李威倩，陳奕明，張文婷，蘇瑩珍，帥紅艷，Yu Xin*

（1.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000；2.大理大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000；3.昆明學(xué)院醫(yī)學(xué)院，昆明 650214）

胰腺癌是發(fā)生于消化系統(tǒng)中惡性程度最高的腫瘤〔1〕。目前胰腺癌已成為全球第12 位常見的惡性腫瘤，是全球癌癥病死的第7 大原因，也是中國(guó)第6 大癌癥病死原因〔2〕。預(yù)計(jì)在未來30 年內(nèi)胰腺癌將成為美國(guó)癌癥病死的第2 大原因〔3〕，歐洲與癌癥相關(guān)的第3 大病死原因〔4〕。因此，胰腺癌被稱為“癌癥之王”〔1，5〕。根治性手術(shù)治療是目前唯一有效的治療方法，但由于胰腺癌發(fā)病隱匿，早期難以確診，超過80 %的患者確診時(shí)已是晚期，手術(shù)治療效果不佳〔6〕。即使對(duì)早期胰腺癌患者可行根治性手術(shù)并輔以放化療和靶向治療，但大多數(shù)患者術(shù)后存在局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，術(shù)后5 年生存率仍不足10 %〔7-8〕。因此，有必要探索新的方法提高胰腺癌早期診斷率和改善患者的生存及預(yù)后。

目前，國(guó)內(nèi)外研究人員逐漸把研究重點(diǎn)放到了分子靶向治療方向，尋找有效的生物標(biāo)志物既有助于提高胰腺癌的早期診斷率，又有利于探索新的胰腺癌治療靶點(diǎn)，從而提供新的治療思路。隨著高通量基因組技術(shù)和基因芯片技術(shù)的興起，使針對(duì)胰腺癌研究的二次分析成為可能。其中，基因表達(dá)綜合（gene expression omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）收錄了各國(guó)研究人員及機(jī)構(gòu)提交的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，主要包括基因芯片、高通量測(cè)序數(shù)據(jù)，研究者可以在GEO 數(shù)據(jù)庫搜索已發(fā)表的論文中涉及基因表達(dá)檢測(cè)的數(shù)據(jù)。本研究旨在利用生物信息學(xué)方法對(duì)GEO 數(shù)據(jù)庫中的胰腺癌基因芯片數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析，挖掘胰腺癌的差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs），并針對(duì)DEGs 在人胰腺癌及癌旁組織中的表達(dá)水平進(jìn)行研究，為探索胰腺癌的發(fā)病機(jī)制和潛在的治療靶點(diǎn)提供新的線索和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)資料檢索與收集以“pancreatic cancer”或“pancreatic adenocarcinoma”為關(guān)鍵詞，在GEO 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索。納入標(biāo)準(zhǔn)：種屬“Homo sapiens”；同時(shí)具備腫瘤組織與配對(duì)正常組織。經(jīng)過檢索后選擇平臺(tái)GPL15207 上的數(shù)據(jù)集GSE107610。該數(shù)據(jù)集中包含胰腺癌組織樣本39 例（GSM2872497～GSM2872551），正常組織樣本2 例（GSM2872552～GSM2872553）。

1.2 DEGs 的確定對(duì)數(shù)據(jù)集GSE107610 中的矩陣數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選，選取其中的基因ID 號(hào)及基因表達(dá)水平。利用R 語言中的“Limma”軟件包對(duì)上述數(shù)據(jù)進(jìn)行分析以確定數(shù)據(jù)集中的DEGs，設(shè)定篩選條件為P＜0.05，|log2FC|＞1。

1.3 DEGs 的生物信息學(xué)分析利用R 語言，對(duì)篩選出的DEGs 進(jìn)行GO 分析和KEGG 通路富集分析。在STRING 數(shù)據(jù)庫（http：//www.string-db.org）中導(dǎo)入DEGs 進(jìn)行分析，尋找DEGs 對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)之間可能存在的相互作用關(guān)系，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)。將靶蛋白文件導(dǎo)入Cytoscape 軟件，應(yīng)用“cytohubba”軟件包計(jì)算出PPI 網(wǎng)絡(luò)中前15 個(gè)連通性較高的蛋白質(zhì)，其對(duì)應(yīng)的基因?yàn)楹诵幕颉?/p>

1.4 核心基因表達(dá)驗(yàn)證經(jīng)患者知情同意，選取在大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院行胰腺癌切除術(shù)的胰腺癌患者的腫瘤組織及癌旁組織各3 例。為確認(rèn)癌組織和癌旁組織的病理差異，取部分樣本，在4 %甲醛固定液中固定24 h，流水沖洗30 min，脫水透明、石蠟包埋、4 μm 連續(xù)切片，經(jīng)蘇木精-伊紅染色（hematoxylin and eosin staining，HE 染色）后在光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理表現(xiàn)。

篩選出4 個(gè)核心基因，通過實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)核心基因在胰腺癌組織及癌旁組織中mRNA 的表達(dá)。取部分組織樣本，使用FastPure Cell/Tissue Total RNA Isolation 試劑盒（Vazyme 公司）提取癌組織及癌旁組織中的總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Vazyme公司）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)，熒光試劑采用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme 公司），反應(yīng)條件：95 ℃10 s，60 ℃30 s。引物序列見表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)分析采用GraphPad Prism 8.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩樣本均數(shù)的比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DEGs 的篩選對(duì)GEO 數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次分析，篩選出與胰腺癌相關(guān)聯(lián)的潛在分子靶點(diǎn)。對(duì)從GEO 數(shù)據(jù)庫獲得的GSE107610 數(shù)據(jù)集進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，篩選該數(shù)據(jù)集中差異表達(dá)水平超過2倍且校正后P＜0.05 的基因進(jìn)行后續(xù)研究，其中上調(diào)基因17 個(gè)，下調(diào)基因54 個(gè)。見表2。

表2 胰腺癌差異表達(dá)基因的篩選

2.2 GO 分析與KEGG 通路富集分析GO 分析主要包括3 個(gè)方面：分子功能、細(xì)胞組成和生物過程，分別描述了基因產(chǎn)物可能行使的分子功能、所處的細(xì)胞環(huán)境以及參與的生物過程。KEGG 通路富集分析從分子水平對(duì)基因參與的高級(jí)功能和信號(hào)通路進(jìn)行分析。GO 分析和KEGG 通路富集分析將微觀的DEGs 總結(jié)為宏觀的功能信息，揭示基因及其功能的關(guān)系。GO 分析結(jié)果表明，在分子功能方面，DEGs 主要集中在調(diào)控乙醇脫氫酶、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、視黃醇結(jié)合蛋白等的活性；在細(xì)胞組成方面，DEGs 主要表達(dá)在細(xì)胞外間隙、血小板α 顆粒，參與刷狀緣膜、細(xì)胞膜的組成成分；在生物過程方面，DEGs 主要參與蛋白質(zhì)水解、酒精代謝、外源性代謝、消化、免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程。見表3。

表3 DEGs 的GO 分析結(jié)果

KEGG 通路富集分析顯示，DEGs 主要參與的信號(hào)通路為蛋白質(zhì)的消化和吸收、細(xì)胞色素P450參與的藥物和外源性物質(zhì)代謝、化學(xué)致癌作用、谷胱甘肽代謝、視黃醇代謝等。見表4。

表4 DEGs 的KEGG 通路富集分析結(jié)果

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析將DEGs 上傳至STRING 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。PPI 網(wǎng)絡(luò)共包含68 個(gè)節(jié)點(diǎn)和142 個(gè)連接，將獲得的分析數(shù)據(jù)按綜合分?jǐn)?shù)>0.15 進(jìn)行篩選后下載。見圖1A。把數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 中后通過cytohubba 插件獲得連接度最高的前15 個(gè)核心基因：OTC，ACE2，SLC26A3，RBP2，SLC10A2，MEP1B，CES2，CYP3A4，GSTA2，ADH4，CPA2，ADH1A，CELA3A，REG1B，ANPEP。見圖1B。

圖1 DEGs 的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖與核心基因篩選結(jié)果

2.4 核心基因表達(dá)驗(yàn)證選取臨床患者部分胰腺癌組織與癌旁組織樣本進(jìn)行HE 染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察，胰腺癌組織樣本較癌旁組織樣本不規(guī)則腺體明顯增多，細(xì)胞異型性顯著。見圖2A～B。

圖2 胰腺癌組織及癌旁組織的病理形態(tài)圖（HE，×200）

選擇CPA2、ANPEP、ACE2、CELA3A 4 個(gè)核心基因，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 對(duì)胰腺癌組織及癌旁組織中的mRNA 表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明在胰腺癌組織中，CPA2、ANPEP 較癌旁組織顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖3A～B。CELA3A、ACE2 基因中mRNA 表達(dá)水平在胰腺癌組織的表達(dá)較癌旁組織明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3C～D。

圖3 胰腺癌組織及癌旁組織中的部分核心基因表達(dá)情況

3 討論

胰腺癌是高度惡性的消化系統(tǒng)腫瘤，發(fā)病隱蔽，臨床治療效果不佳，5 年生存率低，預(yù)后極差〔9〕。胰腺癌的發(fā)病機(jī)制和如何改善患者預(yù)后依舊是臨床及基礎(chǔ)研究領(lǐng)域尚未攻克的難題。本研究通過生物信息學(xué)方法探索在胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用的核心基因，為發(fā)現(xiàn)潛在治療胰腺癌的靶點(diǎn)和早期診斷標(biāo)志物提供思路。

本研究分析了基因表達(dá)譜GSE107610 中的39例胰腺癌組織樣本和2 例正常組織樣本，篩選出71個(gè)符合條件的DEGs，其中上調(diào)DEGs 17 個(gè)，下調(diào)DEGs 54 個(gè)。GO 分析及KEGG 通路富集分析表明這些DEGs 主要參與調(diào)節(jié)乙醇脫氫酶活性、蛋白質(zhì)水解、酒精代謝及消化等過程。胰腺是重要的分泌腺體，其外分泌液中含有胰蛋白酶，對(duì)小腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化（將蛋白質(zhì)或大的縮氨酸分解成小的縮氨酸）具有關(guān)鍵作用〔10-11〕，生物信息學(xué)的數(shù)據(jù)分析結(jié)果與胰腺的功能一致。

依據(jù)關(guān)聯(lián)度將篩選出排名前15 的核心基因分為4 個(gè)等級(jí)，每個(gè)等級(jí)抽選1 個(gè)基因即ACE2、CPA2、CELA3A、ANPEP 進(jìn)行驗(yàn)證。在mRNA 水平，胰腺癌組織中CPA2、ANPEP 的表達(dá)相較癌旁組織降低，ACE2、CELA3A 的表達(dá)較癌旁組織增高。其中胰腺癌組織中ACE2、CELA3A 在mRNA 水平的表達(dá)與生物信息學(xué)分析結(jié)果略有差異，即表現(xiàn)為高表達(dá)，這一差異可能受腫瘤分期、病變組織分化程度及種族差異等多種因素影響導(dǎo)致。研究〔12-15〕發(fā)現(xiàn)，腫瘤標(biāo)志物的表達(dá)會(huì)因腫瘤病變部位及腫瘤分期等不同而發(fā)生變化，ACE2、CELA3A 在胰腺癌中的具體變化情況，需要后續(xù)對(duì)更多臨床樣本進(jìn)行分析與確認(rèn)。

ACE2 作為關(guān)聯(lián)性最強(qiáng)的核心基因，在腎素-血管緊張素系統(tǒng)中起到重要作用〔16〕。Yu 等〔17〕通過研究發(fā)現(xiàn)，ACE2 在胰腺中表達(dá)并且可以通過抑制p38 MAPK/NF-κB 信號(hào)通路保護(hù)胰腺。周琳等〔18〕通過構(gòu)建過表達(dá)ACE2 基因的胰腺癌BxPC3 細(xì)胞株發(fā)現(xiàn)，ACE2 可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。上述研究提示，ACE2 可能在胰腺癌發(fā)生過程中發(fā)揮抑癌基因的作用，未來可能成為胰腺癌治療的新靶點(diǎn)。

CPA2 屬于金屬蛋白酶家族，由胰腺外分泌腺細(xì)胞分泌，參與蛋白質(zhì)的分解代謝過程〔13〕。但目前鮮有關(guān)于CPA2 與胰腺癌的報(bào)道，其與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展是否有關(guān)還有待進(jìn)一步研究。本研究中，通過對(duì)CPA2 在組織中的差異表達(dá)分析可以看出CPA2 在胰腺癌組織中的表達(dá)明顯降低，這表明CPA2 可作為胰腺癌早期診斷的潛在標(biāo)志物。

ELA3A 在腸道中參與蛋白質(zhì)的消化和膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)代謝〔19〕。目前，對(duì)于CELA3A 與胰腺癌的相關(guān)性尚不明確。但研究人員發(fā)現(xiàn)，ELA3B 作為CELA3A 的同工酶，在胰腺癌組織中ELA3B 基因的甲基化程度顯著增加，揭示了該基因啟動(dòng)子區(qū)的高度甲基化導(dǎo)致了該基因在胰腺癌組織中的低表達(dá)〔20〕。綜上所述，CELA3A 的低表達(dá)可能與其DNA 甲基化有關(guān)，可以在后續(xù)研究中對(duì)此機(jī)制進(jìn)行深入探討，利用表觀遺傳學(xué)及蛋白翻譯后修飾方法探索胰腺癌新的發(fā)生機(jī)制，從而提供胰腺癌診斷的新靶點(diǎn)。

ANPEP/CD13 是一種鋅依賴性肽酶，參與各種肽的代謝、血管形成及腫瘤生長(zhǎng)〔21〕。ANPEP 已經(jīng)被證實(shí)在多種腫瘤性疾病中呈高表達(dá)〔22-24〕，可作為檢測(cè)腫瘤進(jìn)展的標(biāo)志物。值得注意的是，在某些癌癥如腎癌組織中，ANPEP 的表達(dá)較正常組織是降低的〔25〕；在結(jié)腸癌患者的腫瘤組織和血漿中，腫瘤組織ANPEP 高表達(dá)患者的生存期較長(zhǎng)，而血漿ANPEP高表達(dá)意味著患者較差的生存期〔26〕。在本研究中，ANPEP 在胰腺癌組織中也有較低的表達(dá)，由此說明ANPEP 的表達(dá)可能取決于癌癥的類型和部位，后續(xù)需要更多臨床數(shù)據(jù)來確認(rèn)，但不能否認(rèn)ANPEP 仍是有前景的癌癥生物標(biāo)志物，可用于癌癥的早期診斷和治療。

本研究利用生物信息學(xué)分析方法對(duì)胰腺癌的DEGs 進(jìn)行了篩選，確定了部分核心基因ACE2、CPA2、CELA3A、ANPEP 與胰腺癌發(fā)生、發(fā)展有關(guān)的分子功能和通路，盡管生物信息學(xué)分析方法能夠通過整合數(shù)據(jù)為探索胰腺癌的發(fā)生機(jī)制提供一定的思路，但是其真實(shí)性和在臨床樣本中的變化依然需要實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，本研究有效地結(jié)合了生物信息學(xué)方法與臨床樣本分析方法，為探索胰腺癌發(fā)生過程中標(biāo)志物水平變化提供了依據(jù)，有望為胰腺癌的早期診斷和治療提供新的思路。隨著后續(xù)臨床樣本數(shù)據(jù)規(guī)模的擴(kuò)大，有效結(jié)合生物信息學(xué)及臨床結(jié)果將更有效地發(fā)現(xiàn)胰腺癌的內(nèi)在發(fā)生機(jī)制，為更好地尋找胰腺癌的早期診斷甚至是治療方法提供全新思路。