胡 娜,利佳煒,閆珍珍,陳 雄,李 欣*
(工業(yè)發(fā)酵省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心,發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北省工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院,湖北 武漢 430068)
蛋白質(zhì)是生命體生理功能的主要參與者和執(zhí)行者,是基因響應(yīng)和環(huán)境變化之間溝通的橋梁[1],因此研究蛋白質(zhì)變化能直觀闡明生命體產(chǎn)生差異性狀的原因。對(duì)生物體開展高通量高精度的蛋白質(zhì)水平分析,有利于探究環(huán)境或外源物質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)合成的影響,發(fā)現(xiàn)蛋白基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的關(guān)鍵位點(diǎn)[2]。早期所建立的蛋白質(zhì)定性方法如化學(xué)測(cè)序法、酶聯(lián)免疫吸附劑試驗(yàn)、蛋白質(zhì)免疫印跡法以及雙向熒光差異電泳法等[3-5]已不能滿足新時(shí)代蛋白質(zhì)研究的需求。隨著蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷完善,以定量為目的的檢測(cè)成為當(dāng)下及未來(lái)的研究趨勢(shì)。
細(xì)胞蛋白質(zhì)組檢測(cè)難度大,獲取酵母蛋白質(zhì)組學(xué)所需的量化數(shù)據(jù)必須結(jié)合自動(dòng)化技術(shù)和計(jì)算機(jī)技術(shù)。質(zhì)譜法是結(jié)合這兩種技術(shù)實(shí)現(xiàn)高通量自動(dòng)化表征蛋白質(zhì)組的理想手段。其中液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)技術(shù)作為代表性技術(shù)之一,在研究蛋白質(zhì)豐度跨度較大的酵母時(shí),可分析鑒定出低豐度的蛋白質(zhì)[6]?;贚C-MS/MS可將蛋白質(zhì)組學(xué)研究分為兩類:“自上而下”蛋白質(zhì)組學(xué)[7]和“自下而上”蛋白質(zhì)組學(xué)[8]?!白陨隙隆钡鞍踪|(zhì)組學(xué)可直接完整獲取蛋白質(zhì)序列信息,而“自下而上”蛋白質(zhì)組學(xué)通過(guò)鑒別多肽來(lái)獲取蛋白質(zhì)信息。相比較而言,“自下而上”蛋白質(zhì)組定量技術(shù)不僅能在復(fù)雜體系中高效獲取蛋白質(zhì)組信息,還能高通量的處理蛋白種類龐雜的樣品[9]。食品加工用酵母作為一類在基礎(chǔ)研究、食品釀造和工業(yè)發(fā)酵等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用的真核微生物,其蛋白質(zhì)組學(xué)研究一直受到相關(guān)研究人員的關(guān)注。在食品加工用酵母蛋白質(zhì)組學(xué)中應(yīng)用“自下而上”蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)適用性更廣?;诖?,本綜述主要介紹近5 年“自下而上”蛋白質(zhì)組定量技術(shù)及其應(yīng)用于食品加工用酵母研究的最新進(jìn)展。
“自下而上”蛋白質(zhì)組技術(shù)提出后經(jīng)過(guò)不斷優(yōu)化改進(jìn),逐漸適用于各個(gè)物種領(lǐng)域的研究,如植物、動(dòng)物、微生物以及人體的各個(gè)組織或器官等[10-12]。在酵母這類微生物結(jié)構(gòu)中,該技術(shù)由質(zhì)譜定量分析蛋白質(zhì)組降解的肽段推測(cè)所含蛋白質(zhì)濃度為原理展開(圖1)。從技術(shù)流程的角度大致可分為標(biāo)記定量(label quantification,LQ)法和無(wú)標(biāo)記定量(label-free quantification,LFQ)法[13-14]兩大類。同位素標(biāo)記作為分子領(lǐng)域最常見(jiàn)的技術(shù)手段之一,在定量蛋白質(zhì)組學(xué)中也有適應(yīng)性技術(shù)革新。同位素氨基酸標(biāo)記細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)(stable isotope labeling by amino acids in cell culture,SILAC)通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)基中添加含13C標(biāo)記的賴氨酸來(lái)開展研究。Sun Yu等[15]采用SILAC研究釀酒酵母(Saccharomyce cerevisiae)BY4741菌株生長(zhǎng)期間的蛋白質(zhì)組變化,發(fā)現(xiàn)衰老細(xì)胞與熱量限制(calorie restriction,CR)細(xì)胞的蛋白質(zhì)組之間顯著相關(guān),從而進(jìn)一步佐證了CR參與細(xì)胞衰老。然而單個(gè)同位素體內(nèi)標(biāo)記法鑒別蛋白質(zhì)組的效率有限,并且限制了酵母細(xì)胞的培養(yǎng)條件,所以目前研究多采用對(duì)多肽中多種氨基酸基團(tuán)進(jìn)行體外同時(shí)標(biāo)記。LFQ與同位素標(biāo)記定量技術(shù)相比操作更簡(jiǎn)便、價(jià)格更低廉、可對(duì)體態(tài)微小的生命體進(jìn)行大規(guī)模蛋白質(zhì)組定量研究。
圖1 “自下而上”測(cè)定酵母蛋白質(zhì)組流程Fig.1 Flow chart of the “bottom-up” procedure for proteomic analysis of yeast
同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)標(biāo)記法正逐漸成為常用的蛋白質(zhì)同位素標(biāo)記技術(shù)之一[16]。iTRAQ標(biāo)記法采用4 種或8 種同位素標(biāo)簽對(duì)多肽的氨基酸基團(tuán)特異性標(biāo)記,并可同時(shí)對(duì)多個(gè)樣品批量處理,針對(duì)酵母中相對(duì)分子質(zhì)量高的蛋白質(zhì)、極堿性蛋白質(zhì)和極酸性蛋白質(zhì)都有極高的檢出率[17]。此外,美國(guó)Thermo Scientific公司研發(fā)了一種新型多肽體外標(biāo)記技術(shù)為串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽標(biāo)記(tandem mass tag,TMT)技術(shù)[18]。迄今為止,TMT標(biāo)記技術(shù)可同時(shí)運(yùn)用16 種同位素對(duì)多肽的氨基基團(tuán)進(jìn)行特異性標(biāo)記,以此增加鑒定位點(diǎn)從而提升蛋白質(zhì)鑒定效率[19]。Gassaway等[20]通過(guò)TMT標(biāo)記技術(shù)針對(duì)釀酒酵母蛋白質(zhì)組開展的研究,測(cè)定發(fā)酵過(guò)程中11 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的蛋白質(zhì)和磷酸化位點(diǎn)的變化,辨析不同蛋白質(zhì)復(fù)合體的結(jié)構(gòu)、生長(zhǎng)和代謝途徑的差異化表現(xiàn)。
LFQ要求蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物進(jìn)入質(zhì)譜分析前需使用分餾技術(shù)使樣品充分分散,例如超濾輔助樣品制備(filter-aided sample preparation,F(xiàn)ASP)[21]、二維聚丙烯酰胺凝膠電泳(two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis,2D-PAGE)[22]、高pH值反相多肽分餾(high pH reversed-phase fractionation,HRP)[23]、超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography,UPLC)[24]等各種分離技術(shù)。蛋白分離技術(shù)結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)構(gòu)成了酵母蛋白質(zhì)組LFQ的完整方案。Zaman等[25]結(jié)合HRP分餾法分析添加過(guò)氧化氫和正常情況下酵母發(fā)酵過(guò)程中蛋白質(zhì)組差異,并提出該流程可適用于檢測(cè)植物的蛋白質(zhì)組從而推進(jìn)植物代謝工程的研究進(jìn)展。
近5 年來(lái),運(yùn)用同位素標(biāo)記定量技術(shù)鑒定酵母蛋白質(zhì)組的相關(guān)研究如表1所示。以釀酒酵母為研究對(duì)象的LFQ蛋白質(zhì)組檢測(cè)方案如表2所示。
表1 同位素標(biāo)記定量法測(cè)定酵母蛋白質(zhì)組技術(shù)方法Table 1 Isotope labeling methods for quantitative determination of yeast proteins
表2 LFQ測(cè)定釀酒酵母蛋白質(zhì)組技術(shù)方法Table 2 Label-free labeling methods for the quantitative determination of yeast proteins
蛋白質(zhì)組定量技術(shù)是以質(zhì)譜為理論依據(jù)開發(fā)的創(chuàng)新方法,而質(zhì)譜對(duì)蛋白質(zhì)測(cè)定的精準(zhǔn)度受到以下因素的影響:1)提取方案的差異;2)檢測(cè)對(duì)象的差異;3)結(jié)果信息分析手段的差異。因此,酵母蛋白質(zhì)組定量技術(shù)的優(yōu)化需從這3 個(gè)影響因素著手。酵母蛋白質(zhì)組測(cè)定過(guò)程中的關(guān)鍵技術(shù)點(diǎn)在于:蛋白質(zhì)組提取技術(shù)、蛋白質(zhì)組鑒定技術(shù)、生物學(xué)信息分析技術(shù)(圖2)。
圖2 酵母蛋白質(zhì)組分析技術(shù)路線圖Fig.2 Technical roadmap for yeast proteomic analysis
針對(duì)酵母蛋白質(zhì)組定量技術(shù)而言,細(xì)胞蛋白質(zhì)有效溶出率是首要關(guān)注重點(diǎn)[32]。然而,大多數(shù)酵母的細(xì)胞壁較厚,難以使胞內(nèi)蛋白質(zhì)全部溶出。目前胞內(nèi)酵母蛋白的釋放多采用物理破裂方法,如超聲波細(xì)胞裂解法和珠磨振蕩研磨法等。MP Biomedicals公司建立的FastPrep Lysis Matrix C beads技術(shù)[33]就是通過(guò)優(yōu)化研磨珠材質(zhì)進(jìn)而提升提取效率。然而,超聲波細(xì)胞裂解法和珠磨振蕩研磨法提取過(guò)程中產(chǎn)生的熱量會(huì)造成蛋白質(zhì)損失。因此,為確保高效破裂細(xì)胞的同時(shí)且無(wú)蛋白質(zhì)損耗,在低溫條件(通常為4 ℃)下采用溫和提取液進(jìn)行短時(shí)高效的細(xì)胞破壁處理可能是最優(yōu)提取方法。
蛋白質(zhì)提取最常見(jiàn)的方法是采用高濃度尿素(8 mol/L尿素+碳酸氫銨或Tris-HCl)來(lái)提高蛋白質(zhì)溶解度[23]。然而,高濃度尿素也會(huì)帶來(lái)不利的影響,如導(dǎo)致后續(xù)添加的蛋白酶變性并且需要增加脫鹽處理的步驟,而脫鹽處理不可避免地會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)造成損失。為優(yōu)化提取方案,Almeida等[34]對(duì)多種提取液進(jìn)行對(duì)比,發(fā)現(xiàn)大多數(shù)提取溶液配制復(fù)雜且均需要加入蛋白酶抑制劑,而美國(guó)Sigma-Aldrich公司的CelLytic Y試劑[35]在無(wú)需加入蛋白酶抑制劑的同時(shí),不僅可以高效裂解酵母細(xì)胞還可以避免蛋白質(zhì)損失。現(xiàn)有多家國(guó)際生物檢測(cè)公司推出更便捷的試劑,如美國(guó)Thermo Scientific公司的Y-PER?酵母蛋白提取試劑[36]中含有機(jī)緩沖劑、溫和的非離子洗滌劑以及各種鹽溶液;美國(guó)Sigma-Aldrich公司ProteoPrep?總蛋白提取試劑盒[37]中所含成分為4 種提取劑、碘乙酰胺和三丁基膦溶液;生工生物工程(上海)股份有限公司的一步法酵母活性蛋白提取試劑盒[38]的組成成分為提取試劑、蛋白酶抑制劑、DTT以及PMSF;美國(guó)Invent生物技術(shù)公司的Minute?酵母、細(xì)菌和微藻等厚胞壁微生物總蛋白提取試劑盒[39]含有變性緩沖液、天然緩沖液和蛋白提取粉。上述公司研發(fā)的試劑盒均采用多種溫和裂解液復(fù)合而成,在防止酵母蛋白質(zhì)變性的同時(shí),可盡可能地縮短提取時(shí)間,以獲取酵母胞內(nèi)完整的蛋白質(zhì)組。
LC-MS/MS技術(shù)是量化蛋白質(zhì)組濃度的有效手段,主要是通過(guò)最大化提取蛋白質(zhì)序列信息,進(jìn)而與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行有效比對(duì)分析。LC-MS/MS中液相系統(tǒng)的主要目的是最大化分散樣品并充分提高質(zhì)譜儀的利用率。研究表明美國(guó)Thermo Scientific公司的新型Vanquish Neo UHPLC[40]系統(tǒng)可縮短樣品進(jìn)樣時(shí)間,增加蛋白質(zhì)檢測(cè)的覆蓋率。LC-MS/MS中起關(guān)鍵作用的是質(zhì)譜系統(tǒng),主要透過(guò)一級(jí)相對(duì)分子質(zhì)量分析推斷出發(fā)生何種翻譯后的修飾,再測(cè)定二級(jí)碎片離子的相對(duì)分子質(zhì)量推斷出翻譯后修飾發(fā)生的位點(diǎn)[41-42]。依據(jù)MS1或MS2的信號(hào)強(qiáng)度鑒別多肽序列從而定位對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì),以此達(dá)到定性、定量分析蛋白質(zhì)組的目的。
為進(jìn)一步提升質(zhì)譜儀的性能,不同特點(diǎn)的質(zhì)譜儀聯(lián)用是一條可行的策略,包括能準(zhǔn)確鑒別同位素標(biāo)記位點(diǎn)的四極桿-飛行時(shí)間(quadrupole-time of fligh,Q-TOF)質(zhì)譜儀、能對(duì)肽段精準(zhǔn)定性的靜電場(chǎng)軌道阱以及能提升多肽鑒定覆蓋率的線性離子阱(linear ion trap,LIT)等進(jìn)行多種質(zhì)譜儀聯(lián)用模式[23,43]。張偉等[44]利用四極桿、靜電場(chǎng)軌道阱和線性離子阱三合一質(zhì)譜系統(tǒng)檢測(cè)酵母中蛋白質(zhì)組,在假陽(yáng)性率q<0.01的情況下圖譜的有效梯度解析率可達(dá)到42.1%。隨著質(zhì)譜儀性能不斷優(yōu)化,蛋白質(zhì)定量效果有顯著的提升。周岳等[45]以最新的Orbitrap Exploris 480質(zhì)譜儀配備電動(dòng)離子漏斗進(jìn)一步提高質(zhì)譜靈敏度。離子傳輸組件則采用最新的雙彎曲四極桿以提高抗污染能力,同時(shí)兼容高場(chǎng)非對(duì)稱波形離子遷移譜(high-field asymmetric wave formion mobility spectrometry,F(xiàn)AIMS)技術(shù)。此設(shè)備可提高對(duì)蛋白質(zhì)組分析的靈敏度和穩(wěn)定性,進(jìn)一步優(yōu)化數(shù)據(jù)依賴采集(data dependent acquisition,DDA)、數(shù)據(jù)獨(dú)立采集(data independent acquisition,DIA)以及TMT標(biāo)記法的關(guān)鍵質(zhì)譜參數(shù)。無(wú)論是辨認(rèn)同位素標(biāo)記點(diǎn)還是鑒定蛋白質(zhì)或肽段都需要盡可能提高質(zhì)譜的靈敏度、分辨率及可重復(fù)性。Johnson等[46]研究表明傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀(fourier-transform ion-cyclotron resonance mass spectrometry,F(xiàn)T-ICR-MS)在m/z400時(shí)可提供約為200 000的分辨能力,能發(fā)現(xiàn)在其他類型的質(zhì)譜儀中被遺漏的同位素峰簇并能直接確定蛋白質(zhì)翻譯后的修飾位點(diǎn)。交聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(cross-linking mass spectrometry,XL-MS)以非特異光化學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ),能高效鑒別蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)[47]。Gutierrez等[48]驗(yàn)證了XL-MS在大型蛋白質(zhì)復(fù)合物中使用光交叉連接鑒定的可行性,并且開發(fā)了以琥珀酰二嗪亞砜為基礎(chǔ)的新型質(zhì)譜交聯(lián)劑,以便質(zhì)譜快速準(zhǔn)確地鑒定光交叉連接的位置。然而,這些新技術(shù)在酵母蛋白質(zhì)研究中的應(yīng)用還不夠普遍,其可行性仍有待驗(yàn)證。常見(jiàn)定量質(zhì)譜儀的優(yōu)劣對(duì)比如表3所示。
表3 各類質(zhì)譜技術(shù)的對(duì)比Table 3 Comparison of various mass spectrometry techniques
生物信息技術(shù)包括對(duì)完整蛋白質(zhì)及多肽的質(zhì)譜數(shù)據(jù)預(yù)處理、數(shù)據(jù)庫(kù)搜索鑒定以及翻譯修飾后的位點(diǎn)定位等幾個(gè)方面[49],其中的關(guān)鍵核心是對(duì)質(zhì)譜中得到的數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行有效解析。隨著數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷完善,質(zhì)譜獲取的生物信息通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比從而預(yù)測(cè)結(jié)果是最常用的定性方法,一般與基因本體(gene ontology,GO)、蛋白質(zhì)直系同源簇(cluster of orthologous groups of proteins,COG)、京都基因和基因組(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)、蛋白質(zhì)家族(protein families,Pfam)、亞細(xì)胞定位(subcellular localization)[50-51]等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行聯(lián)用。但是這些理論序列并不能直接精準(zhǔn)鑒別所有酵母中的蛋白質(zhì)序列,需對(duì)其做出兩方面改進(jìn)。其一,從分析軟件著手,改變質(zhì)譜結(jié)果掃描策略;其二,從數(shù)據(jù)庫(kù)著手,開發(fā)針對(duì)性酵母蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)。
常見(jiàn)的質(zhì)譜儀DDA掃描模式可完整掃描出一般化合物相對(duì)分子質(zhì)量的生物學(xué)信息,但對(duì)于肽段離子的掃描存在限制性和隨機(jī)性,會(huì)導(dǎo)致生物信息的缺失率增高?,F(xiàn)多采用的DIA掃描技術(shù)將質(zhì)譜的整個(gè)全掃描范圍分為若干個(gè)窗口,高速、循環(huán)地對(duì)每個(gè)窗口中的所有離子進(jìn)行選擇、碎裂、檢測(cè),以此彌補(bǔ)DDA掃描模式造成的生物信息缺失,從而進(jìn)一步提升數(shù)據(jù)利用率[52]。在復(fù)雜的酵母樣品體系中,DIA掃描模式是通過(guò)二級(jí)質(zhì)譜信號(hào)進(jìn)行定量,減少了在一級(jí)質(zhì)譜信號(hào)中存在的相似質(zhì)荷比離子的干擾。Santos等[53]提出兩者結(jié)合的混合數(shù)據(jù)采集(mixed-data acquisition,MDA)技術(shù)有利于克服無(wú)標(biāo)簽定量法常見(jiàn)瓶頸的問(wèn)題,即m/z值無(wú)法區(qū)分。選用MDA技術(shù)提升酵母蛋白質(zhì)組分析的效率可能成為當(dāng)下及未來(lái)的一種新趨勢(shì)。如今,改善多級(jí)質(zhì)譜掃描策略可增進(jìn)蛋白質(zhì)定量統(tǒng)計(jì)方法的有效率。通常蛋白質(zhì)結(jié)果分析選用Protein Pilot軟件[54],其主要針對(duì)特異性肽鏈的序列分析鑒定。Tian Xiaobo等[55]在一級(jí)質(zhì)譜中利用DIA掃描模式對(duì)含LysC的酵母蛋白質(zhì)進(jìn)行分析,并利用乙酰-異亮氨酸-脯氨酸標(biāo)簽(acetyl-isoleucine-proline,Ac-IP)進(jìn)行三重標(biāo)記蛋白質(zhì)定量分析。為增加蛋白質(zhì)結(jié)果可信度,來(lái)自瑞典研究所的Zhu Yafeng等[56]提出了一種專為質(zhì)譜數(shù)據(jù)中的差異蛋白表達(dá)分析而開發(fā)的定量統(tǒng)計(jì)分析策略DEqMS。通常方差評(píng)估著重依賴于肽段量化的數(shù)量,而增加了單肽鑒定方案的DEqMS能更準(zhǔn)確地評(píng)估蛋白質(zhì)方差估計(jì)的數(shù)據(jù)依賴性。以上研究是基于提升特殊肽段離子鑒定蛋白質(zhì)的效率為目標(biāo)而進(jìn)行的創(chuàng)新,為完善生物信息分析完整度還需建立更具針對(duì)性的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)。一些研究人員已開始嘗試建立單一酵母針對(duì)性蛋白質(zhì)組序列數(shù)據(jù)庫(kù),如Picotti等[57]建立了一種由釀酒酵母多肽序列生成的數(shù)據(jù)庫(kù),可用于精確分析釀酒酵母蛋白質(zhì)的數(shù)量性狀位點(diǎn)(quantitative trait loci,QTL),由此構(gòu)建了一套完整的釀酒酵母蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法。Rathod等[58]開發(fā)并建立了第一個(gè)酵母磷酸肌苷結(jié)合蛋白(yeast phosphoinositide-binding proteins,YPIBP)數(shù)據(jù)庫(kù),主要用于多種酵母磷酸化蛋白質(zhì)組的鑒定。
酵母被廣泛應(yīng)用于酒、調(diào)味品、乳品、酵素、面包等食品發(fā)酵和食品釀造過(guò)程中。酵母蛋白質(zhì)組定量技術(shù)有助于分析工業(yè)發(fā)酵和食品釀造中酵母蛋白質(zhì)變化,以及不同應(yīng)用條件下酵母蛋白質(zhì)的響應(yīng)特征,從而闡明酵母代謝特征和調(diào)控機(jī)制,開發(fā)出更有應(yīng)用優(yōu)勢(shì)的酵母菌株并實(shí)現(xiàn)加工工藝的優(yōu)化和產(chǎn)品品質(zhì)的提升。近5 年研究人員對(duì)食品加工用酵母蛋白質(zhì)組的研究如表4所示。
表4 近5 年食品加工用酵母蛋白質(zhì)組的研究Table 4 Proteomic studies on yeasts used for food processing in the past five years
為提升酒、乳品和酵素等食品的產(chǎn)量進(jìn)行酵母功能性改造不失為一種選擇。Negoro等[68]采用定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)高產(chǎn)蘋果酸的菌株進(jìn)行蛋白質(zhì)差異化解析,發(fā)現(xiàn)高產(chǎn)蘋果酸的關(guān)鍵因素與清酒中內(nèi)含葡萄糖誘導(dǎo)降解缺陷(glucose-induced degradation deficient,GID)蛋白編碼基因(GID1-GID9)有關(guān),其中GID1、GID2、GID3、GID4、GID5、GID8和GID9表達(dá)的產(chǎn)物均可使釀酒酵母產(chǎn)出的蘋果酸含量提升。本團(tuán)隊(duì)對(duì)魯氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)進(jìn)行基因組測(cè)序,以此尋找蛋白質(zhì)編碼基因序列的信息[69]。Li Zhen等[70]對(duì)含核糖體蛋白rP59的菌體定量解析多種蛋白質(zhì)的基因表達(dá)位點(diǎn),由此提出核糖體組裝與蛋白基因表達(dá)調(diào)控的耦合模型。通過(guò)蛋白質(zhì)組定量技術(shù)可研究mRNA的轉(zhuǎn)錄、加工和翻譯期間的不同影響機(jī)制。酵母中還含有多處mRNA-蛋白質(zhì)調(diào)控位點(diǎn)[71],進(jìn)而增加了mRNA合成蛋白質(zhì)過(guò)程的可變性。這個(gè)過(guò)程的關(guān)鍵點(diǎn)在于mRNA合成蛋白時(shí)會(huì)先產(chǎn)生一段特殊的肽鏈序列——信號(hào)肽,其可引導(dǎo)新生蛋白穿過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜進(jìn)行分泌。蛋白質(zhì)定量技術(shù)提供了蛋白質(zhì)序列的精確信息,可為找尋特殊的信號(hào)肽序列提供可能性。華東理工大學(xué)的Zhu Jinxiang等[72]根據(jù)畢赤酵母整個(gè)蛋白質(zhì)的鑒定結(jié)果,檢驗(yàn)出a信號(hào)肽密碼子對(duì)畢赤酵母所攜帶蛋白質(zhì)的分泌效率產(chǎn)生影響,從而設(shè)計(jì)出更合理的a信號(hào)肽密碼子以此改進(jìn)畢赤酵母的基因序列。
真核微生物的蛋白質(zhì)成熟需經(jīng)過(guò)加工處理,即翻譯后的修飾過(guò)程,該過(guò)程與調(diào)控生命進(jìn)程的變化息息相關(guān)。蛋白質(zhì)在修飾過(guò)程中會(huì)發(fā)生磷酸化、泛素化、甲基化、糖基化、脂基化或乙?;萚73-74]變化。參與酵母的生長(zhǎng)發(fā)育、信號(hào)傳導(dǎo)以及病變發(fā)生發(fā)展的許多蛋白質(zhì)都需要以不同的方式進(jìn)行翻譯后修飾。定量蛋白質(zhì)組分析技術(shù)為揭示蛋白質(zhì)翻譯后修飾的基本規(guī)律和明確蛋白質(zhì)的修飾進(jìn)程提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持。酵母細(xì)胞對(duì)于合成基酒和天然基酒中高分子質(zhì)量多糖和低聚糖的差異性化起作用[75]。袁鐵錚[76]則通過(guò)LFQ蛋白質(zhì)組技術(shù)法分析不同碳源培養(yǎng)條件下的樹干畢赤酵母(Pichia stipitis)磷酸化蛋白質(zhì)組變化情況,結(jié)果顯示葡萄糖培養(yǎng)下酵母細(xì)胞內(nèi)存在351 種磷酸化蛋白質(zhì),而木糖會(huì)明顯增加其中45 種磷酸化修飾蛋白的豐度。代謝途徑匯聚分析則表明糖酵解(embden-meyerhof-parnas pathway,EMP)、三羧酸循環(huán)(tricarboxylic acid cycle,TCA)和戊糖磷酸途徑(pentose phosphate pathway,PPP)中的部分關(guān)鍵酶的磷酸化修飾都受到碳源的影響。Matsuki等[77]研究釀酒酵母細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)途徑時(shí),發(fā)現(xiàn)在該時(shí)期添加衣霉素可提升內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的核糖體蛋白u(yù)S10、uS3和eS7的泛素化水平。
食品發(fā)酵過(guò)程中為達(dá)到產(chǎn)品工業(yè)化生產(chǎn),往往會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵環(huán)境不利于酵母的生長(zhǎng)。在高濃度環(huán)境下酵母蛋白質(zhì)組學(xué)會(huì)產(chǎn)生明顯變化,研究酵母高產(chǎn)性菌株可從蛋白質(zhì)組學(xué)的角度進(jìn)行分析。蛋白質(zhì)組的濃度變化與酵母生長(zhǎng)調(diào)控路徑有密切聯(lián)系。在發(fā)酵過(guò)程中酵母細(xì)胞會(huì)伴隨發(fā)生一系列環(huán)境脅迫,如在工業(yè)發(fā)酵和食品釀造的過(guò)程中常常會(huì)受到高溫、高糖、高含量的有機(jī)酸或乙醇等物質(zhì)的干擾。環(huán)境脅迫不僅會(huì)使酵母生長(zhǎng)進(jìn)程發(fā)生改變,還會(huì)同步影響酵母蛋白質(zhì)組濃度。研究發(fā)現(xiàn)酵母蛋白質(zhì)組定量技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)能夠預(yù)測(cè)在酵母生長(zhǎng)、物質(zhì)跨膜運(yùn)輸、中間代謝或呼吸過(guò)程中起決定性作用的蛋白質(zhì)數(shù)量以及其作用效果。由此結(jié)果建立在不同應(yīng)激反應(yīng)條件下的早期和晚期細(xì)胞生物學(xué)模型,有助于完整闡釋逆境與蛋白質(zhì)的關(guān)系[78]。此外,探究酵母在多種不利環(huán)境條件的蛋白質(zhì)組變化,有助于建立更優(yōu)質(zhì)的食品發(fā)酵體系。袁鐵錚[76]利用LFQ蛋白質(zhì)組技術(shù)在培養(yǎng)條件分別為木糖和葡萄糖的畢赤酵母中共鑒定出4 085 種蛋白質(zhì),表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)分別有1 551 種和789 種。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在木糖培養(yǎng)條件下,PPP和脂肪酸代謝途徑的差異蛋白質(zhì)大部分上調(diào)。本團(tuán)隊(duì)針對(duì)源于醬油發(fā)酵中的魯氏接合酵母在熱激下的響應(yīng)條件進(jìn)行探索[79],對(duì)其蛋白質(zhì)組結(jié)果進(jìn)行預(yù)判,基于文獻(xiàn)提出合理性假設(shè)并將驗(yàn)證其可行性。在食品發(fā)酵的過(guò)程中,酵母也可能因?yàn)橥庠次镔|(zhì)中殘留的有害物質(zhì)影響其蛋白質(zhì)的特異性表達(dá)。Liu Shuai等[80]通過(guò)無(wú)標(biāo)記蛋白質(zhì)組定量技術(shù)研究加入青蛤凝集素孵育24 h后釀酒酵母蛋白表達(dá)譜的變化,分析在發(fā)酵過(guò)程中刺激機(jī)制的具體影響及原因。
細(xì)胞器在酵母生長(zhǎng)過(guò)程中都起到重要作用,蛋白質(zhì)組在細(xì)胞器的分布情況決定其不同效應(yīng)的響應(yīng)。在酵母細(xì)胞器中,核糖體是蛋白質(zhì)合成的場(chǎng)所,線粒體是為細(xì)胞生長(zhǎng)提供能量的場(chǎng)所,各個(gè)細(xì)胞器上的膜是體內(nèi)傳遞信息的必經(jīng)通道。蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果不僅能反映外源脅迫時(shí)酵母生長(zhǎng)路徑的變化,還能更精細(xì)反映在受到外界脅迫時(shí)不同細(xì)胞器產(chǎn)生的響應(yīng)機(jī)制。核糖體蛋白、線粒體蛋白、膜蛋白等都對(duì)酵母的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生影響,因此Azizi等[30]采用新型S-BPS鑒定出釀酒酵母的3 043 種蛋白,能更全面地檢出膜蛋白、線粒體蛋白和核糖體蛋白,為后續(xù)探究在不同逆境下細(xì)胞器蛋白的變化提供可行性實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。Giardina等[81]以iTRAQ標(biāo)記質(zhì)譜技術(shù)對(duì)釀酒酵母進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析,表明糖酵解酶、糖異生酶和線粒體蛋白的下調(diào)會(huì)導(dǎo)致糖酵解、糖異生和線粒體功能的變化。酵母蛋白質(zhì)組不僅會(huì)對(duì)體內(nèi)的細(xì)胞器發(fā)生響應(yīng)性變化,一些研究人員還發(fā)現(xiàn)酵母為適應(yīng)匱乏的生長(zhǎng)條件會(huì)利用細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles,Evs)進(jìn)行細(xì)胞之間的蛋白質(zhì)運(yùn)輸。Winters等[82]對(duì)釀酒酵母蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行分析,在低葡萄糖條件下生長(zhǎng)的酵母細(xì)胞中鑒定了377 種與細(xì)胞內(nèi)囊泡簇(intracellular vesicle clusters,IVC)相關(guān)蛋白質(zhì),表明在低碳源的情況下Evs可作為蛋白質(zhì)的運(yùn)輸載體。
酵母與發(fā)酵食品風(fēng)味形成緊密相關(guān),研究酵母蛋白質(zhì)組學(xué)可探究發(fā)酵食品風(fēng)味形成機(jī)制。葡萄酒釀造過(guò)程有上百種酵母共同作用,不同配比均會(huì)使葡萄酒產(chǎn)生不同的香氣和風(fēng)味。García-Ríos等[83]對(duì)庫(kù)德里阿茲威酵母(S.kudriavzevii)、葡萄汁酵母(S.uvarum)和釀酒酵母進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)在低溫釀造葡萄酒時(shí)這三種酵母能更好地維持產(chǎn)品的風(fēng)味。啤酒釀造工藝中的蛋白質(zhì)組學(xué)源自于小麥和酵母的200多種獨(dú)特蛋白質(zhì)[84]。研究發(fā)現(xiàn)不同風(fēng)味的酒類發(fā)酵與酵母蛋白質(zhì)組學(xué)密切相關(guān),因此可以通過(guò)研究酵母的蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)而優(yōu)化啤酒釀造工藝。Kerr等[85]探究市售啤酒中蛋白質(zhì)差異與風(fēng)味之間的關(guān)系,通過(guò)蛋白質(zhì)組定量技術(shù)發(fā)現(xiàn)啤酒發(fā)酵中1 418 種特異性蛋白質(zhì)影響成品啤酒的口感和風(fēng)味。蛋白質(zhì)組學(xué)還能夠用于識(shí)別和測(cè)量糖蛋白及其特異性修飾位點(diǎn)。酵母細(xì)胞在起泡酒的釀造過(guò)程中發(fā)生的自溶會(huì)對(duì)起泡酒的感官質(zhì)量產(chǎn)生影響。Porras-Agüera等[86]對(duì)起泡酒進(jìn)行第二次的密封發(fā)酵及其陳釀期的釀酒酵母蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)其在CO2超壓條件下參與甘油合成的相關(guān)蛋白質(zhì)含量增加,但參與活性氧、乙醇、乙醛和乙酸等代謝物反應(yīng)過(guò)程中的蛋白質(zhì)含量降低。
隨著技術(shù)的發(fā)展和對(duì)環(huán)境的保護(hù),人造蛋白制品的應(yīng)用不斷增加。Humpen?der等[87]提出發(fā)酵微生物獲得蛋白可替代全球牛肉消耗的20%。其中最受關(guān)注的“人造肉”研制成為熱點(diǎn)。酵母蛋白作為一種新型的微生物蛋白資源,具有較好的加工性能,可規(guī)避豆類蛋白自身的豆腥味、過(guò)敏源及其限制性氨基酸缺乏等問(wèn)題。Duppala等[88]對(duì)可運(yùn)用在新型“人造肉”漢堡中的畢赤酵母進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)畢赤酵母是一種可以生產(chǎn)大量異源蛋白質(zhì)且自身含大量蛋白的優(yōu)良“人造肉”基礎(chǔ)原料。為增加素肉的觀感,通常利用酵母生產(chǎn)血紅蛋白使產(chǎn)品富有紅褐色的質(zhì)地。Reyes等[89]利用畢赤酵母為大豆植物肉提供血紅蛋白及其他蛋白質(zhì),經(jīng)過(guò)“自下而上”蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)該制品對(duì)人體無(wú)慢性致敏性和毒性風(fēng)險(xiǎn)。研究人員利用酵母基因編輯技術(shù)使重組血紅蛋白基因在酵母中高效表達(dá)。Ishchuk等[90]通過(guò)對(duì)釀酒酵母進(jìn)行ROX1、HMX1、VPS10和AHSP基因的組合改造,進(jìn)一步測(cè)定改造菌株的蛋白質(zhì)組從而優(yōu)化酵母血紅素密碼子,使其高產(chǎn)血紅蛋白,并可防止血紅蛋白的降解。酵母蛋白質(zhì)對(duì)植物肉質(zhì)替代品的優(yōu)化改良起到了有效作用,對(duì)其酵母蛋白質(zhì)組進(jìn)行測(cè)定,可實(shí)現(xiàn)對(duì)“人造肉”成分更加精準(zhǔn)的把控。
蛋白質(zhì)組學(xué)以揭示生命體的整個(gè)活動(dòng)規(guī)律為目的,主要用于闡明生命體蛋白質(zhì)的表達(dá)模式以及功能作用。近5 年來(lái)隨著研究的不斷深入,酵母蛋白質(zhì)組學(xué)不僅涉及定性分析,還進(jìn)一步拓展至精確的定量分析。蛋白質(zhì)組研究結(jié)果也呈現(xiàn)出由靜態(tài)描述轉(zhuǎn)變?yōu)閯?dòng)態(tài)描述的趨勢(shì)。這為蛋白質(zhì)組測(cè)定提出了更高要求,如高效低損耗的提取純化技術(shù)、快速的分離技術(shù)、高精度多維度的質(zhì)譜定量技術(shù)和全面的特定數(shù)據(jù)庫(kù)等。蛋白質(zhì)組學(xué)計(jì)量技術(shù)的進(jìn)步也必將推動(dòng)人們對(duì)酵母生理響應(yīng)機(jī)制、逆境耐受機(jī)理和微生物互作關(guān)系的理解,可助力于優(yōu)良食品加工用酵母的選育、食品發(fā)酵工藝的優(yōu)化、發(fā)酵食品品質(zhì)的提升、酵母合成生物學(xué)工作的開展等。