張秀敏，周增超，喬晉麗，王昌祿，王玉玲，歐行奇,*，郭慶彬,*

（1.天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457；2.河南科技學院生命科技學院，河南 新鄉(xiāng) 453003）

小麥是我國的主要農作物之一，麥麩是小麥加工的重要副產物，含有蛋白質、碳水化合物、維生素和礦物質等多種營養(yǎng)成分。碳水化合物包括非淀粉多糖和淀粉多糖兩種形式，非淀粉多糖約占46%，其中含有約70%的阿拉伯木聚糖（arabinoxylan，AX）[1]。AX作為一種重要的膳食纖維，具有良好的抗氧化性能，這可能是因為氧自由基會進攻生物膜脂質、酶、蛋白質等重要生物大分子，加速機體衰老，造成機體的損傷和病變，而AX能夠清除活性氧自由基，從而提高機體的免疫功能；且具有不同分子質量、分支結構及單糖比例的AX對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、羥自由基（·OH）的清除作用、還原力等抗氧化效果不同[2-3]。

目前，AX主要通過堿提法獲取，但堿提取易破壞阿魏酸等官能團[4]，阿魏酸等多酚可提高AX的抗氧化性[5]，此外，堿提法對環(huán)境污染大。酶法提取技術具有條件溫和、綠色無污染、有效保留多酚等優(yōu)點，因此，可用酶制劑替代堿液制備具有較高多酚含量的AX。木聚糖酶作為細胞壁物質的分解酶，可破壞小麥細胞壁結構，使其降解，從而釋放AX；此外，木聚糖酶可以任意攻擊AX主鏈，能夠將水不可提取的AX變得可溶和可提取[4]；纖維素酶能夠消化細胞壁β-葡聚糖并打破AX與β-葡聚糖之間的非共價鍵從而釋放AX[6]。但酶提法存在酶解產物復雜、分離純化困難等問題。超聲作為一種輔助提取方法，與酶法提取聯用可以提高AX的得率和純度。

前人研究發(fā)現，不同品種原料來源的多糖結構特征存在差異，例如，甜型和酸型兩種不同品種的羅望子果肉多糖的單糖比例不同[7]，不同品種蘋果原料中果膠的單糖比例及中性糖比率（鼠李糖（rhamnose，Rha）與半乳糖醛酸（galacturonic acid，GalA）含量的比值）存在一定的差異[8]。研究表明，不同小麥品種中AX的結構特征不同，制作的面包品質也參差不齊[9-10]。此外，不同的提取方法會影響AX的得率、純度、取代度以及分子質量[1]。據報道，不同提取方法能夠顯著影響血紅鉚釘菇多糖的單糖組成、分子質量、三螺旋構象及形貌[11]。另外，多糖的提取方法不同會導致其抗氧化性存在差異。例如，熱水浸提法、酶解提取法及超聲波復合酶法等不同提取方法會對玉木耳多糖[12]、百合多糖[13]、大球蓋菇粗多糖[14]、手掌參多糖[15]的抗氧化活性產生不同影響，這可能是不同提取方式造成多糖分子的單糖組成及糖苷鍵型等結構特征不同[13]，也可能與多糖結合多酚含量的不同有關[6]。

總之，雖然目前有關多糖抗氧化性的研究較多，但是多糖具有良好抗氧化性的原因是基于多糖本身還是與多糖相連的酚類化合物尚不明確；且有關不同品種麥麩中AX分子結構的比較以及不同提取方式對AX分子結構和抗氧化性的影響也鮮有報道?；诖?，本實驗利用堿提、超聲輔助木聚糖酶提和超聲輔助纖維素酶提3 種方法提取得到AX，對比分析不同提取方法所得AX的抗氧化性能，此外，為了建立AX功能及應用的分子基礎，本實驗進一步研究麥麩品種與提取方式對AX結構的影響，旨在為麥麩的高值化應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥麩皮（品種分別為‘百農207’‘百旱207’‘冠麥1號’‘華育198’和‘華育166’）購于河南中普麥業(yè)有限公司。

木聚糖酶（≥2 500 U/g）、Rha、阿拉伯糖（arabinose，Ara）、木糖（xylose，Xyl）、甘露糖（mannose，Man）、葡萄糖（glucose，Glc）、半乳糖（galactose，Gal）、2,2’-聯氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）工作液（均為優(yōu)級純） 美國西格瑪奧德里齊公司；纖維素酶（10 000 U/g） 北京羅恩試劑有限公司；熱穩(wěn)定α-淀粉酶（800 U/g）、淀粉轉葡萄糖苷酶（100 U/mL） 上海源葉生物科技有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、透析袋 北京索萊寶科技有限公司；重水（D2O） 薩恩化學技術（上海）有限公司；福林-酚 天津市江天化工試劑公司；過氧化氫為國產色譜純；其他化學試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

示差高效液相色譜儀 日本島津公司；IS50傅里葉變換紅外光譜儀 美國尼高利公司；6890N氣相色譜-質譜聯用儀 美國安捷倫科技有限公司；AVANCE NEO核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）光譜儀布魯克（北京）科技有限公司；BioSpinQ50熱重分析儀 美國TA公司；Infinite 200 PRO酶標儀瑞士Tecan公司；VS-12W氮吹儀 無錫沃信儀器制造有限公司；SB-2512-DTD超聲清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司；PB-10型pH計 德國賽多利斯公司；FD-10型真空冷凍干燥機 北京德天佑科技發(fā)展有限公司；RE-2000型旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；PIVC2-25plus真空濃縮儀 德國Christ公司；磁力攪拌器美國賽默飛有限公司；LDP-200型高速多功能粉碎機浙江永康市紅太陽機電有限公司；DH-104BS型電熱恒溫鼓風干燥箱 天津市中環(huán)實驗電爐有限公司；LD-10高速大容量冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；Quintix1250-1CN精密天平 美國奧豪斯儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 AX提取工藝

采用堿提、超聲輔助木聚糖酶提和超聲輔助纖維素酶提3 種方法從小麥麩皮中提取AX[16-17]。所得樣品分別命名為AX-堿、AX-木及AX-纖。

小麥麩皮的預處理：小麥麩皮粉碎后過60 目篩，以料液比1∶10加入去離子水溶解，加入2%（以體系體積計，后同）的耐高溫α-淀粉酶（800 U/g），90 ℃持續(xù)攪拌3 h，冷卻至室溫后加入1%的淀粉轉葡萄糖苷酶（100 U/mL），55 ℃持續(xù)攪拌24 h，煮沸滅酶。離心后沉淀用去離子水沖洗兩次，60 ℃過夜烘干。

AX的兩種提取方式：堿提法：以料液比1∶10加入0.5 mol/L NaOH溶液，室溫攪拌提取24 h；酶提法：在酶添加量（木聚糖酶（≥2 500 U/g）、纖維素酶（10 000 U/g）為5 g/L、溫度為40 ℃的條件下超聲處理90 min，隨后煮沸滅酶。

提取完成后，離心去沉淀，用4 mol/L鹽酸溶液調節(jié)pH值為4.0，離心去蛋白，以2 倍（堿提）/4 倍（酶提）體積乙醇醇沉，離心得到粗多糖。用去離子水復溶，離心，透析（堿提樣品透析袋截留分子質量：8 000～14 000 Da；酶提樣品透析袋截留分子質量：3 500 Da）72 h，每8 h換一次水，離心，濃縮凍干。

AX提取得率按式（1）計算。

1.3.2 AX化學組成分析

以Glc為標準品，采用苯酚硫酸法測定中性糖質量分數[18]。以GalA為標準品，采用間羥基聯苯法測定糖醛酸質量分數[19]。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白質量分數。以沒食子酸為標準品，采用福林-酚法測定總酚質量分數[20]。

1.3.3 AX結構表征

1.3.3.1 分子質量的測定

采用高效凝膠排阻色譜法測定AX分子質量[21]。以不同分子質量的葡聚糖為標準品，采用配備有超水凝膠線性柱（7.8 mm×300 mm，10 μm）和折射率檢測器的高效液相色譜儀測定AX的分子質量。實驗條件：流動相為0.1 mol/L NaNO3溶液，檢測溫度為40 ℃，流速為0.6 mL/min，采用ASTRA軟件采集和分析數據。

1.3.3.2 傅里葉變換紅外光譜分析

采用KBr壓片法處理樣品，利用IS50傅里葉變換紅外光譜儀檢測其紅外吸收光譜[22]。準確稱取1.0 mg AX和干燥的150.0 mg KBr粉末混合、研磨均勻、壓片，在4 000～400 cm－1范圍內記錄紅外光譜。

1.3.3.3 單糖組成分析

采用部分降解結合氣相色譜儀進行單糖組成分析[23]。

酸水解AX樣品的制備：將2 mg AX溶于0.5 mL 2 mol/L的三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）溶液中，在120 ℃下水解2 h，用真空冷凍濃縮儀蒸發(fā)水解產物至干。加入0.5 mL甲醇，再次蒸干，重復3 次除去多余的酸。

糖腈乙酸酯衍生物的制備：向酸水解、蒸干后的AX樣品中加入0.3 mg肌醇（內標）、0.5 mL吡啶和5 mg鹽酸羥胺，封口，90 ℃水浴30 min，冷卻至室溫，加入0.5 mL乙酸酐，90 ℃水浴30 min，冷卻后過0.22 μm濾膜，用于氣相色譜分析。

糖腈乙酸酯衍生物的檢測：采用配備有19091S-433色譜柱（30.0 m×0.25 mm，0.25 μm）的氣相色譜儀進行分析。氣相色譜條件：流速為1.0 mL/min，進樣口溫度為250 ℃，檢測器溫度為280 ℃，進樣體積為1.0 μL，氦氣、氫氣和空氣流速分別為25、30、400 mL/min。

取等量各標準單糖（Rha、Ara、Xyl、Man、Glc、Gal），經糖腈乙酸酯衍生化后以同樣條件進行氣相色譜分析。

1.3.3.4 糖苷鍵連接方式分析

采用部分降解結合氣相色譜-質譜聯用儀進行甲基化分析[24]。將3.0 mg AX 80 ℃烘干后溶于0.5 mL二甲基亞砜，加入干燥后的20.0 mg NaOH粉末攪拌2 h，加入0.5 mL碘甲烷攪拌5 h，直至甲基化完全。用二氯甲烷重復萃取3 次，過無水硫酸鈉柱，N2吹干，得到甲基化樣品。在完全甲基化的樣品中加入0.5 mL 4 mol/L TFA溶液，100 ℃水解6 h。冷卻、N2吹干。之后加入0.3 mL去離子水、1 滴體積分數5%氨水和3.0 mg硼氘化鈉，室溫攪拌12 h。反應完全后N2吹干，加入0.5 mL含體積分數5%醋酸的甲醇混合液，N2吹干，重復3 次，加入乙酸酐水浴2 h，N2吹干，最后用二氯甲烷復溶，過0.22 μm濾膜備用。使用6890N氣相色譜-質譜聯用儀分析樣品糖苷鍵連接方式。

1.3.3.5 AX1H NMR分析

AX在D2O中60 ℃溶解，隨后凍干，重復3 次。再將多糖溶于D2O（30 mg/mL）中，利用600 MHz NMR光譜儀對樣品進行檢測，獲得一維核磁共振氫譜圖（1H NMR）[25]。1H NMR的數據采集參數為：脈沖程序zg30、時間10.14 min、掃描次數8、循環(huán)延遲1 s。

1.3.4 AX熱穩(wěn)定性分析

AX的熱穩(wěn)定性使用熱重分析儀進行分析[16]。在熱重分析中，根據時間和溫度的函數，分析經過加熱的AX剩余固體質量。其中氮氣（99.99%）為載氣，流速為30 mL/min；檢測溫度從25 ℃升到600 ℃，升溫速率為10 ℃/min（采用的麩皮品種為‘百農207’）。

1.3.5 AX抗氧化性分析

參照Ye Zipeng等[26]的方法并作修改。將通過‘百農207’提取的AX配成0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL和5.0 mg/mL的水溶液，以VC作為陽性對照，蒸餾水作為空白對照，采用以下指標評價AX的抗氧化性。

總抗氧化能力：采用ABTS陽離子自由基清除法測定AX的總抗氧化能力。將20 μL AX溶液和200 μL ABTS工作液混合均勻，于25 ℃黑暗條件下反應1 h，在734 nm波長處測定吸光度。按式（2）計算總抗氧化能力。

式中：A0為空白對照組的吸光度；A1為AX待測液組或陽性對照組的吸光度；A2為磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L，pH 7.2～7.4）代替ABTS溶液作為試劑空白的吸光度。

還原力：將50 μL AX溶液、50 μL 0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.2～7.4）和50 μL質量分數為1%的鐵氰化鉀溶液混合均勻，于50 ℃反應20 min，冰浴冷卻5 min，再加50 μL質量分數為10%的三氯乙酸和30 μL質量分數為0.1%的三氯化鐵溶液，在700 nm波長處測定吸光度。按式（3）計算還原力。

式中：A0為空白對照組的吸光度；A1為AX待測液組或陽性對照組的吸光度。

DPPH自由基清除率：將50 μL AX溶液和200 μL 0.4 mmol/L DPPH溶液混合均勻，于25 ℃黑暗條件下反應30 min，在517 nm波長處測定吸光度。按式（4）計算DPPH自由基清除率。

式中：A0為空白對照組的吸光度；A1為AX待測液組或陽性對照組的吸光度；A2為甲醇代替DPPH溶液作為試劑空白的吸光度。

式中：A0為空白對照組的吸光度；A1為AX待測液組或陽性對照組的吸光度；A2為Tris-HCl溶液代替鄰苯三酚溶液作為試劑空白的吸光度。

·OH清除率：將50 μL AX待測液和50 μL 9 mmol/L硫酸亞鐵溶液、50 μL 9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液混合均勻，加入50 μL 8.8 mmol/L過氧化氫溶液啟動反應，于37 ℃反應1 h，在510 nm波長處測定溶液的吸光度。按式（6）計算·OH清除率。

式中：A0為空白對照組的吸光度；A1為AX待測液組或陽性對照組的吸光度；A2為水楊酸-乙醇溶液代替硫酸亞鐵溶液作為試劑空白的吸光度。

1.4 數據處理與分析

所有實驗均重復3 次，結果用平均值±標準差表示。運用SPSS軟件進行單因素方差分析，P＜0.05表示差異顯著，結果具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 AX化學組成分析結果

利用不同方法從不同品種麩皮中提取得到的AX得率及化學組成測定結果如表1所示。本實驗所用提取方法主要獲得水不可提取性AX，在除淀粉的過程中除去了水可提取性AX[16]，因此AX的得率低于其他報道[4]。相比于酶提法（超聲輔助木聚糖酶提法得率：1.24%；超聲輔助纖維素酶提法得率：0.21%），堿提法AX得率更高（3%左右），這可能是由于稀堿溶液中的羥基離子能破壞纖維素與半纖維素之間的氫鍵和酯鍵，且在堿性條件下，醛酸以陰離子的形式存在，導致AX之間互相排斥[1]。而酶的生物活性受反應時間、溫度和pH值等影響，這導致其提取率低于堿提法。酶提法中，相比于纖維素酶，木聚糖酶對AX的提取率更高，可能是由于木聚糖酶可以打破木聚糖主鏈，隨機斷裂主鏈上的β-1,4-糖苷鍵，導致在水解水可提取性AX時，產生阿拉伯糖單/雙取代或未取代的低聚木糖；在水解水不可提取性AX時，將其轉化為水可提取性AX，使其分子質量降低，溶解度增加，從而提高得率[1]。

表1 不同方法提取AXs的化學組成和得率Table 1 Compositions and yields of AXs extracted by different methods

化學組成分析結果表明，利用堿法提取得到的5 個品種AX總糖質量分數均約為63%，幾乎無差異，蛋白質量分數略有不同，糖醛酸質量分數無明顯差異。酶法提取AX總糖質量分數略低于堿提AX，其中，AX-木（57.5%）高于AX-纖（49.4%）。蛋白質通過酰胺鍵與AX發(fā)生化學結合，堿提AX的蛋白質量分數低于酶提AX，這與Zhou Sumei等[4]的研究結果一致。阿魏酸通過酯鍵與AX發(fā)生化學結合，除分子質量和多糖取代度外，多酚含量對AX的功能特性也有較大影響，酶提AX總酚質量分數高于堿提AX，且AX-纖（2.7%）高于AX-木（2.1%）。總之，不同的提取方法各有優(yōu)劣，并且由于所用酶及原料不同，提取得率也不同[6]。

2.2 AX分子質量分析結果

多糖的性質與其分子質量大小、分子質量分布及其分子結構密切相關。利用不同方法從不同品種麩皮中提取得到的AX分子質量如表2所示。堿提AX分子質量較大，為700 kDa左右，酶提AX分子質量較低。Xyl通過β-1,4糖苷鍵連接形成木聚糖，構成AX的骨架，Ara作為側鏈連接在骨架上。酶作用于木聚糖骨架上任意位置的β-1,4-D-呋喃木糖鍵，從而得到分子質量不一的片段。因此，與堿提AX相比，酶提AX的分子質量較低，這說明酶法提取破壞了AX分子結構，而AX-木和AX-纖的分子質量減小程度不同，則說明不同種類酶的降解能力不同[27]。

表2 不同方法提取AXs的分子質量Table 2 Molecular masses of AXs extracted by different methods

2.3 AX紅外光譜分析結果

傅里葉變換紅外光譜是多糖結構表征常用的手段之一[28]。AX的官能團組成如圖1所示，3 423 cm－1和2 924 cm－1處的寬吸收峰分別歸因于—OH拉伸振動和—CH2中C—H的對稱拉伸振動，1 654 cm－1處的吸收峰是由—COO－的不對稱拉伸振動引起的[29]，可能與AX中含有少量的糖醛酸有關。1 042 cm－1左右處的吸收峰歸因于C—C、C—O或者C—O—H的彎曲振動[28]，該信號反映了聚糖主鏈上分支數量的變化。

圖1 不同方法提取AXs的傅里葉變換紅外光譜Fig.1 Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) of AXs extracted by different methods

1 413 cm－1處的吸收峰是由C—C、C—O和C—O—H的彎曲振動引起的[28]，該區(qū)域的吸收峰強度因取代量的不同而發(fā)生變化。隨著取代度的增加，該區(qū)域的吸收峰強度降低（伴隨著峰多重性的損失）。AX的紅外光譜表明木聚糖殘基的C3位有很高的Ara取代度（在898 cm－1和1 070 cm－1處的吸收峰），在1 100～1 000 cm－1區(qū)域中發(fā)生峰多重性的損失，是高度取代AX的特征。不同品種麩皮堿提AX以及3 種方法提取AX的紅外光譜相似。

2.4 AX單糖組成分析結果

AX的單糖組成如圖2所示，混標組成從左到右依次為Rha、Ara、Xyl、Man、Glc和Gal。AX主要由Ara和Xyl兩種單糖組成的，還含有少量的Man、Glc和Gal。Gal可能來自半乳糖阿拉伯木聚糖或阿拉伯半乳糖，Man可能來自在各種谷物細胞壁中發(fā)現的葡甘聚糖，Glc可能來自β-葡聚糖和部分未水解淀粉[28]。與堿提AX相比，采用酶法提取的AX各單糖組分比例變化較大[27]，這與胡葉碧等[30]的研究結果一致，可能是因為酶將膳食纖維中的不溶性成分降解為可溶性物質，在增加可溶性膳食纖維的同時也明顯改變了其單糖組成。

圖2 AXs的單糖組成分析氣相色譜圖Fig.2 Gas chromatograms for monosaccharide composition analysis of AXs

木聚糖主鏈上Ara殘基的取代程度和分布非常重要，它們可以影響AX內部相互作用及與細胞壁和其他組分的相互作用，從而使這些大分子的理化和功能性質發(fā)生變化[28]。因此，木聚糖主鏈的平均取代度是評價AX結構特點的一個重要指標。Ara/Xyl值（Ara與Xyl物質的量分數比）能夠反映AX的支鏈化程度，比值越大表明支鏈化程度越高[31]。根據峰面積比計算各單糖組分的物質的量分數，結果如表3所示。麩皮經堿提后所得AX的Ara/Xyl值由高到低依次為‘百農207’＞‘冠麥1號’＞‘華育198’＞‘百旱207’＞‘華育166’?？梢钥闯?，不同品種麩皮堿提所得AX在主鏈上的取代方式存在一定的差異[27-28]，但均具有高度分支的結構。另外，AX-木和AX-纖的Ara/Xyl值分別為1.36和0.93，差異較大，且與堿提方法所得AX不同，這可能是由于纖維素酶會破壞Ara和Xyl主鏈的連接，此外，李凡等[1]報道，對麥麩進行脫淀粉處理，再用內木聚糖酶處理AX的Ara/Xyl值（0.83）比僅用脫淀粉處理AX的Ara/Xyl值（0.54）高，表明木聚糖酶優(yōu)先作用于取代度較低的木聚糖片段，與本研究結果一致。類似地，Aguedo等[32]證明，酶輔助提取、熱提取和堿提取的AX的Ara/Xyl值不同。

表3 不同方法提取AXs的單糖組成Table 3 Monosaccharide compositions of AXs extracted by different methods

2.5 AX甲基化分析結果

AX的甲基化分析結果如表4所示，AX主要由Xylp和Araf組成[16]，其結果與單糖組成的測定結果一致。Xyl殘基主要包括T-Xylp、4-Xylp、2,4-Xylp、3,4-Xylp和2,3,4-Xylp，Ara殘基主要包括T-Araf、3-Araf和5-Araf。堿法提取AX的4-β-D-xylan主鏈含有未取代的Xylp、在O2/3位單取代的Xylp以及在O2和O3位雙取代的Xylp。相比堿提AX，超聲輔助木聚糖酶和超聲輔助纖維素酶提取AX主鏈在O2位單取代的Xylp數量均非常少，超聲輔助木聚糖酶提取AX主鏈不含在O2和O3位雙取代的Xylp。Ara主要以末端形式附著在木聚糖主鏈上。同樣，T-D-Xylp可能為D-Xylp主鏈的非還原性末端，作為單側鏈連接在D-Xylp主鏈的O2/3位置，或者連接在支鏈L-Araf單元的O3/5位。阿魏酸可能連接在L-Araf單元的O5位[33]?？傊?，3 種方法從小麥麩皮中提取得到的AX糖苷鍵連接方式存在差異，堿提不同品種麩皮AX的糖苷鍵連接方式沒有明顯差異。

表4 不同方法提取AXs的連接方式Table 4 Types of glycosidic linkage in AXs extracted by different methods

2.6 AX 1H NMR分析結果

如圖3所示，AX的異頭區(qū)可分為兩部分：δ5.5～5.0的信號歸因于末端Ara殘基在Xyl殘基的C-(O)-3位單取代以及在C-(O)-2和C-(O)-3位雙取代，δ4.2～4.5的信號歸因于未取代、單取代和雙取代的β-D-Xylp殘基[21]。δ6.0～8.0的信號為阿魏酸的質子信號峰[34]，通過對AX局部放大，δ6.0～8.0的信號強度較高，再次印證了超聲輔助木聚糖酶和超聲輔助纖維素酶提取AX能夠更大程度地保留阿魏酸。

圖3 AXs的1H NMR譜圖Fig.3 1H nuclear magnetic resonance (NMR) spectra of AXs

2.7 AX熱穩(wěn)定性分析結果

AX的熱降解特性可通過熱重曲線分析，如圖4所示，AX主要有3 個熱降解階段。第一個熱降解階段是20～120 ℃，質量損失約為7%，50 ℃左右出現了一個明顯的質量損失峰，可能是由于樣品失水造成的，且主要是AX中的結合水。第二個熱降解階段為200～400 ℃，質量損失約為50%，質量損失峰大約在280 ℃左右，此溫度區(qū)間的質量損失加快，說明AX在此升溫過程中化學結構發(fā)生降解[35]。第三個熱降解階段為400～600 ℃，質量損失約為30%，可能是由于碳化導致的。此外，在熱重曲線中能夠觀察到不同提取方法AX熱穩(wěn)定性的差異。AX-堿、AX-木及AX-纖的最大熱分解速率分別出現在282.26、275.90 ℃和273.31 ℃，可知AX-堿的熱穩(wěn)定性較好。

圖4 不同方法提取AXs的熱重曲線Fig.4 Thermogravimetric curves of AXs extracted by different methods

在食品加工過程中經常用到熱處理，溫度的控制則顯得尤為重要，溫度過低，達不到預期效果，溫度過高，則可能造成某些物質分解，影響有效成分含量、產品品質及產生有害物質等。了解多糖的熱穩(wěn)定性可為其熱加工處理提供參考。

2.8 AX抗氧化性分析結果

2.8.1 AX的總抗氧化能力

如圖5A所示，在AX質量濃度0.25～2.00 mg/mL之間，隨著樣品質量濃度的增加，AX的總抗氧化能力明顯增強，當質量濃度大于2 mg/mL時，AX-木和AX-纖的總抗氧化能力增加不明顯，而質量濃度大于4 mg/mL時，AX-堿的總抗氧化能力增長緩慢。當質量濃度為0.25～4.00 mg/mL時，AX-木和AX-纖的總抗氧化能力無明顯差異，但明顯高于AX-堿，說明酶提AX的總抗氧化能力優(yōu)于堿提AX。當質量濃度為5 mg/mL時，AX-木、AX-纖和AX-堿的總抗氧化能力分別為99.78%、99.73%、100.00%，其半抑制濃度（halfmaximal inhibitory concentration，IC50）分別為0.526、0.565、1.016 mg/mL，說明各AX均有較強的總抗氧化能力。

2.8.2 AX的還原力

生物體內存在游離金屬離子，如鐵離子，利用抗氧化劑能夠將Fe3＋還原成Fe2＋從而測定抗氧化劑的還原力，還原能力愈強，其抗氧化活性愈高[36]。如圖5B所示，AX質量濃度為0.25～5.00 mg/mL時，AX的還原力隨著樣品質量濃度的增加呈現上升趨勢，當質量濃度為5 mg/mL時，AX-木、AX-纖和AX-堿的還原力分別為88.16%、79.40%、40.56%。AX-木和AX-纖的還原力相當，且高于AX-堿，這可能是由于AX-木和AX-纖的平均分子質量相對較小，另外，具有較強還原力的AX-木Ara/Xyl值較高（Ara/Xyl＝1.36），因此，AX的還原能力也可能受其Ara/Xyl和Xyl殘基取代度的影響[3]。

2.8.3 AX的DPPH自由基清除率

DPPH自由基是一種穩(wěn)定的有機自由基，廣泛用于體外抗氧化實驗中，樣品DPPH自由基的清除能力可反映其抗氧化活性[2]。如圖5C所示，AX對DPPH自由基的清除效果呈量效關系。AX質量濃度為0.5～5.0 mg/mL時，隨質量濃度的增加，對DPPH自由基清除率呈現上升趨勢。在0～3.68 mg/mL之間，AX-纖對DPPH自由基清除率高于AX-木，在3.68～5.00 mg/mL之間，AX-木對DPPH自由基清除率高于AX-纖，但酶提AX的DPPH自由基清除率始終高于堿提AX。這可能是酶提AX的多酚含量較高，阿魏酸中含有酚羥基，為DPPH自由基提供了H＋，形成了DPPH-H，使得DPPH自由基含量降低[37]。另外，AX-木DPPH自由基的清除能力最強，這可能是由于其平均分子質量較小且具有較高的分支結構（Ara/Xyl＝1.36）[38]。當質量濃度為5 mg/mL時，AX-木、AX-纖和AX-堿的DPPH自由基清除率分別為45.28%、41.92%、19.50%，說明各AX均有較強的DPPH自由基清除能力。

2.8.5 AX的·OH清除率

·OH是氧化性最強的活性氧自由基，通過測定AX對·OH的清除能力能夠評價其抗氧化性[2]。生物體內存在游離金屬離子，如鐵離子，能夠催化H2O2生成·OH，導致相鄰分子損傷，而抗氧化劑能夠絡合Fe3＋，減少·OH的產生[3]。如圖5E所示，AX對·OH的清除率隨其質量濃度的增加整體呈現上升的趨勢，AX質量濃度為0～5 mg/mL時，AX對·OH的清除率依次為AX-堿＞AX-纖＞AX-木。AX-木和AX-纖對·OH的清除作用較低，原因可能在于其雜質（蛋白質16.84%、15.79%）的干擾，影響了吸光度測定，導致吸光度偏大，清除率偏低[3]。

圖5 AXs的總抗氧化能力（A）、還原力（B）、DPPH自由基清除能力（C）、清除能力（D）、·OH清除能力（E）Fig.5 Total antioxidant capacity (A),reducing capacity (B),1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging capacity (C),superoxide anion radical scavenging capacity (D),and hydroxyl radical scavenging capacity (E) of AXs

3 討論

本研究分別利用堿提、超聲輔助木聚糖酶和超聲輔助纖維素酶3 種方法從不同品種小麥麩皮中提取AX，并測定其化學組成、分子結構、熱穩(wěn)定性及抗氧化性等指標。結果表明，不同品種麩皮AX的分子質量不同，且各單糖組分比例變化較大，糖苷鍵連接方式及比例也存在不同，這與牟振坤[40]、Wang Libo[41]等的研究結果一致。與堿提法相比，超聲輔助酶法提取的AX多酚含量明顯更高，He Hongju等[33]也報道了酶法提取能更大程度地保留多酚，而總酚含量是影響AX抗氧化活性的重要因素，本研究也表明AX-木與AX-纖的抗氧化活性高于AX-堿，此外，Snelders等[42]證明，多酚存在的形式極大地影響AX抗氧化能力，且多酚與AX非共價結合的抗氧化能力強于共價結合。此外，多糖的結構差異也可能是導致抗氧化能力不同的原因[43]，黃玉龍等[13]報道了不同提取方式造成多糖分子的單糖組成及糖苷鍵型不同從而使多糖的抗氧化活性存在差異。酶提AX單糖組分比例較堿提差別很大，Aguedo等[32]也有類似報道。另外，本研究發(fā)現酶提AX分子質量更低，糖苷鍵連接方式更復雜，但得率和總糖含量較低。進一步對比兩種酶提方法，超聲輔助木聚糖酶提AX得率更高，且總糖含量更高，而超聲輔助纖維素酶提AX多酚含量更高，二者單糖比例及糖苷鍵連接方式也不同，但二者抗氧化活性差異并不明顯，其具體機制仍需進一步研究。