李海靜，王 松，劉紅玉，夏秀芳,*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.大莊園肉業(yè)集團(tuán)股份有限公司，黑龍江 綏化 151100）

海參性腺作為海參的內(nèi)臟，是海參加工過(guò)程中的一種副產(chǎn)品。由于加工過(guò)程中利用率較低，海參性腺常常被丟棄，不僅會(huì)造成資源浪費(fèi)，而且可能導(dǎo)致環(huán)境污染[1]。海參性腺中蛋白質(zhì)含量極高（約為55%），是優(yōu)質(zhì)的動(dòng)物蛋白質(zhì)來(lái)源[2]。目前，酶解法因酶解后溶液中無(wú)有毒化學(xué)物質(zhì)殘留，是提取海參副產(chǎn)物中蛋白質(zhì)的主要方法[3]。但是傳統(tǒng)的酶解法存在酶解時(shí)間長(zhǎng)、酶利用率低和底物轉(zhuǎn)化率低等缺點(diǎn)[4-5]。因此，研發(fā)新的加工方法對(duì)于提高酶解率至關(guān)重要。

超聲波作為一種安全、環(huán)保、高效和無(wú)毒的新興物理加工技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于改善蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特性[6-9]。超聲產(chǎn)生的空化、熱效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)會(huì)破壞蛋白質(zhì)分子間的氫鍵和疏水相互作用等，使卷曲的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)展開(kāi)[10-12]。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)展開(kāi)時(shí)，會(huì)暴露出新的酶解位點(diǎn)，增加底物與酶接觸的機(jī)會(huì)，從而促進(jìn)酶解，提高蛋白質(zhì)利用率[4,13]。此外，超聲預(yù)處理導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)的展開(kāi)促使連接蛋白之間的肽鍵更大程度地暴露于酶，增加了酶與肽鍵作用的可能性，進(jìn)而有利于酶分子與底物接觸并發(fā)揮作用[14]。

本研究利用不同時(shí)間（0、5、15、25、35 min，200 W）超聲預(yù)處理海參性腺蛋白酶解物，探究其側(cè)鏈、二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)、表面疏水性、粒徑和微觀結(jié)構(gòu)等的變化情況，確定出最佳的超聲預(yù)處理時(shí)間，以期為超聲技術(shù)在海參性腺蛋白開(kāi)發(fā)利用方面提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海參性腺 大連水產(chǎn)有限公司；中性蛋白酶（酶活力81 000 U/g） 北京索萊寶科技有限公司。

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS） 美國(guó)Sigma公司；所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；721型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；F-4600熒光光譜儀 日本Hitachi公司；MS3000激光粒度分析儀 英國(guó)馬爾文儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

將海參性腺凍干并研磨成粉末，過(guò)60 目篩。取100 g粉末添加400 mL正己烷和50 mL乙醇（8∶1，V/V），攪拌1 h。4 ℃、8 000×g離心10 min，獲得沉淀后，按上述方法重復(fù)操作兩次。將脫脂后的海參性腺粉在室溫下自然風(fēng)干，置于－20 ℃貯存。

1.3.2 超聲預(yù)處理

用蒸餾水將脫脂海參性腺粉（蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為42.86%）配制成一定質(zhì)量濃度（1 g/100 mL）的蛋白溶液并置于雙層燒杯中。對(duì)溶液進(jìn)行超聲處理，處理參數(shù)：頻率20 kHz；功率200 W[13]；時(shí)間0、5、15、25、35 min；間歇模式：超聲2 s和間歇2 s（防止局部過(guò)熱。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)所測(cè)水解度得到：未超聲組水解度為7.98%，超聲1 s和間歇3 s組水解度為8.15%，超聲2 s和間歇2 s組水解度為10.11%，超聲3 s和間歇1 s組水解度為9.06%）。超聲處理后，蛋白溶液置于4 ℃保存待進(jìn)一步處理。

1.3.3 酶解處理

參照Li Haijing等[15]的方法進(jìn)行酶解處理。用1 mol/L NaOH溶液將超聲預(yù)處理后的蛋白質(zhì)溶液pH值調(diào)節(jié)至7.0，添加中性蛋白酶（添加量為4 500 U/g）后在50 ℃下進(jìn)行酶解。酶解終止時(shí)，將混合物在100 ℃下煮沸10 min致中性蛋白酶失活。酶解液冷卻至室溫后，于10 000×g下離心30 min。通過(guò)雙縮脲法測(cè)定上清液的蛋白質(zhì)量濃度約為10～12 mg/mL。將上清液凍干成粉末，并在－20 ℃下貯存作進(jìn)一步分析。

1.3.4 側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的測(cè)定

根據(jù)Li Haijing等[15]的方法測(cè)定海參性腺蛋白酶解物的紫外-可見(jiàn)光譜，用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）將1.3.3節(jié)凍干的粉末配制成0.2 mg/mL的溶液。用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)將樣品溶液在240～360 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。并以磷酸鹽緩沖液為對(duì)照。

1.3.5 二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定

根據(jù)Li Wenwen等[16]的方法使用傅里葉變換紅外光譜測(cè)定海參性腺蛋白酶解物的二級(jí)結(jié)構(gòu)，并使用Peak Fit Version 4.12軟件對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，根據(jù)酰胺I帶（1 700～1 600 cm－1）各指定峰的相對(duì)面積計(jì)算海參性腺蛋白酶解物二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量。

1.3.6 三級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定

參考張熙[17]的方法并略作修改，使用熒光分光光度計(jì)測(cè)定海參性腺蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。將凍干樣品溶于0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）中制備1.0 mg/mL樣品溶液，并在25 ℃條件下進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定條件：激發(fā)波長(zhǎng)290 nm、狹縫寬度5 nm、發(fā)射波長(zhǎng)310～400 nm。

1.3.7 表面疏水性的測(cè)定

根據(jù)Li Fangfei等[18]的方法測(cè)定海參性腺蛋白酶解物的表面疏水性，并略作修改。用磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L、pH 7.0）將海參性腺蛋白酶解物溶液分別稀釋至0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL。然后，將20 μL ANS（8.0 mmol/L）溶液添加到4 mL海參性腺蛋白溶液中，避光反應(yīng)10 min。在激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為390 nm和470 nm的條件下測(cè)定。

1.3.8 粒徑分布的測(cè)定

參照Li Fangfei等[19]的方法測(cè)定酶解物的粒徑分布。將海參性腺蛋白酶解物用蒸餾水配制成1.0 mg/mL蛋白溶液，在室溫條件下用激光粒度儀測(cè)定樣品的粒徑分布。

1.3.9 微觀結(jié)構(gòu)的觀察

參照Li Haijing等[15]的方法觀察海參性腺蛋白酶解物的微觀結(jié)構(gòu)。凍干的海參性腺蛋白酶解物涂在雙面導(dǎo)電膠上并在原料涂層上噴金約10 min，用掃描電子顯微鏡在5 000 倍的放大倍數(shù)下觀察其形態(tài)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，每次3 個(gè)平行。所得數(shù)據(jù)使用IBM SPSS Statistics 22.0軟件的Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05表示差異顯著性。用Origin 2019軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲預(yù)處理對(duì)海參性腺蛋白酶解物側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的影響

蛋白質(zhì)殘基側(cè)鏈基團(tuán)（如色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等）對(duì)紫外光有很強(qiáng)的吸收作用，色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的紫外吸收峰分別在279、275 nm和257 nm波長(zhǎng)處[20]。海參性腺蛋白酶解物側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的變化可以通過(guò)苯丙氨酸在257 nm波長(zhǎng)處的紫外-可見(jiàn)光譜反映。如圖1所示，隨著超聲預(yù)處理時(shí)間的延長(zhǎng)（0～15 min），蛋白質(zhì)的紫外吸光度明顯增加，當(dāng)超聲時(shí)間為15 min時(shí)，蛋白質(zhì)的紫外吸光度增加了7.30%。這可能是因?yàn)槌晻r(shí)間的延長(zhǎng)產(chǎn)生了更強(qiáng)的空化作用，破壞了蛋白質(zhì)分子間的相互作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的展開(kāi)和重排，暴露出更多的芳香氨基酸，從而使紫外吸收強(qiáng)度增加[21]。當(dāng)超聲時(shí)間從15 min延長(zhǎng)到35 min時(shí)，蛋白質(zhì)的紫外吸光度呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，Huang Liuru等[22]也發(fā)現(xiàn)超聲處理20 min和30 min后大豆分離蛋白的紫外吸收強(qiáng)度低于超聲10 min后的紫外吸收強(qiáng)度，這可能是因?yàn)槌晻r(shí)間的延長(zhǎng)導(dǎo)致一些疏水基團(tuán)的嵌入或形成更大的聚集體，引起蛋白質(zhì)表面發(fā)色基團(tuán)數(shù)量減少，導(dǎo)致紫外吸光度下降。因此，適當(dāng)?shù)某曨A(yù)處理時(shí)間（15 min）有利于海參性腺蛋白酶解物側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的展開(kāi)。

圖1 超聲預(yù)處理對(duì)海參性腺蛋白酶解物紫外吸收光譜的影響Fig.1 Effect of ultrasound pretreatment on the UV spectrum of sea cucumber gonad protein hydrolysates

2.2 超聲預(yù)處理對(duì)海參性腺蛋白酶解物二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

傅里葉變換紅外光譜通過(guò)基線校正、反卷積、二階導(dǎo)數(shù)和吸光度曲線擬合來(lái)分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化[23]，其中，酰胺I 帶（1 600～1 700 cm－1）能夠反映α-螺旋（1 648～1 664 cm－1）、β-折疊（1 615～1 637 cm－1和1 682～1 700 cm－1）、β-轉(zhuǎn)角（1 664～1 681 cm－1）和無(wú)規(guī)卷曲（1 637～1 648 cm－1）的含量[24-25]。不同超聲預(yù)處理時(shí)間對(duì)海參性腺蛋白酶解物二級(jí)結(jié)構(gòu)及相對(duì)含量的影響如圖2所示，隨著超聲預(yù)處理時(shí)間的延長(zhǎng)，α-螺旋相對(duì)含量先降低后升高，在15 min時(shí)達(dá)到最小值（降低了9.98%），β-折疊相對(duì)含量的變化呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)，在15 min時(shí)增加了50.72%。α-螺旋是蛋白質(zhì)較常見(jiàn)的穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)，其主要是通過(guò)分子內(nèi)氫鍵來(lái)維持蛋白質(zhì)分子內(nèi)的有序排列。超聲波空化作用導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開(kāi)，暴露了疏水區(qū)域，使分子內(nèi)氫鍵發(fā)生斷裂而減少，從而引起α-螺旋結(jié)構(gòu)含量的減少[15]。β-折疊結(jié)構(gòu)含量的增加可能是因?yàn)槌曨A(yù)處理破壞了維持海參性腺蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)的次級(jí)鍵（如氫鍵、靜電相互作用和范德華力等），從而引起蛋白結(jié)構(gòu)的展開(kāi)[26]。然而，過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的超聲預(yù)處理會(huì)中斷分子間的相互作用，引起蛋白質(zhì)分子聚集，從而使α-螺旋相對(duì)含量的升高和β-折疊相對(duì)含量的降低[27]。王喜波等[25]指出β-折疊含量還與蛋白質(zhì)的疏水相互作用有關(guān)，其降低表明蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)暴露，疏水性增強(qiáng)。

圖2 超聲預(yù)處理對(duì)海參性腺蛋白酶解物二級(jí)結(jié)構(gòu)紅外光譜（A）和相對(duì)含量（B）的影響Fig.2 Effect of ultrasound pretreatment on the infrared spectrum (A)and secondary structure composition (B) of sea cucumber gonad protein hydrolysates

超聲預(yù)處理顯著降低了海參性腺蛋白酶解物無(wú)規(guī)卷曲相對(duì)含量（P＜0.05），而對(duì)β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量影響不顯著（P＞0.05）。這一結(jié)果與戴澤川等[28]的結(jié)論一致，其同樣發(fā)現(xiàn)隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，蝦肌肉蛋白的無(wú)規(guī)卷曲比例減小。超聲波可以使無(wú)規(guī)卷曲的聚集結(jié)構(gòu)發(fā)生解離，引起其含量下降，從而轉(zhuǎn)化為β-折疊（0～15 min）或α-螺旋（15～35 min）結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致后兩者含量升高[29]。

2.3 超聲預(yù)處理對(duì)海參性腺蛋白酶解物三級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

蛋白的內(nèi)源熒光光譜可以表征蛋白質(zhì)中色氨酸殘基的數(shù)量，直觀反映蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化情況[30]。如圖3所示，在340 nm波長(zhǎng)處附近觀察到所有樣品有一個(gè)熒光發(fā)射峰，不同超聲預(yù)處理時(shí)間的海參性腺蛋白酶解物熒光發(fā)射峰位置變化不明顯，但熒光強(qiáng)度有明顯變化。樣品的熒光強(qiáng)度隨超聲預(yù)處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在15 min時(shí)有最大熒光強(qiáng)度（比0 min時(shí)增加了4.50%）。熒光強(qiáng)度的升高可能是超聲預(yù)處理使蛋白質(zhì)發(fā)生伸展，暴露了埋藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部的色氨酸殘基，引起蛋白質(zhì)表面的色氨酸殘基含量增加，從而表現(xiàn)出更強(qiáng)的熒光強(qiáng)度[20]。Zou Ye等[31]也認(rèn)為超聲預(yù)處理（20 kHz、100 W、10 min）可以使雞肝水溶性蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開(kāi)，破壞蛋白質(zhì)分子的疏水鍵，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)分子內(nèi)更多疏水基團(tuán)暴露，從而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度增加。隨著超聲時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，熒光強(qiáng)度明顯下降，這可能是過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的超聲處理會(huì)使蛋白質(zhì)分子發(fā)生交聯(lián)、聚集，已經(jīng)暴露的色氨酸基團(tuán)重新內(nèi)包于蛋白質(zhì)內(nèi)部，引起蛋白質(zhì)空間位阻增加，導(dǎo)致熒光猝滅[17]。

圖3 超聲預(yù)處理對(duì)海參性腺蛋白酶解物熒光光譜的影響Fig.3 Effect of ultrasound pretreatment on the fluorescence spectrum of sea cucumber gonad protein hydrolysates

2.4 超聲預(yù)處理對(duì)海參性腺蛋白酶解物表面疏水性的影響

表面疏水性可以表征蛋白分子表面暴露疏水基團(tuán)的數(shù)量，是評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)分子構(gòu)象變化的重要參數(shù)[32]。超聲預(yù)處理時(shí)間對(duì)海參性腺蛋白酶解物表面疏水性的影響如圖4所示，隨超聲預(yù)處理時(shí)間的延長(zhǎng)（0～15 min），蛋白表面疏水性呈升高的趨勢(shì)，當(dāng)超聲時(shí)間為15 min時(shí)，蛋白質(zhì)的表面疏水性比0 min時(shí)增加了13.42%。Jiang Lianzhou等[27]利用超聲（頻率20 kHz、功率300 W、超聲4 s間歇2 s）處理黑豆分離蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黑豆分離蛋白表面疏水性隨超聲處理時(shí)間的延長(zhǎng)（12～24 min）而升高。這可能是超聲空化效應(yīng)能夠使蛋白氫鍵和分子間作用力斷裂，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開(kāi)，導(dǎo)致分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)和區(qū)域暴露于周圍的極性環(huán)境，使得熒光探針更容易與之結(jié)合，從而引起表面疏水性升高[15]。隨著超聲預(yù)處理時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)（15～35 min），表面疏水性開(kāi)始降低。這可能是蛋白質(zhì)在疏水作用的驅(qū)動(dòng)下相互靠近并發(fā)生了聚集，導(dǎo)致暴露的疏水基團(tuán)重新被包埋在蛋白內(nèi)部[32]。此外，王笑宇等[33]認(rèn)為超聲波的作用不足以破壞蛋白質(zhì)分子核心的疏水作用，過(guò)度超聲（500 W、15 min）可能會(huì)使蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)更加疏松，導(dǎo)致一些親水肽鏈上的基團(tuán)更容易發(fā)生水合作用，使得表面疏水性降低。

圖4 超聲預(yù)處理對(duì)海參性腺蛋白酶解物表面疏水性的影響Fig.4 Effect of ultrasound pretreatment on the surface hydrophobicity of sea cucumber gonad protein hydrolysates

2.5 超聲預(yù)處理對(duì)海參性腺蛋白酶解物粒徑的影響

d0.1、d0.5和d0.9分別表示粒徑累積分布（0～100%）中10%、50%和90%所對(duì)應(yīng)的粒徑。d3,2為粒徑對(duì)表面積加權(quán)平均值（表面積平均粒徑），d4,3為粒徑對(duì)體積加權(quán)平均值（體積平均粒徑），可以用來(lái)反映粒徑的變化[34]。粒徑分布和平均粒徑可以反映出蛋白因結(jié)構(gòu)改變發(fā)生的聚集行為[18]。超聲預(yù)處理時(shí)間對(duì)海參性腺蛋白酶解物粒徑分布的影響如圖5和表1所示，隨超聲預(yù)處理時(shí)間的延長(zhǎng)，海參性腺蛋白酶解物的體積平均粒徑（d4,3）和表面平均粒徑（d3,2）均先減小后增大，其中超聲預(yù)處理時(shí)間為15 min時(shí)兩者達(dá)到最?。?6.2 nm和34.3 nm），顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。粒徑分布范圍也呈現(xiàn)類似的趨勢(shì)。超聲處理使蛋白粒徑減小歸因于超聲空化效應(yīng)產(chǎn)生的微射流和高剪切應(yīng)力破壞了蛋白質(zhì)分子間的相互作用，使蛋白質(zhì)分解成更小的碎片[15]。田然等[35]認(rèn)為，超聲空化和聲流的綜合效應(yīng)還可以增加蛋白質(zhì)顆粒的碰撞速度和強(qiáng)度，促使大的蛋白聚集體被裂解成更小的碎片，從而引起蛋白質(zhì)粒徑減小。d0.1、d0.5和d0.9的變化趨勢(shì)與d4,3和d3,2的變化趨勢(shì)相似，表明適當(dāng)時(shí)間的超聲預(yù)處理（15 min）可以減小海參性腺蛋白酶解物的粒徑，防止蛋白質(zhì)聚集。這可能是因?yàn)檫m當(dāng)時(shí)間超聲預(yù)處理產(chǎn)生的機(jī)械剪切力使海參性腺蛋白分子被粉碎，導(dǎo)致粒徑變小，而過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的超聲作用會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子重新聚集。此外，齊寶坤等[36]指出，蛋白質(zhì)的表面疏水性與粒徑之間呈顯著負(fù)相關(guān)，即蛋白質(zhì)粒徑越小，其表面疏水性越大，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其所得結(jié)論一致。當(dāng)超聲時(shí)間超過(guò)15 min時(shí)，海參性腺蛋白酶解物的粒徑隨超聲預(yù)處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，這可能是因?yàn)檫^(guò)長(zhǎng)時(shí)間的超聲處理會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的空化效應(yīng)，生成過(guò)量自由基，從而加速蛋白質(zhì)分子的運(yùn)動(dòng)，使蛋白質(zhì)分子之間碰撞的機(jī)會(huì)增加，導(dǎo)致一些蛋白質(zhì)分子聚集并形成較大的顆粒[37-38]。李笑笑[39]也認(rèn)為超聲處理使大豆分離蛋白粒徑增大是超聲處理促使部分蛋白質(zhì)分子相互聯(lián)接，并重新聚合所致。

圖5 超聲預(yù)處理對(duì)海參性腺蛋白酶解物粒徑分布的影響Fig.5 Effect of ultrasound pretreatment on the particle size distribution of sea cucumber gonad protein hydrolysates

表1 超聲預(yù)處理對(duì)海參性腺蛋白酶解物平均粒徑的影響Table 1 Effect of ultrasound pretreatment on the average particle size of sea cucumber gonad protein hydrolysates

2.6 超聲預(yù)處理對(duì)海參性腺蛋白酶解物微觀結(jié)構(gòu)的影響

超聲預(yù)處理時(shí)間對(duì)海參性腺蛋白酶解物微觀結(jié)構(gòu)的影響如圖6所示，未經(jīng)超聲處理的海參性腺蛋白酶解物顯示出許多不規(guī)則片段、小孔洞和大聚集體。隨著超聲預(yù)處理時(shí)間的延長(zhǎng)（0～15 min），海參性腺蛋白酶解物組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了更多的細(xì)小孔洞，樣品質(zhì)地更加疏松，顆粒變小且均勻，這與粒徑分析結(jié)果一致。此現(xiàn)象表明超聲空化效應(yīng)產(chǎn)生的微射流和高剪切應(yīng)力能夠有效破壞蛋白質(zhì)緊密結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)組織結(jié)構(gòu)變得疏松多孔，增強(qiáng)了酶與底物的相互作用，從而提高了酶解效率[40-41]。劉運(yùn)[42]發(fā)現(xiàn)馬鈴薯蛋白經(jīng)過(guò)超聲預(yù)處理后，其顆粒變得細(xì)小，比表面積增大，從而使蛋白與酶有接觸位點(diǎn)數(shù)量增加，酶解效率得以提高。隨著超聲預(yù)處理時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)（25～35 min），海參性腺蛋白酶解物出現(xiàn)了較多大的團(tuán)聚體，表明過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的超聲處理反而使蛋白質(zhì)發(fā)生了聚集，這與熒光和表面疏水性分析結(jié)果一致。邸紅艷[43]的研究也表明超聲輔助提取核桃粕蛋白60 min后，原本比較分散的部分蛋白質(zhì)又重新聚集。

圖6 超聲預(yù)處理對(duì)海參性腺蛋白酶解物微觀結(jié)構(gòu)的影響（×5 000）Fig.6 Effect of ultrasound pretreatment on the microstructure of sea cucumber gonad protein hydrolysates (×5 000)

3 討論

海參性腺富含蛋白質(zhì)、多糖、精氨酸、賴氨酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，但在海參的加工過(guò)程中，海參性腺通常作為下腳料被丟棄，造成了資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[44]。大量研究表明蛋白酶可以促進(jìn)海參性腺的水解，從而獲得更容易被人體吸收的蛋白水解物[45-47]。然而，常規(guī)酶解法存在著時(shí)間長(zhǎng)和效率低等問(wèn)題[4]，超聲波作為一種無(wú)損、綠色的新興加工技術(shù)可以有效提高酶解速率和酶利用率[48]。因此，本研究通過(guò)對(duì)海參性腺蛋白酶解物側(cè)鏈結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)、表面疏水性、粒徑分布和微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，探究超聲預(yù)處理對(duì)海參性腺蛋白酶解物結(jié)構(gòu)特性的影響，以期提高海參性腺蛋白的酶解效率。

然而，超聲處理在改善蛋白結(jié)構(gòu)特性方面并不總是具有積極作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：較長(zhǎng)時(shí)間超聲預(yù)處理（25～35 min）的海參性腺酶解物紫外吸收強(qiáng)度、熒光強(qiáng)度和表面疏水性均低于短時(shí)間超聲預(yù)處理（0～15 min）樣品，這可能是過(guò)度的超聲處理導(dǎo)致展開(kāi)的蛋白質(zhì)變性，再次發(fā)生折疊或聚集，一些疏水基團(tuán)被包埋于蛋白內(nèi)部[49]。黃朝湯[50]得到了與本研究不同的結(jié)果，即經(jīng)短時(shí)間超聲預(yù)處理（0～20 min）的小麥蛋白水解物紫外吸光度和熒光強(qiáng)度均低于長(zhǎng)時(shí)間超聲預(yù)處理（40～80 min）樣品，推測(cè)可能是較短時(shí)間的超聲處理產(chǎn)生較低強(qiáng)度的空化效應(yīng)，不足以使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開(kāi)，一些疏水基團(tuán)仍包埋于蛋白質(zhì)內(nèi)部[51]。因此，針對(duì)不同的實(shí)驗(yàn)原料及研究對(duì)象，應(yīng)確定適宜的超聲預(yù)處理參數(shù)。

4 結(jié)論

不同時(shí)間的超聲預(yù)處理能不同程度地改變海參性腺蛋白酶解物的結(jié)構(gòu)，隨著超聲預(yù)處理時(shí)間的延長(zhǎng)，海參性腺蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)先展開(kāi)后發(fā)生聚集。其中，15 min超聲預(yù)處理能最大程度地促進(jìn)海參性腺蛋白結(jié)構(gòu)的展開(kāi)，暴露出更多的酶解位點(diǎn)和疏水基團(tuán)。經(jīng)超聲預(yù)處理15 min的蛋白顆粒最小。因此，適當(dāng)?shù)某暡A(yù)處理（15 min）能夠促進(jìn)海參性腺蛋白酶解物結(jié)構(gòu)的展開(kāi)和提高酶解作用，減少聚集體的形成，從而提高海參性腺的利用價(jià)值。本研究可為超聲波在海參及其副產(chǎn)品中的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)支持。