化去卷積、全局低甲基化和CNVs三個獨立參數(shù)來檢測膀胱癌。甲基組學(xué)和拷貝數(shù)方法協(xié)同結(jié)合檢測膀胱癌，大大提高了檢測NMIBC的敏感度。通過高通量的測序方法獲取ucfDNA甲基化和拷貝數(shù)等參數(shù)可以檢測出早期膀胱癌，也可應(yīng)用于評估手術(shù)殘留及監(jiān)測復(fù)發(fā)方面。

4.2.2 尿液中游離DNA表達改變 關(guān)于ucfDNA的表達方面的研究，Xu等[28]通過ucfDNA中IQGAP3/BMP4和IQGAP3/FAM107A比率開發(fā)判別評分指數(shù)區(qū)分膀胱癌和其他血尿疾患。此評分系統(tǒng)不僅可以將膀胱癌與其他血尿疾患相區(qū)分，而且能區(qū)別出NMIBC與MIBC。進一步的研究得知ucfDNA中IQGAP3/BMP4的過度表達與復(fù)發(fā)和進展有關(guān)，IQGAP3/BMP4比值是NMIBC中無復(fù)發(fā)生存率和無進展生存率的獨立危險因素[29]。

5 不足與展望

利用ucfDNA作為生物標志物來檢測膀胱癌的方法具有較高的準確度，有很好的臨床應(yīng)用前景。但仍有一些嚴重的缺點不能被忽視。首先，對于ucfDNA的提取、分離、定量的方法并沒有標準化，各個實驗室之間產(chǎn)生的結(jié)果有所差異。新型高通量測序價格昂貴，而且需要培養(yǎng)專業(yè)的人員進行操作。此外，ucfDNA的研究對診斷早期的膀胱癌的敏感性較低，而往往低分期、低分級占有很大比例。當然，大多數(shù)的研究受限于樣本量不足，并且缺少外部驗證，需要用前瞻性、大樣本的實驗來進行驗證。

隨著臨床對于ucfDNA的研究越來越多，相應(yīng)的不足將會得到完善。ucfDNA在膀胱癌中具有很大的臨床潛力，不僅用作膀胱癌的診斷，而且對于判斷治療效果、監(jiān)測術(shù)后復(fù)發(fā)、預(yù)測無復(fù)發(fā)生存期具有重大意義，應(yīng)用多基因的診斷模型將大大提高診斷的敏感性，高敏感度和特異度的診斷模型的應(yīng)用將減少膀胱鏡的使用，減少患者的疼痛。

6 總結(jié)

從尿液上清液中分離出的ucfDNA具有天然的無創(chuàng)優(yōu)勢，在膀胱癌的診斷與治療過程中具有很大的臨床潛力。從ucfDNA的完整性、濃度、測序和表達結(jié)果方面進行研究，ucfDNA可以區(qū)分癌癥患者和健康者，除此之外，還可以區(qū)分不同階段的膀胱癌患者，而且在判斷治療效果、監(jiān)測術(shù)后復(fù)發(fā)、預(yù)測無復(fù)發(fā)生存期中具有重要意義。因此，ucfDNA是一種非常有前途的工具，有很大的潛力轉(zhuǎn)化為臨床實踐。