何思悅，唐紫云，劉 衡，張成桂，周 雯，畢子瑩，周 玥*

（1.大理大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，云南大理 671000；2.大理大學藥學院，云南大理 671000）

慢性髓細胞性白血病（chronic myelogenous leukemia，CML）是一種惡性骨髓增生性腫瘤，占成人白血病發(fā)病率的15%。目前酪氨酸激酶抑制劑是靶向治療的主要方式，但治療過程中易出現(xiàn)多種不良反應和副作用，對患者的治療和生活造成極大的影響〔1〕。近年來，中藥在白血病治療方面的作用得到廣泛關(guān)注，中藥在抑制細胞增殖、促進細胞凋亡、聯(lián)合放化療、逆轉(zhuǎn)多藥耐藥等方面效果顯著〔2〕。美洲大蠊Periplaneta americana L.隸屬蜚蠊科，古時多用于創(chuàng)傷修復、祛腐生肌、清熱解毒等，現(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)美洲大蠊具有增強免疫力、抗病毒等多種藥理活性，對多種腫瘤細胞有不同程度的抑制作用，而且原材料豐富，容易獲取，應用前景廣泛。有研究〔3-4〕表明，通過不同提取方法得到的多種美洲大蠊提取物對K562 細胞的增殖有不同程度的抑制作用，但具體機制尚不清楚。美洲大蠊提取物CⅡ-3 是提取于美洲大蠊的一種小分子肽〔5〕，主要通過抑制腫瘤細胞增殖、抑制腫瘤血管的生成及轉(zhuǎn)移、免疫調(diào)節(jié)、逆轉(zhuǎn)多藥耐藥等方面發(fā)揮其抗癌作用〔6〕。本研究探究美洲大蠊提取物CⅡ-3 對人白血病細胞K562 增殖的影響，為開發(fā)低毒有效的抗腫瘤藥物提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 材料美洲大蠊提取物CⅡ-3 由大理大學藥學院張成桂教授提供；K562 細胞（齊式生物科技有限公司）；RPMI1640 培養(yǎng)基（美侖生物公司，批號：C0039）；胎牛血清（Vivacell 公司，批號：2025067）；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）（北京索萊寶科技公司，批號：P1003）；細胞周期檢測試劑盒（KeyGEN BioTECH 公司，批號：KGA512）；磷酸化p53 抗體（Abcam 公司，批號：ab32132）；羊抗兔抗體（Sigma 公司，批號：40839）；ECL 增強化學發(fā)光檢測試劑盒（PIERCE 公司，批號：32209）。

1.2 儀器多功能酶標儀（BIO-RAD 公司）；高壓蒸氣滅菌器（Sanyo 公司）；生物安全柜（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（Sanyo 公司）；低速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；倒置顯微鏡（Motic 公司）；細胞計數(shù)板（上海醫(yī)用儀器廠）；流式細胞儀（Beckman 公司）；垂直板電泳轉(zhuǎn)移裝置（BIO-RAD 公司）；圖像分析系統(tǒng)（LabworksTM Analysis Software 公司）。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng) 用RPMI1640 培養(yǎng)基（含10% 胎牛血清）于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)K562 細胞，培養(yǎng)2～3 d 計數(shù)并傳代，取對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)實驗。

2.2 CCK-8 法檢測細胞增殖活性取對數(shù)生長期的K562 細胞，以1×105個/mL 的密度將細胞接種于96 孔板內(nèi)，每孔100 μL，實驗組分別加入終濃度為5、10、20、40、80、160 μg/mL 的CⅡ-3，每孔50 μL，每個濃度設(shè)置3 個復孔，并設(shè)空白對照組（僅有K562 細胞，不加CⅡ-3，以下簡稱“對照組”），置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)24、48、72 h，加入10 μL CCK-8 溶液，孵育2 h，酶標儀測定450 nm波長處的吸光度（OD）值，并計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率（%）=［（對照組OD 值-實驗組OD值）/（對照組OD 值-空白組OD 值）］×100%，其中，空白組僅有培養(yǎng)基，用于消除計算時培養(yǎng)基內(nèi)酚紅對OD 值的影響。

2.3 細胞集落形成實驗 收集對照組細胞和經(jīng)80 μg/mL CⅡ-3 處理72 h 的細胞并計數(shù)，以1×103個/mL的密度接種于24 孔板內(nèi)，每孔500 μL，每組設(shè)置3個復孔，于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育7 d，倒置顯微鏡下觀察并計數(shù)細胞集落數(shù)，以細胞數(shù)＞50 為1 個集落，計算細胞集落形成率和細胞集落抑制率。細胞集落形成率（%）=（細胞平均集落數(shù)/每孔加入的細胞數(shù)）×100%；細胞集落抑制率（%）=［（對照組細胞集落數(shù)-實驗組細胞集落數(shù)）/對照組細胞集落數(shù)］×100%。

2.4 流式細胞術(shù)分析細胞周期收集對照組細胞和經(jīng)80 μg/mL CⅡ-3 處理72 h 的細胞，預冷PBS洗滌，加入1 mL 75%乙醇吹打混勻，4 ℃固定過夜。1 000 r/min 離心后收集細胞，PBS 洗滌，加入碘化丙啶染色液，37 ℃避光溫浴30 min，流式細胞儀測定488 nm 波長處熒光強度。

2.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測磷酸化p53 蛋白表達 收集對照組細胞和經(jīng)80 μg/mL CⅡ-3 處理72 h 的細胞，PBS 洗滌，加入蛋白裂解液提取總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，取20 μg 蛋白進行上樣。經(jīng)電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h，加入一抗磷酸化p53（1∶500 稀釋），4 ℃孵育過夜，TBST 緩沖液洗滌條帶3 次，加入二抗（1∶1 000 稀釋）孵育1.5 h，ECL 曝光液顯色后凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，測定蛋白條帶灰度值，計算蛋白相對表達量。

2.6 統(tǒng)計分析采用SPSS 26.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以（）表示，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 CⅡ-3 對K562 細胞增殖的影響CCK-8 法檢測結(jié)果顯示：24、48、72 h 時，不同濃度的CⅡ-3對K562 細胞的增殖均有抑制作用，隨著作用時間延長，大多數(shù)濃度CⅡ-3 對K562 細胞增殖抑制作用增強，因此，選擇72 h 作為培養(yǎng)時間。在作用時間為72 h 時，CⅡ-3 濃度為80 μg/mL，細胞增殖抑制率最高，與大多數(shù)作用濃度和作用時間相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。因此，選擇80 μg/mL CⅡ-3 作用72 h 進行后續(xù)實驗。

表1 CⅡ-3 對K562 細胞增殖的抑制率（%，，n=3）

表1 CⅡ-3 對K562 細胞增殖的抑制率（%，，n=3）

注：在作用時間相同的情況下，與80 μg/mL CⅡ-3 比較*P＜0.05；CⅡ-3 濃度為80 μg/mL 時，與作用72 h 比較△P＜0.05。

3.2 CⅡ-3 對K562 細胞集落形成能力的影響與對照組相比，80 μg/mL CⅡ-3 作用于K562 細胞72 h 后，實驗組細胞集落數(shù)明顯減少，細胞集落形成率顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表2、圖1。

圖1 CⅡ-3 對K562 細胞集落形成能力的影響（×100）

表2 CⅡ-3 對K562 細胞集落形成能力的影響（，n=3）

表2 CⅡ-3 對K562 細胞集落形成能力的影響（，n=3）

注：與對照組相比**P＜0.01。

3.3 CⅡ-3 對K562 細胞周期的影響流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，80 μg/mL CⅡ-3 作用于K562 細胞72 h 后，G0/G1 期細胞比例明顯升高，S 期細胞比例顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表3、圖2。

圖2 CⅡ-3 對K562 細胞周期的影響

表3 CⅡ-3 對K562 細胞周期的影響（%，，n=3）

表3 CⅡ-3 對K562 細胞周期的影響（%，，n=3）

注：與對照組相比**P＜0.01。

3.4 CⅡ-3 對K562 細胞磷酸化p53 蛋白表達的影響蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，與對照組相比，80 μg/mL CⅡ-3 作用72 h 后，磷酸化p53 蛋白表達水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖3。

圖3 CⅡ-3 對K562 細胞磷酸化p53 蛋白表達的影響

4 討論

CML 是一種起源于造血干細胞的骨髓增生性疾病，化療是目前臨床上主要治療方案，但化療所導致的副作用極大地影響患者的治療效果和生活質(zhì)量〔7〕。因此，尋找高效、低毒副作用的藥物成為治療的新目標〔8〕。

高三尖杉酯堿是從我國特有植物粗榧中提取的一種生物堿，研究〔9〕表明其具有抗腫瘤活性，對K562 細胞有抑制增殖、誘導凋亡、阻滯細胞周期等作用，在臨床治療中，廣泛用于治療急性髓系白血病、慢性粒細胞白血病和骨髓增生異常綜合征，2012 年被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準用于治療伊馬替尼耐藥的CML 患者，由此可見中藥在白血病治療方面有著很大的潛力。美洲大蠊，古時稱蜚蠊，其藥用價值最早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載，具有活血散瘀的功效〔10〕。有研究〔11〕結(jié)果表明，美洲大蠊在抗肺癌、肝癌、胃癌、結(jié)腸癌等方面療效顯著，有著良好的應用前景。

研究〔3〕表明，美洲大蠊提取物對K562 細胞、人原髓細胞白血病HL-60 細胞和小鼠淋巴樣瘤P388D1 細胞的生長均有抑制作用。本研究中，CCK-8法測定結(jié)果顯示，美洲大蠊提取物CⅡ-3 濃度為80 μg/mL、作用72 h 時，對K562 細胞增殖抑制率最高，為（57.8±1.0）%，故選擇此濃度及作用時間進行后續(xù)實驗。集落形成實驗可以直觀地反映腫瘤細胞的群體依賴性和增殖能力〔12〕，經(jīng)80 μg/mL CⅡ-3作用72 h 的K562 細胞其集落形成能力明顯下降，以上結(jié)果說明CⅡ-3 能夠抑制K562 細胞增殖。

細胞增殖依賴于正常的細胞周期進程，包括G0/G1 期、S 期、G2 期、M 期4 個時期，癌細胞的細胞周期調(diào)節(jié)失調(diào)，細胞無限增殖分裂〔13〕，這種異常的細胞周期進程是導致腫瘤發(fā)生的基本機制之一〔14〕。處于G0/G1 期的細胞被稱為靜止期或非增殖狀態(tài)，將腫瘤細胞阻滯在該周期，就能達到抑制腫瘤細胞增殖的目的〔15〕。本研究中，流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，與對照組相比，實驗組阻滯在G0/G1 期的K562細胞顯著增加，S 期的細胞明顯減少，由此可知CⅡ-3通過阻滯腫瘤細胞周期，從而抑制K562 細胞增殖。

p53 蛋白可以使細胞周期阻滯在G1 期，還可以間接抑制細胞周期依賴激酶的活性，進一步抑制細胞增殖〔16〕。有研究〔17〕表明，姜黃素衍生物能夠通過上調(diào)p53 蛋白表達水平導致細胞周期阻滯，抑制細胞增殖。p53 蛋白的磷酸化與癌癥關(guān)系密切，p53蛋白的磷酸化水平增加可以抑制腫瘤的形成〔18〕。p53 蛋白的磷酸化修飾是穩(wěn)定和增強p53 蛋白轉(zhuǎn)錄活性的關(guān)鍵〔19〕，因此，本研究中檢測了磷酸化p53蛋白的表達，與對照組相比，CⅡ-3 誘導后的K562細胞磷酸化p53 蛋白表達水平升高，提示CⅡ-3 通過調(diào)控p53 蛋白抑制K562 細胞增殖。

本研究探討了美洲大蠊提取物CⅡ-3 對K562細胞增殖的影響，結(jié)果表明，CⅡ-3 可以抑制K562細胞的增殖，降低細胞集落形成率，使阻滯在G0/G1期的細胞比例增加，S 期的細胞比例減少，并上調(diào)p53 蛋白的表達。該結(jié)果為后續(xù)進行深入研究其具體機制奠定了基礎(chǔ)，為美洲大蠊提取物CⅡ-3 的臨床應用提供新思路。