王思亓，梁曉云，張 晨，張文棟，程 宇，宓曉雨，趙王晨，王龍鳳，江 蕓*

（南京師范大學食品與制藥工程學院，江蘇 南京 210023）

近年來食源性腐敗菌和致病菌生物菌膜引起的食品安全問題受到國內(nèi)外學者廣泛關注。生物菌膜是指附著于各種物質(zhì)表面被細菌自產(chǎn)的胞外聚合物（extracellular polymeric substances，EPS）包裹的有一定三維結(jié)構(gòu)和功能的細菌群體[1-2]。據(jù)報道，生物菌膜中細菌對抗生素和化學試劑的抗性比浮游細菌高10～1 000 倍[3]。因此，食品加工環(huán)境中的生物菌膜已成為細菌交叉污染的重要來源，可導致嚴重的公共衛(wèi)生問題[4]。大腸桿菌和金黃色葡萄球菌是主要的食源性有害菌，因這兩種菌污染而引發(fā)的食物中毒事件時有發(fā)生[5-6]。大多數(shù)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌株都有形成生物菌膜的能力[7]。

近年來，控制生物菌膜已成為研究熱點[8-10]。其中，植物源天然抗菌物質(zhì)在抑制食源性有害菌生長增殖、有效延長食品貨架期方面已有大量報道。精油是從植物不同部位提取的復雜混合物，大部分具有廣譜抑菌作用[11-12]。然而，由于水溶性和生物利用度低、化學穩(wěn)定性差、揮發(fā)性高等問題，精油及其成分的實際應用受到較大限制[13]。為了保持其生物活性，減少其對食品感官特性的影響，將精油制備成納米乳液是一種可行的方式[14-15]。目前，精油納米乳抑菌方面的研究報道越來越多。葡萄柚籽提取物（grapefruit seed extract，GSE）已被證實具有較好的廣譜抗菌活性[16]，其抗菌活性主要來源于多酚類黃酮，如柚皮苷、檸檬苦素、槲皮素、山柰酚、橙皮苷及其他化合物[17-18]。GSE已被成功開發(fā)成多種形式的商品進入國內(nèi)外市場。本課題組前期以美國GSE濃縮口服液NutriBiotic產(chǎn)品為研究對象，制備成葡萄柚籽提取物納米乳（grapefruit seed extract nanoemulsion，GNE），有效提高了GSE抗菌活性[19]，而關于GNE對食源性有害菌生物菌膜抑制方面的研究尚鮮見報道。

本研究以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為實驗細菌，比較GSE和GNE對兩種菌生物菌膜形成的抑制效應，包括分析生物菌膜中黏附菌數(shù)變化、EPS含量變化，利用掃描電子顯微鏡（scanning electron microcopy，SEM）和共聚焦激光掃描顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CLSM）觀察生物菌膜微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。進一步比較GSE和GNE對兩種菌單種菌膜和混合菌膜的清除效果。從而為食源性有害菌生物菌膜的有效控制提供理論參考，為GSE在市場的推廣應用提供科學支撐。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

大腸桿菌為本實驗室前期從某企業(yè)豬肉屠宰線分離所得；金黃色葡萄球菌ATCC 25923（以下簡稱金葡菌）購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院。

胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptone soya agar，TSA）、酵母提取物（yeast extract，YE）、胰蛋白胨大豆肉湯（tryptic soy broth，TSB）、麥康凱瓊脂、Baird-Parker瓊脂 北京陸橋技術有限公司；LIVE/DEAD?BacLight Bacterial Viability Kits（L7012） 美國Molecular Probes公司；GSE（有效成分33%） 美國NutriBiotic公司；磷酸鹽緩沖液 南京峰昌生物科技有限公司；氯化鈉、乙醇 南京化學試劑有限公司；總蛋白定量檢測試劑盒南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

M2多功能酶標儀 美國Molecular Devices公司；SZX超凈工作臺 上海浦東躍欣儀器廠；LDZX-30FBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；SG403A Sterile GDRD生物安全柜 美國Baker公司；拍打式均質(zhì)器 青島眾瑞智能儀器有限公司；生化培養(yǎng)箱上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；QL-200微型漩渦混合儀海門其林貝爾儀器有限公司；SU8020 SEM 日本Hitachi公司；LSM880 CLSM 德國Carl Zeiss公司。

1.3 方法

1.3.1 菌液的制備

將－80 ℃凍存的大腸桿菌和金葡菌經(jīng)TSA-YE平板劃線，于37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取單菌落接種至TSB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩（220 r/min）培養(yǎng)18 h進行活化，2 次活化后的菌液濃度達到9（lg（CFU/mL））左右，菌落總數(shù)經(jīng)TSA培養(yǎng)計數(shù)驗證。

1.3.2 GNE的制備

GNE的制備參照Guo Mingming等[20]的方法稍作修改。將6.0%（以體系總質(zhì)量計，下同）GSE、2.2%中鏈甘油三酯、0.8%吐溫80和91.0%去離子水混合后用磁力攪拌器攪拌30 min以獲得粗乳液。然后將GSE粗乳液用均質(zhì)機以5 000 r/min高速均質(zhì)4 min。隨后，使用超聲波細胞破碎儀對粗乳液超聲處理（200 W、15 min）以獲得穩(wěn)定均勻、GSE終質(zhì)量分數(shù)為1.98%的納米乳液。

1.3.3 GSE和GNE對兩菌生物菌膜的干預實驗

前期實驗得出GNE對大腸桿菌和金葡菌的最小抑菌質(zhì)量分數(shù)（minimum inhibitory concentration，MIC）分別為1.2%、0.6%[19]，本實驗選用GNE濃度為1/2 MIC進行抑制菌膜形成實驗。用TSB將GSE和GNE母液分別稀釋成質(zhì)量分數(shù)為0.6%、0.3%的工作液，作為大腸桿菌和金葡菌生物菌膜形成的培養(yǎng)液，同時以正常TSB作為對照組。吸取1.3.1節(jié)的菌液，加入載有不銹鋼片（75 mm×25 mm×1 mm）和130 mL上述3 種培養(yǎng)液的玻璃盒中，菌液濃度約為6（lg（CFU/mL））。于37 ℃分別靜置培養(yǎng)24、48、72、120 h，規(guī)定時間取出鋼片，用無菌生理鹽水漂洗3 次以去除鋼片表面未黏附的游離菌體，分別進行以下指標分析。

1.3.3.1 生物菌膜中黏附菌數(shù)的測定

將載有生物菌膜的不銹鋼片放入裝有80 mL無菌生理鹽水的均質(zhì)袋中，采用拍擊-沖擊法采集鋼片表面的黏附菌體[21]，在8 擊/s條件下拍擊60 s，吸取均質(zhì)液進行梯度稀釋，涂布至TSA-YE平板中，37 ℃培養(yǎng)24 h后計數(shù)。

1.3.3.2 生物菌膜EPS中蛋白質(zhì)和多糖含量分析

菌膜分別培養(yǎng)24、72 h，取出鋼片漂洗后用棉球擦拭法采集生物菌膜[22]。將擦拭的棉球置于裝有10 mL無菌生理鹽水和一定量玻璃珠的離心管中，渦旋3 min，使棉球上的菌體充分脫落，去除棉球，然后將菌懸液離心（5 000×g、4 ℃、10 min）。獲得的上清液即為EPS樣本。用總蛋白定量檢測試劑盒測定蛋白質(zhì)含量。在562 nm波長處蛋白質(zhì)含量與溶液吸光度成正比，采用酶標儀測定A562nm，得到蛋白質(zhì)含量的標準曲線方程為：y＝0.000 8x＋0.159（R2＝0.997 6），根據(jù)標準曲線方程計算上清液中的胞外蛋白質(zhì)含量[23]。

采用苯酚-硫酸法測定胞外多糖含量。將各組的EPS樣本取2 mL至10 mL離心管中，加入1 mL體積分數(shù)6%苯酚溶液，混勻后逐滴加入5 mL體積分數(shù)95%硫酸溶液。將反應液置于室溫冷卻，避光孵育。孵育完成后在490 nm波長處測定其OD值。采用葡萄糖作為標準品繪制標準曲線，得到多糖含量的標準曲線方程為：y＝16.669x＋0.178 4（R2＝0.998），最后根據(jù)標準曲線方程計算得出EPS中多糖的含量[23]。

1.3.3.3 生物菌膜SEM觀察

按照1.3.3節(jié)的方法在3 種培養(yǎng)液中制備生物菌膜，其中不銹鋼片為10 mm×10 mm×1 mm。分別在24、72 h時取出不銹鋼片，生理鹽水漂洗后將黏附生物菌膜的鋼片放入體積分數(shù)2.5%戊二醛溶液中，在4 ℃下固定過夜，隨后加入體積分數(shù)1%鋨酸溶液固定2 h，最后用滅菌水沖洗3 次。將固定好的樣品用乙醇梯度脫水15 min并干燥，用于SEM觀察。

1.3.3.4 生物菌膜CLSM觀察

按照1.3.3節(jié)的方法制備生物菌膜，在24、72 h取出不銹鋼片，漂洗后吸取LIVE/DEAD?熒光染液對不銹鋼片表面進行染色，室溫避光條件下充分作用15 min后，用無菌蒸餾水充分洗滌不銹鋼片以除去多余熒光染料，室溫避光條件下放置自然干燥，使用CLSM（10×）觀察染色后的生物菌膜結(jié)構(gòu)。LIVE/DEAD?為由核酸染料SYTO 9和碘化丙啶（propidium iodide，PI）復配的熒光染料，SYTO-9與PI能分別使活、死細胞在CLSM下呈現(xiàn)綠色、紅色熒光，其中SYTO 9激發(fā)波長和吸收波長分別為480 nm和500 nm，PI激發(fā)波長和吸收波長分別為490 nm和635 nm。三維投影使用ZEN Blue Lite 2_3軟件的z-stacks簡易3D功能重建。

1.3.4 GSE和GNE對單種菌膜和混合菌膜的清除實驗

1.3.4.1 選擇性培養(yǎng)計數(shù)平板的確定

為了對混合菌膜中大腸桿菌和金葡菌分別計數(shù)，首先需要確定合適的選擇性平板。將1.3.1節(jié)大腸桿菌和金葡菌的培養(yǎng)菌液進行梯度稀釋，選取合適的稀釋度分別涂布在麥康凱瓊脂平板和Baird-Parker瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察細菌生長情況進行驗證。

1.3.4.2 大腸桿菌和金葡菌單種菌膜和混合菌膜的制備

將1.3.1節(jié)大腸桿菌和金葡菌的培養(yǎng)菌液單獨或同時接種至裝有不銹鋼片（75 mm×25 mm×1 mm）和TSB的玻璃盒中，其中兩種菌濃度均為6（lg（CFU/mL）），37 ℃靜置培養(yǎng)72 h，取出鋼片，漂洗后用1.3.4.1節(jié)確定的選擇性平板37 ℃培養(yǎng)24 h，對兩種菌分別進行培養(yǎng)計數(shù)。

1.3.4.3 GSE和GNE處理單種菌膜和混合菌膜

將1.3.4.2節(jié)得到的載有菌膜的不銹鋼片，漂洗后分別放入由生理鹽水配制的質(zhì)量分數(shù)為1.2%和1.8%的GSE、GNE溶液中37 ℃處理24 h，以生理鹽水37 ℃處理24 h為對照。處理結(jié)束后取出不銹鋼片，漂洗后按照1.3.3.1節(jié)方法進行均質(zhì)，吸取均質(zhì)液進行梯度稀釋，采用1.3.4.1節(jié)確定的選擇性平板分別對菌膜中大腸桿菌和金葡菌黏附菌數(shù)進行培養(yǎng)計數(shù)，37 ℃培養(yǎng)24 h。按下式進一步計算清除率。

式中：A為GSE、GNE 處理組生物菌膜中黏附菌數(shù)/（CFU/mL）；B為生理鹽水對照組生物菌膜中黏附菌數(shù)/（CFU/mL）。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Origin 2021b軟件繪圖。數(shù)據(jù)處理應用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用Duncan’s單因素方差分析進行多重比較，采用T檢驗進行兩組之間顯著性比較（以P＜0.05表示差異顯著）。實驗重復3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 GSE和GNE對兩菌生物菌膜形成時黏附菌數(shù)的影響

GSE和GNE處理后大腸桿菌和金葡菌生物菌膜中黏附菌數(shù)的變化情況如圖1所示。大腸桿菌和金葡菌經(jīng)37 ℃、24 h培養(yǎng)后，對照組生長到7～8（lg（CFU/cm2））。經(jīng)0.6%的GSE、GNE處理后，大腸桿菌生物菌膜中黏附菌數(shù)對數(shù)值比對照組減少1～2（lg（CFU/cm2）），且隨著作用時間的延長，GNE 的抑制活性強于GSE，120 h時大腸桿菌黏附菌數(shù)對數(shù)值比GSE組少0.9（lg（CFU/cm2））。GSE和GNE對金葡菌生物菌膜表現(xiàn)出更強的抑制作用，隨著GSE和GNE作用時間的延長，抗金葡菌生物菌膜作用明顯增強，且相同質(zhì)量分數(shù)的GNE抑制效果亦強于GSE，120 h時金葡菌黏附菌數(shù)對數(shù)值比GSE組少0.6（lg（CFU/cm2））。結(jié)果表明，GSE和GNE在1/2 MIC下能有效抑制兩菌生物菌膜的形成，且對金葡菌的抑制作用更強。

圖1 生物菌膜形成過程中黏附菌數(shù)變化Fig.1 Changes in the number of adherent cells during biofilm formation

2.2 生物菌膜中胞外蛋白質(zhì)和多糖含量的變化

GSE和GNE處理下大腸桿菌和金葡菌生物菌膜中胞外蛋白質(zhì)、胞外多糖含量變化如圖2、3所示。24 h時，3 個處理組之間大腸桿菌胞外蛋白質(zhì)、胞外多糖含量均無顯著性差異，表明菌膜形成24 h時GSE、GNE對大腸桿菌胞外蛋白質(zhì)、胞外多糖產(chǎn)生的影響無顯著差異；而24 h時3 個處理之間金葡菌胞外蛋白質(zhì)、胞外多糖含量存在顯著差異（P＜0.05），表明菌膜形成24 h時GSE、GNE顯著抑制了金葡菌胞外蛋白質(zhì)、胞外多糖的產(chǎn)生，且GNE抑制效果顯著強于GSE。72 h時，3 個處理之間兩種菌蛋白質(zhì)、胞外多糖含量均存在顯著差異（P＜0.05），表明菌膜形成72 h時GSE、GNE顯著抑制了大腸桿菌和金葡菌胞外蛋白質(zhì)和多糖的產(chǎn)生，且GNE抑制效果顯著強于GSE。GSE、GNE處理組菌膜形成72 h時胞外蛋白質(zhì)和多糖含量顯著高于24 h時（P＜0.05）。

圖2 生物菌膜中胞外蛋白質(zhì)含量變化Fig.2 Changes in the amount of extracellular proteins in biofilm

圖3 生物菌膜中胞外多糖含量變化Fig.3 Changes in the amount of extracellular polysaccharides in biofilm

2.3 大腸桿菌和金葡菌生物菌膜SEM觀察結(jié)果

采用SEM 觀察大腸桿菌和金葡菌在TSB、1/2 MIC GSE和GNE分別培養(yǎng)24 h和72 h時生物菌膜的微觀結(jié)構(gòu)，如圖4A所示，大腸桿菌于TSB培養(yǎng)24 h時形成三維結(jié)構(gòu)，堆疊產(chǎn)生了較為疏松的生物菌膜，在菌體外有少量黏液產(chǎn)生；培養(yǎng)72 h時形成致密的三維結(jié)構(gòu)，菌體周圍有較厚的黏液層包裹。72 h時GSE組和GNE組菌體的團聚及黏液分泌情況要多于24 h時，但均明顯少于TSB對照組，表明GSE和GNE抑制了大腸桿菌生物菌膜微觀結(jié)構(gòu)的形成及EPS的產(chǎn)生，且GNE抑制作用強于GSE。由圖4B可知，與大腸桿菌類似，GSE和GNE也抑制了金葡菌生物菌膜微觀結(jié)構(gòu)的形成及EPS的產(chǎn)生。SEM觀察結(jié)果與2.1節(jié)黏附菌菌數(shù)變化結(jié)果趨勢一致，且印證了2.2節(jié)GSE和GNE對EPS的抑制作用。

圖4 大腸桿菌和金葡菌生物菌膜SEM圖（×5 000）Fig.4 SEM images of bioflims formed by E.coli and S.aureus (×5 000)

2.4 大腸桿菌和金葡菌生物菌膜CLSM觀察結(jié)果

采用CLSM 觀察大腸桿菌和金葡菌在TSB、1/2 MIC GSE和1/2 MIC GNE條件下培養(yǎng)24 h和72 h時生物菌膜中活/死菌的分布情況。如圖5所示，大腸桿菌培養(yǎng)24 h時，對照組中大量菌體黏附于鋼片表面，有少量小的細菌“團狀物”出現(xiàn)，而GSE和GNE組鋼片表面黏附菌體少于對照組，并且有較多紅色死菌分布其中。培養(yǎng)72 h時，3 組菌膜厚度與24 h相比均有所增加，對照組中黏附菌體更多，并形成了聚集的立體結(jié)構(gòu)；GSE和GNE組紅色死菌更多。金葡菌與大腸桿菌類似，對照組菌體的聚集方式由小型團狀物變?yōu)橹旅艿牧Ⅲw結(jié)構(gòu)。從24 h到72 h，GSE和GNE組的菌膜厚度有所增加，但相比于對照組，菌膜結(jié)構(gòu)中疏松紅色區(qū)域明顯增加，這表明GSE和GNE都具有抑制生物菌膜形成的能力。

圖5 大腸桿菌和金葡菌生物菌膜CLSM圖（×10）Fig.5 CLSM images of biofilms formed by E.coli and S.aureus (×10)

2.5 大腸桿菌和金葡菌混合菌膜形成情況

為了對混合菌膜中兩種菌分別進行計數(shù)，首先確定了兩種菌的選擇性計數(shù)平板。如圖6所示，大腸桿菌在麥康凱瓊脂平板上生長良好，而在Baird-Parker瓊脂平板上不生長，金葡菌則相反，表明可以采用麥康凱瓊脂平板、Baird-Parker平板分別作為混合菌膜中大腸桿菌、金葡菌的計數(shù)平板。

圖6 大腸桿菌和金葡菌混合培養(yǎng)計數(shù)培養(yǎng)基的確定Fig.6 Determination of media for enumeration of mixed culture of E.coli and S.aureus

大腸桿菌和金葡菌在TSB中37 ℃、72 h單種菌膜和混合菌膜形成情況見圖7。大腸桿菌與金葡菌混合成膜時，混合菌膜中大腸桿菌與其單種菌膜形成量沒有顯著性差異，而混合菌膜中金葡菌的菌膜量顯著少于其單種菌膜形成量（P＜0.05）。

圖7 大腸桿菌和金葡菌混合菌膜形成72 h時黏附菌數(shù)Fig.7 Number of adherent cells in mixed biofilms formed by E.coli and S.aureus at 72 h

2.6 GSE和GNE對兩菌單種菌膜和混合菌膜清除作用

將大腸桿菌和金葡菌培養(yǎng)72 h的單種菌膜和混合菌膜分別于生理鹽水、GSE、GNE中處理24 h，結(jié)果如圖8所示。大腸桿菌單種菌膜能夠被GSE、GNE顯著清除，其中質(zhì)量分數(shù)1.2%時GSE、GNE清除作用無顯著差異，而質(zhì)量分數(shù)1.8%時GNE清除作用顯著強于GSE（P＜0.05），清除率增加27.2%。金葡菌單種菌膜亦能被GSE、GNE顯著清除，且質(zhì)量分數(shù)越高清除作用越強，兩種質(zhì)量分數(shù)下GNE清除作用均顯著強于GSE（P＜0.05），質(zhì)量分數(shù)1.8%時GNE比GSE清除率高7.7%。相同質(zhì)量分數(shù)的GSE、GNE對金葡菌的清除作用強于對大腸桿菌的清除作用?；旌暇ぶ写竽c桿菌和金葡菌也能被GSE、GNE顯著清除，其中混合菌膜中大腸桿菌在質(zhì)量分數(shù)1.8%時GNE清除作用強于GSE，清除率增加13.2%，混合菌膜中金葡菌在1.2%、1.8%兩種質(zhì)量分數(shù)下GNE清除作用均顯著強于GSE（P＜0.05），清除率分別增加9.7%、14.3%。通過清除率比較GSE、GNE對單種菌膜和混合菌膜的清除作用，發(fā)現(xiàn)對混合菌膜中大腸桿菌和金葡菌的清除作用均弱于對單種菌膜的清除作用，1.8%的GNE 對混合菌膜中大腸桿菌、金葡菌的清除率分別比對兩菌單種菌膜清除率低14.9%和6.2%。結(jié)果表明混合菌膜中兩種菌對GSE、GNE抗性增強。

圖8 GSE和GNE對單種菌膜和混合菌膜清除作用Fig.8 Effects of GSE and GNE on eliminating single and mixedspecies biofilms

3 討論

精油是天然衍生的芳香化合物，大部分精油具有強烈的抗菌、抗病毒和抗真菌活性，其作為天然抗菌劑在食品保鮮應用研究方面被廣泛報道[12,16,24]。關于精油抑制生物菌膜方面的報道也越來越多。研究發(fā)現(xiàn)，佛手精油可有效抑制單核細胞增生李斯特菌生物菌膜形成[25]。地中海地區(qū)不同種類植物精油均可抑制銅綠假單胞菌生物菌膜的形成[26]。夾竹桃精油、薄荷和茴香精油均可抑制大腸桿菌生物菌膜的形成，抑制能力依次減弱[27]。薄荷精油、百里香酚、牛至精油等可有效抑制金葡菌生物菌膜的形成[28-30]。本研究發(fā)現(xiàn)GSE對大腸桿菌和金葡菌生物菌膜、EPS形成具有抑制作用，而且1/2 MIC對金葡菌生物菌膜形成抑制效果強于大腸桿菌，這可能是由于革蘭氏陰性細菌外膜的特征結(jié)構(gòu)，使其對親脂性分子更具抗性[31]。本實驗還發(fā)現(xiàn)，GSE對兩種菌成熟菌膜具有較好清除效果。Song等[32]也發(fā)現(xiàn)GSE在抑制菌膜形成和已形成菌膜清除方面有積極效果。

但是，GSE存在水溶性低、生物活性低、有苦味等問題，使其實際應用受到限制。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，將GSE制備成GNE改善了其水溶性，制備成的GNE是O/W型乳液，納米尺寸的液滴比表面積大，提高了有效成分的生物活性；此外，GNE對細菌細胞壁、細胞膜的破壞作用增強，細胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸滲漏加劇，相比于GSE表現(xiàn)出更強的抑菌作用[19]。佛手柑精油納米乳對金葡菌的MIC為0.38%[33]，甜橙精油納米乳液對大腸桿菌的MIC介于7.7%～11.0%之間；對金葡菌的MIC約為11%[34]。本課題組制備的GNE對大腸桿菌和金葡菌的MIC分別為1.2%和0.6%，抑菌性能較強[19]。近年來，逐漸出現(xiàn)精油納米乳液抑制生物菌膜方面的報道。Moghimi等[35]關于百里香精油及其納米乳對耐多藥鮑曼不動桿菌菌膜的抑制實驗結(jié)果顯示，乳液處理24 h時抗菌膜效果比相應精油高36%。Prakash等[36]研究發(fā)現(xiàn)檸檬草精油納米乳液抗鼠傷寒沙門氏菌生物菌膜活性比相應精油高11.61%。本研究也得到類似結(jié)論，GNE可以有效抑制大腸桿菌和金葡菌生物菌膜的形成，并且作用效果強于GSE，1/2 MIC GNE作用120 h時兩菌菌膜形成量對數(shù)值均比GSE組少0.6（lg（CFU/cm2））以上，1.8%的GNE對已形成的大腸桿菌和金葡菌菌膜清除率分別比GSE高7.7%～27.2%。本研究采用SEM和CLSM也觀察到了GSE和GNE對生物菌膜的抑制效果，與菌膜計數(shù)分析結(jié)果相印證。本研究還發(fā)現(xiàn)GSE和GNE減少了生物菌膜胞外蛋白質(zhì)和多糖含量，這與Amrutha等[37]關于香辛料油納米乳、Wang Renjie等[38]關于D-檸檬烯納米乳減少EPS產(chǎn)生的研究結(jié)論類似。

自然環(huán)境中絕大多數(shù)菌膜都是多菌種混合生物菌膜，混合生物菌膜中不同菌種之間可呈現(xiàn)協(xié)同、拮抗等不同相互作用。有研究發(fā)現(xiàn)糞腸球菌、銅綠假單胞菌等會促進大腸桿菌的菌膜形成[39-40]。另一些研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌可抑制銅綠假單胞菌、成團泛菌生物菌膜的形成，但對沙拉廠分離株的菌膜形成沒有影響[41]。本研究中，大腸桿菌與金葡菌混合成膜時，大腸桿菌未受影響，而大腸桿菌對金葡菌菌膜形成產(chǎn)生了抑制作用，這與Manoharadas[42]、Ohn[43]等的研究結(jié)論相似。多菌種混合成膜時發(fā)生的不同交互效應可能與不同菌種、不同菌株、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基質(zhì)等多種因素有關。

目前，對精油和納米乳清除混合菌膜方面的報道尚有限[44]。本研究中，GSE和GNE對已經(jīng)形成的混合菌膜表現(xiàn)出良好的清除效果。但是，混合菌膜表現(xiàn)出更強的抗性，在相同質(zhì)量分數(shù)下GSE和GNE對其清除率均低于對單種菌膜。Zhang Hongfei等[45]采用低能X射線清除單核細胞增生李斯特菌與熒光假單胞菌的混合菌膜時也發(fā)現(xiàn)，相比于單種菌膜，混合菌膜抗性更強。Reigada等[46]在用萬古霉素清除銅綠假單胞菌和金葡菌形成的混合生物菌膜時也發(fā)現(xiàn)混合生物菌膜比單種菌膜更難清除的現(xiàn)象。實際生產(chǎn)加工中，食品加工接觸表面形成的生物菌膜大多是由多種細菌組成的混合菌膜，因此需要更加關注混合菌膜抗性增強后的食品安全風險評估和控制。

GNE比化學消毒劑安全性高，比柚皮素、百里香酚等單一成分抗菌劑價格低廉，并且本實驗證實GNE具有較高的生物活性、較強的菌膜抑制能力。近年來，納米乳液在食品保鮮方面的應用也有研究報道。Radi等[47]制備橙皮精油納米乳并對鮮切橙片進行涂膜處理，結(jié)果表明橙皮精油納米乳能夠發(fā)揮有效的保鮮作用。吳玲艷[48]制備的非嗎啉納米乳涂膜劑能有效保證甘薯的品質(zhì)，延長貨架期。雷凱[49]制備了香芹酚納米乳-羧甲基殼聚糖復合食品包裝膜并用于小麥面包貯藏，結(jié)果表明，小麥面包保質(zhì)期隨香芹酚濃度的增加而延遲，最長可達7 d。因此，將GNE應用于果蔬的涂膜保鮮，或加入可降解材料制備成保鮮膜用于食品包裝貯藏等具有廣闊的應用前景。

4 結(jié)論

有害菌的生物菌膜給食品安全性帶來了嚴重危害，本實驗結(jié)合食品加工實際環(huán)境探究天然綠色產(chǎn)品GSE和具有更高生物活性及穩(wěn)定性的GNE對大腸桿菌和金葡菌生物菌膜的抑制作用。GSE和GNE在低質(zhì)量分數(shù)下均可以抑制大腸桿菌和金葡菌生物菌膜的形成，并且可以減少胞外蛋白質(zhì)和多糖的分泌，SEM和CLSM微觀形態(tài)觀察也得到一致的結(jié)論。生物菌膜的培養(yǎng)計數(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種菌混合成膜時，金葡菌的菌膜形成受到大腸桿菌顯著抑制。對已形成的生物菌膜進行清除實驗，發(fā)現(xiàn)GSE和GNE也表現(xiàn)出積極的作用，且對金葡菌菌膜的清除作用更強。但是，相比于單種菌膜，混合菌膜表現(xiàn)出更強的抗性，1.8%的GNE對混合菌膜中大腸桿菌、金葡菌的清除率分別比對兩菌單種菌膜清除率低14.9%和6.2%。這一結(jié)論提示有害菌混合生物菌膜抗性更強，可能會帶來更嚴重的食品安全風險。比較GSE和GNE發(fā)現(xiàn)，GNE抑制菌膜形成及清除菌膜均強于GSE，1/2 MIC GNE作用120 h時兩菌菌膜形成量對數(shù)值均比GSE組少0.6（lg（CFU/cm2））以上，1.8%的GNE對已形成的單種菌膜和混合菌膜的清除率比GSE高7.7%～27.2%。本研究可為GSE和GNE在生物菌膜控制方面的推廣應用提供一定的科學依據(jù)。