朱倩薇，楊 驊，錢 楷，李 丹，夏從龍*

（1.大理大學(xué)藥學(xué)院，云南大理 671000；2.大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，云南大理 671000）

冠心病是臨床最常見的心血管疾病之一，《中國(guó)心血管健康與疾病報(bào)告2021 概要》〔1〕顯示：目前中國(guó)心血管疾病患病人數(shù)為3.3 億人，比2019 年發(fā)布的2.9 億人多4 000 萬(wàn)人，其中冠心病患者高達(dá)1 139 萬(wàn)例。隨著人口老齡化、社會(huì)工作壓力增大等原因，冠心病的患病人數(shù)呈上升趨勢(shì)〔2〕，有效預(yù)防和治療冠心病刻不容緩。

在過去的幾十年中，臨床治療冠心病的藥物主要以血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、β 受體阻滯劑、他汀類藥物、血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑等為主〔3〕。這些藥物能有效緩解冠狀動(dòng)脈粥樣硬化，但上述藥物通常為單一化合物，主要集中作用于單個(gè)靶點(diǎn)，長(zhǎng)期使用可能會(huì)產(chǎn)生副作用或耐藥性〔4-5〕。中成藥是我國(guó)勞動(dòng)人民在同疾病斗爭(zhēng)過程中實(shí)踐和總結(jié)的智慧結(jié)晶，具有靶點(diǎn)多位、療效穩(wěn)固、安全性高等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。如：麝香保心丸主要功效為行氣止痛、活血化瘀，不僅可以迅速緩解冠心病引起的胸痛癥狀，還可以降低心血管不良事件發(fā)生率；復(fù)方丹參滴丸可減少冠心病心絞痛的發(fā)作次數(shù)，提高患者運(yùn)動(dòng)耐量，并且具有用藥安全性高的特點(diǎn)〔6-7〕。

復(fù)方龍血竭膠囊是一種由龍血竭、三七和冰片組成的中成藥，被中國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于冠心病的治療，具有多成分、多途徑、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，在治療冠心病的臨床實(shí)踐中顯示出顯著優(yōu)勢(shì)。其中龍血竭具有活血、止血、鎮(zhèn)痛、創(chuàng)面愈合等藥理作用〔8〕；三七是我國(guó)的傳統(tǒng)中藥，因其在補(bǔ)血、止血、活血化瘀、抗血小板聚集、保護(hù)心腦血管方面具有顯著療效而運(yùn)用廣泛〔9〕。李維等〔10〕研究表明復(fù)方龍血竭膠囊不僅可以有效緩解冠心病患者心絞痛癥狀，還可以提高患者預(yù)后質(zhì)量。有臨床研究〔11〕顯示，在常規(guī)治療冠心病的基礎(chǔ)方案上加用復(fù)方龍血竭膠囊可以提高治療冠心病心絞痛的有效率，且對(duì)心、肝、腎功能及血液指標(biāo)均無明顯不良影響。復(fù)方龍血竭膠囊臨床效果明顯且使用廣泛，但其治療冠心病的作用機(jī)制尚不明確，因此，有必要深入探索復(fù)方龍血竭膠囊治療冠心病的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門基于生物信息學(xué)、多模式藥理學(xué)和大數(shù)據(jù)藥物系統(tǒng)研究新發(fā)展起來的交叉學(xué)科〔12〕。隨著生物信息學(xué)的快速發(fā)展，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在藥物開發(fā)、中藥成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè)等方面有著廣泛的應(yīng)用〔13〕。分子對(duì)接是預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與配體之間親和力及結(jié)合模式的有力工具，在揭示藥物活性成分與蛋白質(zhì)靶點(diǎn)的作用機(jī)制上發(fā)揮著重要的作用〔14〕。因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)，分析復(fù)方龍血竭膠囊治療冠心病的活性物質(zhì)和作用機(jī)制，以期為臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 復(fù)方龍血竭膠囊活性成分及靶點(diǎn)篩選利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（TCMSP，https：//old.tcmspe.com/tcmsp.php）〔15〕，分別以“龍血竭”“三七”和“冰片”為關(guān)鍵詞進(jìn)行成分檢索，并查閱文獻(xiàn)對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行補(bǔ)充。通過SwissADME 平臺(tái)〔16〕（http：//www.swissadme.ch/）篩選潛在活性成分，篩選標(biāo)準(zhǔn)為：腸胃吸收（gastrointestinal absortion；GIabsortion）為“High”，且5 類藥性預(yù)測(cè)結(jié)果（Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge）中有2 個(gè)及以上為“Yes”。利用Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫(kù)〔17〕（http：//www.swiss targetprediction.ch/）預(yù)測(cè)化合物的作用靶點(diǎn)，并剔除P＜0.2 的基因靶點(diǎn)。

1.2 疾病靶點(diǎn)篩選以“coronary heart disease”“coronary disease”“coronary atherosclerotic heart disease”“CHD”等為關(guān)鍵詞，從GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)〔18〕（https：//www.genecards.org）、DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)〔19〕（https：//www.disgenet.org/）、TTD 數(shù)據(jù)庫(kù)〔20〕（http：//db.idrblab.net/ttd/）、DrugBank 數(shù)據(jù)庫(kù)〔21〕（https：//go.drugbank.com/）獲得冠心病的疾病靶點(diǎn)。

1.3 “藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過UniProt 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.uniprot.org）將藥物活性成分的靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)統(tǒng)一規(guī)范為Gene Symbol 形式，取兩者交集，以獲得復(fù)方龍血竭膠囊干預(yù)冠心病的靶點(diǎn)；使用Cytoscape 3.9.0 軟件構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，再根據(jù)拓?fù)鋮?shù)篩選復(fù)方龍血竭膠囊干預(yù)冠心病的核心活性成分。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選將上述交集靶點(diǎn)上傳至STRING 11.0 數(shù)據(jù)庫(kù)〔22〕（https：//string-db.org），選擇物種為“智人”，設(shè)置靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)的置信度為0.40，隱藏獨(dú)立點(diǎn)，獲得PPI 網(wǎng)絡(luò)。利用Cytoscape 中的CytoNCA 插件，通過3 次打分篩選獲得關(guān)鍵靶點(diǎn)，打分標(biāo)準(zhǔn)為介數(shù)中心性（BC）、接近中心性（CC）、度中心性（DC）、特征向量中心性（EC）、網(wǎng)絡(luò)中心性（NC）、局部邊連通性（LAC）的值均大于中位數(shù)。

1.5 GO 分析和KEGG 通路富集分析利用Metascape 平臺(tái)〔23〕（https：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1）對(duì)篩選出的交集基因進(jìn)行GO 分析和KEGG 通路富集分析，GO 分析包括生物過程、分子功能和細(xì)胞組成。根據(jù)分析結(jié)果P 值和富集基因個(gè)數(shù)，以P＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出前10 條GO 分析結(jié)果和前20 條KEGG 通路富集分析結(jié)果。

1.6 分子對(duì)接技術(shù) 從PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)〔24〕（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載核心化合物結(jié)構(gòu)、RCSB 數(shù)據(jù)庫(kù)〔25〕（https：//www.rcsb.org/）下載靶點(diǎn)蛋白的3D 晶體結(jié)構(gòu)。使用PyMOL 2.4.0 軟件對(duì)靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行脫水并去除原始小分子配體，利用AutodockVina 軟件將化合物和靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行分子對(duì)接。以對(duì)接結(jié)合能來篩選結(jié)合活性較好的活性成分與靶點(diǎn)。研究流程見圖1。

圖1 復(fù)方龍血竭膠囊治療冠心病的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制研究流程圖

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方龍血竭膠囊的主要活性成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果使用Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫(kù)共獲得藥物靶點(diǎn)1 178 個(gè)，按剔除條件篩選后得到藥物靶點(diǎn)161 個(gè)，藥物靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的活性成分共81 個(gè)，龍血竭和三七中有2 個(gè)共同活性成分，分別是4-羥基苯乙酮（A1）和7-羥基黃酮（A2）。見表1。

表1 復(fù)方龍血竭膠囊活性成分

續(xù)表1

2.2 復(fù)方龍血竭膠囊干預(yù)冠心病相關(guān)靶點(diǎn)獲取結(jié)果在GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)中得到冠心病相關(guān)的作用靶點(diǎn)，結(jié)合DisGeNET、TTD、DrugBank 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行補(bǔ)充后，最終獲得與冠心病相關(guān)的疾病靶點(diǎn)9 496 個(gè)。將藥物活性成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交集，獲得交集靶點(diǎn)124 個(gè)。

2.3 “藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建結(jié)果運(yùn)用Cytoscape 3.9.0 軟件構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，此網(wǎng)絡(luò)由208 個(gè)節(jié)點(diǎn)和556 條邊構(gòu)成，每種活性成分對(duì)應(yīng)多個(gè)靶點(diǎn)，每個(gè)靶點(diǎn)連接多種成分，體現(xiàn)了復(fù)方龍血竭膠囊多成分、多靶點(diǎn)干預(yù)冠心病的作用機(jī)制。見圖2。根據(jù)連接度（Degree）篩選得到核心活性成分，分別為槲皮素、芹菜素、7，4'-二羥基黃酮、5，7，4'-三羥基-8-甲基黃酮、7，4'-二羥基黃烷酮、白藜蘆醇、5，7-二羥基黃酮、7-羥基黃酮、7-羥基黃烷酮、（9Z）-十六碳烯酸、7-羥基-4'-甲氧基黃烷、柚皮素。見表2。這些核心活性成分絕大部分為黃酮類化合物，由此推測(cè)黃酮類成分是復(fù)方龍血竭膠囊中治療冠心病的主要活性成分。

表2 復(fù)方龍血竭膠囊核心活性成分

圖2 復(fù)方龍血竭膠囊“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果將124 個(gè)交集靶點(diǎn)上傳至STRING 11.0 數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建出一個(gè)由121 個(gè)節(jié)點(diǎn)和852 條邊組成的靶蛋白PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。利用Cytoscape 3.9.0 軟件中的CytoNCA 插件經(jīng)過3 次篩選，最終獲得由6 個(gè)節(jié)點(diǎn)和15 條邊組成的PPI 核心網(wǎng)絡(luò)，關(guān)鍵靶點(diǎn)分別是AKT1、EGFR、AR、PTGS2、SRC、ESR1。見圖3、表3。

圖3 復(fù)方龍血竭膠囊PPI 網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選過程

表3 PPI 網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵靶點(diǎn)匯總

2.5 GO 分析和KEGG 通路富集分析結(jié)果利用Metascape 平臺(tái)對(duì)篩選出的124 個(gè)交集基因進(jìn)行GO 分析和KEGG 通路富集分析。GO 分析結(jié)果表明，復(fù)方龍血竭膠囊干預(yù)冠心病主要涉及炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)代謝和氧化應(yīng)激反應(yīng)等多個(gè)顯著相關(guān)生物過程；細(xì)胞組成主要涉及膜筏、突觸后膜、轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物和轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)、膜側(cè)等；分子功能涉及蛋白激酶活性、氧化還原酶活性、脂質(zhì)結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合和激酶結(jié)合等。見表4。KEGG 通路富集分析結(jié)果表明，復(fù)方龍血竭膠囊干預(yù)冠心病主要涉及PPAR 信號(hào)通路、核因子κB（nuclear factorκB，NF-κB）信號(hào)通路、癌癥通路、花生四烯酸代謝通路、鈣信號(hào)通路等。見圖4。

圖4 KEGG 通路富集分析結(jié)果

表4 GO 分析結(jié)果

2.6 分子對(duì)接結(jié)果將12 個(gè)核心活性成分與6 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，最終得到72 組受體-配體對(duì)接結(jié)果。見表5。根據(jù)結(jié)合能大小評(píng)估成分與靶點(diǎn)的結(jié)合能力，結(jié)合能＜-5.0 kcal/mol（1 kcal=4.186 kJ）表明兩者之間結(jié)合活性較佳，結(jié)合能＜-7.0 kcal/mol 表明兩者之間有強(qiáng)烈的對(duì)接活性。在72 組受體-配體的分子對(duì)接結(jié)果中，結(jié)合能＜-5.0 kcal/mol的組合有67 組，占93.1%；結(jié)合能＜-7.0 kcal/mol 的組合有53 組，占73.6%。其中6 個(gè)典型的化合物對(duì)接情況見圖5。從對(duì)接結(jié)果來看，核心活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)之間均具有強(qiáng)烈的對(duì)接活性，由此推測(cè)這些化合物可能在復(fù)方龍血竭膠囊治療冠心病的過程中發(fā)揮重要作用。

圖5 典型化合物對(duì)接結(jié)果示意圖

表5 分子對(duì)接結(jié)合能結(jié)果（kcal/mol）

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明冠心病發(fā)病是一個(gè)復(fù)雜的過程，主要涉及脂質(zhì)代謝紊亂、氧化應(yīng)激反應(yīng)、血管內(nèi)皮損傷和局部炎癥粥樣斑塊形成等病理變化〔26-27〕。本研究利用SwissADME 平臺(tái)進(jìn)行活性篩選，得到復(fù)方龍血竭膠囊治療冠心病的活性成分81個(gè)；獲得藥物和疾病交集靶點(diǎn)124 個(gè)，通過構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)以及GO 分析和KEGG 通路富集分析發(fā)現(xiàn)，復(fù)方龍血竭膠囊在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)等生物過程中都發(fā)揮著重要的作用，這與目前研究治療冠心病的機(jī)制相吻合，可為下一步深入研究提供一定的理論依據(jù)。

KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示，復(fù)方龍血竭膠囊用于治療冠心病的主要通路有NF-κB 信號(hào)通路、PPAR 信號(hào)通路、花生四烯酸代謝通路等，其中NFκB 信號(hào)通路是治療冠心病的一條重要的信號(hào)通路。NF-κB 被激活后會(huì)誘導(dǎo)大量炎癥因子和促炎因子的生成，如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factorα，TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白細(xì)胞介素-1β、細(xì)胞黏附分子-1、單核細(xì)胞趨化蛋白-1 等，從而加速冠狀動(dòng)脈斑塊的形成和破裂〔28〕，

導(dǎo)致病情惡化。在本研究篩選出的活性成分中，白藜蘆醇〔28〕和槲皮素〔29〕已被證實(shí)分別通過干擾NF-κB 信號(hào)通路的傳導(dǎo)和降低NF-κB 的表達(dá)發(fā)揮抗炎作用，從而減慢冠狀動(dòng)脈斑塊硬化過程。由此推測(cè)NF-κB 信號(hào)通路可能是復(fù)方龍血竭膠囊治療冠心病的關(guān)鍵通路。

PPAR 在包括動(dòng)脈粥樣硬化等多種慢性病中具有重要作用〔30〕。PPARβ/δ 信號(hào)通路可以通過2 條途徑在冠心病中發(fā)揮作用，一方面，PPARβ/δ 可以調(diào)節(jié)心臟抗氧化酶（Cu/Zn-超氧化物歧化酶、Mn-超氧化物歧化酶和過氧化氫酶）的表達(dá)，有助于保護(hù)心臟免受因內(nèi)源性脂肪酸氧化而導(dǎo)致的氧化損傷；另一方面，PPARβ/δ 的激活可以誘導(dǎo)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和糖酵解途徑基因的上調(diào)，從而提高心肌葡萄糖攝取和利用率〔31〕。通過分析可以發(fā)現(xiàn)，復(fù)方龍血竭膠囊通過作用于PPAR 信號(hào)通路，調(diào)節(jié)氧化損傷和能量消耗發(fā)揮治療冠心病的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方龍血竭膠囊治療冠心病的主要活性成分為槲皮素、芹菜素、7，4'-二羥基黃酮、5，7，4'-三羥基-8-甲基黃酮、7，4'-二羥基黃烷酮、白藜蘆醇、5，7-二羥基黃酮、7-羥基黃酮、7-羥基黃烷酮、（9Z）-十六碳烯酸、7-羥基-4'-甲氧基黃烷、柚皮素。分子對(duì)接結(jié)果顯示，復(fù)方龍血竭膠囊中的核心活性成分槲皮素、白藜蘆醇、柚皮素、7-羥基黃酮等與核心靶點(diǎn)的結(jié)合活性較強(qiáng)，提示這些化合物可能在復(fù)方龍血竭膠囊干預(yù)冠心病的過程中起關(guān)鍵作用。有研究表明，槲皮素具有抗炎、抗增殖、調(diào)節(jié)血脂和抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用，因此可作為預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的重要藥物〔32〕；白藜蘆醇通過誘導(dǎo)內(nèi)源性抗氧化途徑和抑制平滑細(xì)胞遷移途徑，發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用〔32〕；柚皮素不僅可以改善血脂〔33〕，還可以抑制炎癥因子，減少泡沫細(xì)胞的形成，下調(diào)與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的基因〔34〕；7-羥基黃酮通過下調(diào)一氧化氮合酶、環(huán)氧合酶2 的mRNA 表達(dá)，減少一氧化氮、前列腺素E2、TNF-α 和IL-6 等炎癥因子的產(chǎn)生，發(fā)揮治療冠心病的作用〔35〕。本研究還發(fā)現(xiàn)復(fù)方龍血竭膠囊中存在一些尚未被報(bào)道的活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)之間具有較強(qiáng)的親和力，如7，4'-二羥基黃酮、7，4'-二羥基黃烷酮、7-羥基黃烷酮等，這些活性成分亦可能在復(fù)方龍血竭膠囊治療冠心病中發(fā)揮重要作用。

本研究結(jié)果揭示了復(fù)方龍血竭膠囊在治療冠心病過程中呈現(xiàn)出多成分、多通路、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，其主要活性成分槲皮素、白藜蘆醇、柚皮素、7-羥基黃酮作用于NF-κB、PPAR、花生四烯酸代謝等通路，參與炎癥反應(yīng)、脂肪酸代謝、氧化應(yīng)激反應(yīng)來治療冠心病。