趙婷婷，裴 科*，于子涵，曹 崗，李慧峰，孔祥鵬，張朔生，孫 琳，劉玉杰，蔡 皓

1.山西中醫(yī)藥大學中藥與食品工程學院，中藥炮制山西省重點實驗室，山西 晉中 030619

2.南京中醫(yī)藥大學藥學院，國家教育部中藥炮制規(guī)范化及標準化工程研究中心，江蘇 南京 210023

3.浙江中醫(yī)藥大學藥學院，中藥炮制研究中心，浙江 杭州 310053

4.山西中醫(yī)藥大學中藥與食品工程學院，山西省現代中藥工程實驗室，山西 晉中 030619

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalimembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao 或膜莢黃芪A.membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根，其味甘，性溫，歸足太陰脾、手太陰肺經；功效為補中益氣、升陽舉陷、益衛(wèi)固表[1]。黃芪的炮制方法眾多，在歷代醫(yī)書[2-3]中記載有蜜炙、米炒、酒炒、鹽水炒、乳汁炒、米泔水炒、姜汁炒等方法，其中蜜炙法是記載最多并且沿用至今的炮制方法。蜜炙黃芪最早出現于《華佗神方》[4]，經過歷史長河的篩選，目前是被《中國藥典》2020 版所收載的唯一黃芪炮制品?，F代研究證明，蜂蜜作為中藥中常用的一類輔料，它的添加可提高中藥中一些化學成分的穩(wěn)定性[5]，同時提高部分活性成分的生物利用度；此外有研究表明蜂蜜的天然深共晶特性也是其提高中草藥功效和安全性的原因之一[6]。對于黃芪蜜炙后化學成分的變化機制研究，以往都是以小分子成分的變化規(guī)律為主，有研究發(fā)現黃芪在清炒和蜜炙后很多小分子有機物含量下降[7]。肖滿珊[8]研究發(fā)現黃芪蜜炙后總黃酮類成分有所減少，總皂苷類成分有所增加。蜂蜜中含有大量的葡萄糖和果糖，還有少量的蔗糖、麥芽糖[9]。然而蜜炙之后黃芪中糖類組分的變化目前很少有文獻報道，因此有必要運用糖組學從整體上研究黃芪蜜炙后糖類組分的變化。本研究首次整合糖組學和代謝組學的方法進行了黃芪蜜炙后糖類組分和非糖類組分整體變化的研究，來觀察蜜炙對黃芪各組分的綜合影響。

近年來，代謝組學結合糖組學從整體角度來研究中藥炮制前后成分變化的方法被廣泛應用于中藥研究領域[10-12]，不同于以往的研究只有一個或者幾個指標性成分，這2 種方法結合可通過同時分析糖類組分和非糖類組分，從整體上解釋中藥炮制前后成分的改變。本實驗參考文獻方法[10-11,13]，應用UPLC（C18）-PDA、HPLC（NH2）-ELSD、高效凝膠滲透色譜（HPGPC）-ELSD 和超高效液相色譜質譜（UHPLC-Q-Orbitrap HRMS）等技術，基于代謝組學和糖組學方法，對黃芪蜜炙前后的糖類組分和非糖類組分進行系統(tǒng)的比較研究，為黃芪蜜炙后明確補中益氣功效增強的物質基礎提供參考。

1 材料

1.1 儀器

HC-2518 型高速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；旋轉蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；KQ2200E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Q-Exactive 型四級桿-靜電場軌道阱高分辨質譜儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；Waters 2695 型高效液相色譜儀、Waters 2998 型蒸發(fā)光散射器（ELSD）、Acquity UHPL 超高效液相（美國沃特世公司）；HH-4 型數顯恒溫水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司）；臺式干燥箱（北京中興偉業(yè)世紀儀器有限公司）。

1.2 試劑

乙腈、甲醇（賽默飛世爾科技有限公司）為質譜純；甲酸（天津市光復精細化工研究所）為色譜純；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）購自上海麥克林生化科技有限公司；土蜂蜜（批號GB14963）購自江西意蜂實業(yè)有限公司；超純水。

對照品D-(＋)-木糖（純度≥99%，批號D17N9S74410)、D-阿拉伯糖（純度≥99%，批號Z23D11H135480)、D-半乳糖（純度≥98%，批號Z22J9H64187)、D-(＋)-半乳糖醛酸（純度≥98%，批號K07J12B133073）、D-甘露糖（純度≥98%，批號S08J12G137083）、D-巖藻糖（純度≥98%，批號M23F8K29918）、鼠李糖（純度≥98%，批號O12A10K95105）、D-果糖（純度≥99%，批號J25N10R104151）、蔗糖（純度≥98%，批號H22J9R53193）、水蘇糖（純度≥98%，批號J04D10R104841）、麥芽糖（純度≥98%，批號RM0331FC14）、蜜二糖（純度≥98%，批號K23M7S15176）、甘露三糖（純度≥98%，批號L01J11Y117030）均購自上海源葉生物科技有限公司；右旋糖酐相對分子質量標準（1 套，批號140637-201203）購于中國食品藥品檢定研究院；D-葡萄糖（純度＞98%，批號50-99-7）購于北京索萊寶科技有限公司；芒柄花苷（質量分數＞98%，批號 201130）購于上海融禾醫(yī)藥科技有限公司；毛蕊異黃酮葡萄糖苷（質量分數≥98%，批號5240）、芒柄花素（質量分數≥98%，批號3524）購于上海詩丹德標準技術服務有限公司；黃芪甲苷（質量分數≥98.5%，批號C10735032）購于上海麥克林生化科技有限公司；5-羥甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfural，5-HMF，質量分數≥98%，批號H12M9Z61023）購于上海源葉生物科技有限公司。

1.3 藥材

黃芪飲片（批號211004、211005、211009、211012、211015、211020）購自北京同仁堂（四川）健康藥業(yè)有限公司，經山西中醫(yī)藥大學中藥與食品工程學院中藥炮制重點實驗室張朔生教授鑒定為蒙古黃芪A.membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao 干燥根的生品飲片。

2 方法與結果

2.1 蜜炙黃芪的制備

取煉蜜，加適量開水稀釋，按照《中國藥典》2020年版通則0213 炮制通則蜜炙法，將煉蜜淋入一定量的生黃芪飲片中，拌勻，悶潤8～10 h，悶透，將悶潤好的黃芪置炒鍋中，用文火炒至飲片不黏手，搓之即散，顏色深黃，略帶焦斑，取出，放涼，備用。

2.2 黃芪和蜜炙黃芪多糖的制備

取黃芪和蜜炙黃芪藥材飲片（批號211004）各50 g，先后分別加8、6 倍量的去離子水，在100 ℃煎煮2 次，每次2 h，合并提取液，減壓濃縮至一定體積，緩緩加入無水乙醇至最終醇體積分數為70%，靜置過夜，抽濾，上清液60 ℃揮干得小分子成分部位備用，沉淀60 ℃烘干得黃芪和蜜炙黃芪粗品多糖粉末。

各取半份黃芪和蜜炙黃芪粗品多糖粉末，200 mL 超純水溶解，加入木瓜蛋白酶0.05 g（200 U），45 ℃下恒溫水浴反應6 h，加原溶液體積1/3量10%的三氯乙酸，在冰浴中攪拌15 min 后靜置30 min，3500 r/min 離心15 min，棄去沉淀，上清液冷凍干燥得黃芪和蜜炙黃芪總多糖。

2.3 黃芪和蜜炙黃芪多糖的組分表征

2.3.1 黃芪和蜜炙黃芪多糖的重均相對分子質量（Mw）分布范圍分析

（1）對照品溶液制備：精密稱取Mw分別為180、2700、9750、13 050、36 800、64 650、135 350、300 600、2 000 000 的右旋糖苷對照品適量，用超純水溶解并定容至1 mL 的量瓶，配制成質量濃度為2 mg/mL的對照品溶液，13 000 r/min 離心15 min，0.22 μm微孔濾膜濾過，供進樣分析。

（2）供試品溶液制備：精密稱取“2.2”項下的黃芪和蜜炙黃芪粗多糖適量，分別加超純水定容至1 mL，配制成質量濃度為15 mg/mL 的供試品溶液。13 000 r/min 離心15 min，0.22 μm 微孔濾膜濾過，供進樣分析。

（3）色譜條件：參考文獻報道[10-11,13]，采用TSK-GEL G4000PWXL 凝膠柱（300 mm×7.8 mm，10 μm）色譜柱，柱溫35 ℃，流動相為超純水，體積流量0.5 mL/min，進樣體積10 μL，ELSD 漂移管溫度115 ℃，N2體積流量3.2 L/min。

2.3.2 黃芪和蜜炙黃芪多糖的單糖組成分析

（1）對照品溶液的制備：取各單糖對照品適量，精密稱定，分別用超純水溶解并定容，制成甘露糖2.11 mg/mL、鼠李糖2.01 mg/mL、半乳糖醛酸2.06 mg/mL、葡萄糖2.04 mg/mL、阿拉伯糖2.09 mg/mL、木糖2.00 mg/mL、巖藻糖2.03 mg/mL、半乳糖2.05 mg/mL 的單一對照品溶液。精密吸取各單一對照品溶液200 μL，加入氨水溶液和0.5 mol/L 的PMP 甲醇溶液各200 μL，混合，70 ℃反應30 min，冷卻，加入200 μL 冰醋酸中和溶液，再加1 mL 氯仿萃取3 次，有機相棄，吸取全部上清液稀釋10 倍，13 000 r/min 離心15 min，0.22 μm 微孔濾膜濾過后供進樣。

（2）供試品溶液的制備：精密稱取“2.2”項下的黃芪和蜜炙黃芪總多糖適量，分別加超純水定容至10 mL，配制成15 mg/mL 的多糖溶液。精密吸取多糖溶液各0.5 mL，加入3 mol/L 三氟乙酸3 mL，封口，100 ℃水解3 h，冷卻，60 ℃烘干，加入1 mL超純水復溶，即得黃芪和蜜炙黃芪多糖水解液。精密吸取多糖水解液500 μL，加入氨水溶液和0.5 mol/L 的PMP 甲醇溶液各100 μL，混合，70 ℃反應30 min，冷卻，加入100 μL 冰醋酸中和溶液，再加0.5 mL 氯仿萃取3 次，有機相棄，吸取全部上清液稀釋10 倍，13 000 r/min 離心15 min，即得黃芪和蜜炙芪多糖水解液衍生化樣品，0.22 μm 微孔濾膜濾過后供進樣。

（3）色譜條件：參考文獻報道[10-11,13]，采用Hypersil Gold C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），設置柱溫35 ℃，流動相為乙腈-0.1 mol/L 乙酸銨水溶液，梯度洗脫：0～5 min，15%～20%乙腈；5～30 min，20%～28%乙腈；30～31 min，28%～15%乙腈；31～33 min，15%乙腈；體積流量0.8 mL/min；進樣量10 μL；檢測波長250 nm。

2.3.3 黃芪和蜜炙黃芪中寡糖及果糖的分析

（1）對照品溶液制備：取各寡糖及果糖對照品適量，精密稱定，分別用60%乙腈溶解并定容，制成甘露三糖1.00 mg/mL、蔗糖1.22 mg/mL、麥芽糖1.04 mg/mL、蜜二糖1.01 mg/mL、水蘇糖1.04 mg/mL、果糖1.12 mg/mL 的單一對照品溶液。

（2）供試品溶液制備：精密稱取“2.2”項下黃芪和蜜炙黃芪小分子成分部位適量，用超純水溶解并定容至10 mL 量瓶中，配制成15 mg/mL 的溶液，精密吸取1 mL，60 ℃蒸干，用60%乙腈溶解并定容至10 mL，13 000 r/min 離心15 min，0.22 μm 微孔濾膜濾過后供進樣。

（3）色譜條件：參考文獻報道[10-11,13]，采用Agilent ZORBAX NH2 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；柱溫35 ℃；流動相為乙腈-水（70∶30）；體積流量1 mL/min；進樣量10 μL；ELSD 漂移管溫度100 ℃；N2體積流量3.2 L/min。

2.3.4 黃芪和蜜炙黃芪游離單糖分析 取“2.2”項下黃芪和蜜炙黃芪小分子成分部位150 mg，用超純水溶解并定容至10 mL 量瓶，配制成15 mg/mL 的溶液，精密吸取100 μL，按“2.3.2（2）”項下方法衍生化制備供試品溶液，并采用“2.3.2”項下色譜條件進行檢測。因果糖為酮糖，無法進行PMP 衍生化，采用“2.3.3（3）”項下方法進行檢測。

2.3.5 單糖和寡糖測定的方法學考察

（1）線性關系和范圍：分別取衍生化后單糖的混合對照品以及果糖和蔗糖的混合對照品溶液適量，制備成不同濃度的系列混合對照品溶液，再分別按照“2.3.2”和“2.3.3”項下色譜條件進樣測定，以對照品質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線 [其中果糖和蔗糖以對照品質量濃度的對數為橫坐標（X），峰面積的對數為縱坐標（Y），繪制標準曲線]，如表1所示，結果表明各成分在各自范圍內線性關系良好。

表1 單糖和寡糖的線性關系Table 1 Linear relation of monosaccharides and oligosaccharide

（2）精密度試驗：稱取“2.2”項下的黃芪總多糖和小分子成分部位各150 mg，精密稱定，分別按照“2.3.2”項和“2.3.3”項中供試品制備的方法制備供試品溶液，再分別按照“2.3.2”和“2.3.3”項下色譜條件各連續(xù)進樣6 次，結果表明，兩種供試品溶液各成分峰面積的RSD 值均小于2%，說明該儀器精密度良好。

（3）重復性試驗：稱取“2.2”項下的黃芪總多糖和小分子成分部位各150 mg，精密稱定，分別按照“2.3.2”項和“2.3.3”項中供試品制備的方法制備供試品溶液各6 份，分別按照“2.3.2”和“2.3.3”項下色譜條件進樣測定，計算各成分的含量并求得RSD 值，結果表明兩種方法各成分含量的RSD 值均小于2%，說明單糖和寡糖測定方法的重復性較好。

（4）穩(wěn)定性試驗：用精密度試驗中黃芪總多糖和小分子成分部位的樣品，按照“2.3.2”和“2.3.3”項下色譜條件，在2、4、6、8、12、24 h 進樣分析，結果表明，各分析物峰面積的RSD 值均小于2%，說明2 種供試品溶液在24 h 內均穩(wěn)定。

（5）加樣回收率試驗：取“2.2”項下的各成分含量已知的黃芪總多糖和小分子成分部位各150 mg，精密稱定，上述2 種樣品各平行制備6 份，向黃芪總多糖中加入甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、巖藻糖含量100%的對照品溶液，向小分子成分部位中加入果糖和蔗糖含量100%的對照品溶液，分別按照“2.3.2”和“2.3.3”項下色譜條件進樣測定，得甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、巖藻糖、果糖和蔗糖的平均加樣回收率分別為 96.58%、97.38%、98.38%、97.87%、96.69%、99.29%、98.13%、97.58%、97.90%，RSD 分別為1.85%、2.11%、2.83%、1.04%、1.87%、1.67%、2.78%、1.16%、1.20%。結果說明單糖和寡糖的測定方法準確度良好。

2.3.6 各糖類組分分析結果

（1）多糖Mw分布：以右旋糖苷對照品保留時間為橫坐標，Mw的對數值為縱坐標，得線性回歸方程lgMw＝12.084－0.453 6t，R2＝0.997 1。黃芪和蜜炙黃芪多糖色譜圖見圖1，根據對照品線性回歸方程計算黃芪多糖Mw分布范圍為266～1.65×109，有3 個明顯的色譜峰，Mw分別為3.64×106、4.25×103、623，根據峰面積計算其相對含量分別為54.55%、14.05%、31.41%；蜜炙黃芪多糖Mw分布范圍為200～1.36×109，同樣有3 個主要色譜峰，Mw分別為2.34×106、4.03×103、642，相對含量分別為55.24%、6.92%、37.85%，如圖2所示。

圖1 黃芪和蜜炙黃芪多糖的HPGPC 圖Fig.1 HPGPC chromatograms of polysaccharides of AR and HAR

圖2 黃芪和蜜炙黃芪多糖不同相對分子質量占比Fig.2 Different molecular weight proportions of AR and HAR

多糖最基本的特征是多糖相對分子質量的分布，相對分子質量的改變意味著多糖性質的改變。因此，本實驗采用多分散系數（α）[14]（α＝Mw/Mn），將多糖的相對分子質量進行量化處理（Mn＝∑Hi/∑Hi/Mi，Mw＝∑HiMi/∑Hi，Mn為數均相對分子質量；Hi為供試品在保留時間i的響應值；Mi為樣品i的相對分子質量，即供試品在保留時間i的相對分子質量）。最后計算得黃芪和蜜炙黃芪3 種多糖的α 分別為5.098、7.889、1.089 和7.742、5.288、1.085。

（2）黃芪和蜜炙黃芪多糖的單糖組成分析結果：通過與單糖的混合對照品色譜圖保留時間進行比較（圖3），黃芪和蜜炙黃芪多糖均含有甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、巖藻糖等，采用標準曲線法計算各單糖的含量，并換算成相對物質的量比，生黃芪多糖中各個單糖物質的量比為0.70∶0.20∶0.85∶5.67∶0.44∶2.04∶0.32，炙黃芪中各個單糖物質的量比為0.79∶0.15∶0.73∶7.10∶0.31∶1.71∶0.35，結果表明黃芪和蜜炙黃芪各單糖組成無明顯差別，而蜜炙黃芪多糖中葡萄糖含量比例上升。

圖3 黃芪和蜜炙黃芪中單糖的UPLC 圖Fig.3 UPLC chromatograms of monosaccharides of AR and HAR

（3）黃芪和蜜炙黃芪寡糖分析結果：黃芪和蜜炙黃芪均含有蔗糖（圖4），采用標準曲線法計算蔗糖含量，結果表明黃芪在蜜炙后，蔗糖含量由（197.74±26.32）mg/g 顯著下降至（147.22±20.86）mg/g（P＜0.001）。

圖4 黃芪和蜜炙黃芪中寡糖和果糖的HPLC 圖Fig.4 HPLC chromatograms of oligosaccharides and fructose in AR and HAR

（4）黃芪和蜜炙黃芪游離單糖分析結果：黃芪和蜜炙黃芪均含有甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖和巖藻糖（圖3）。用標準曲線法計算樣品中游離單糖的含量，由表2 可見，蜜炙黃芪中果糖、甘露糖、葡萄糖含量顯著高于黃芪（P＜0.05、0.01），而半乳糖醛酸的含量顯著低于黃芪（P＜0.05）。

表2 黃芪和蜜炙黃芪中游離單糖的含量(±s，n＝9)Table 2 Contents of free monosaccharides in AR and HAR(±s，n = 9)

表2 黃芪和蜜炙黃芪中游離單糖的含量(±s，n＝9)Table 2 Contents of free monosaccharides in AR and HAR(±s，n = 9)

與黃芪比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001，表4 同*P ＜ 0.05 **P ＜ 0.01 ***P ＜ 0.001 vs AR,same as table 4

樣品 質量分數/(mg·g-1)果糖 甘露糖 半乳糖醛酸 葡萄糖 巖藻糖黃芪 9.16±1.65 18.76±0.30 6.47±0.14 133.05±9.16 4.14±0.12蜜炙黃芪 49.74±8.63** 24.30±0.33* 5.87±0.30* 290.78±16.82** 4.51±0.17

2.4 黃芪和蜜炙黃芪非糖小分子組分表征

2.4.1 對照品溶液的制備 取黃芪甲苷、芒柄花苷、芒柄花素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、5-HMF 對照品適量，精密稱定，用甲醇溶解并定容，混合，再用倍半稀釋法制成含黃芪甲苷0.011 mg/mL、芒柄花苷0.099 mg/mL、芒柄花素0.010 mg/mL、毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.010 mg/mL、5-HMF 0.099 mg/mL 的混合對照品溶液。

2.4.2 供試品溶液的制備 取黃芪藥材飲片（批號211004、211005、211009、211012、211015、211020）共6 批，按“2.1”項下方法炮制蜜炙黃芪飲片，并按“2.2”項下方法制備黃芪和蜜炙黃芪的小分子部位，得黃芪和蜜炙黃芪小分子部位各6 批，每批制備2 份（共12 份）供試品溶液。各取黃芪和蜜炙黃芪小分子部位適量，加甲醇配制成5 mg/mL的溶液，再吸取1 mL，過ODS 固相萃取小柱后定容至10 mL，13 000 r/min 離心15 min，同樣的方法共制備黃芪和蜜炙黃芪小分子部位供試品溶液各12 份，0.22 μm 微孔濾膜濾過后進樣。2.4.3 UHPLC-Q-Orbitrap HRMS 分析 采用代謝組學策略對黃芪和蜜炙黃芪中的差異性非糖小分子進行篩選，對代表性成分進行定量分析，其中5-HMF 由于其弱離子化，采用UPLC-PDA 檢測。

（1）色譜條件：ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈溶液（B），梯度洗脫0～0.5 min，5%A；0.5～1.5 min，5%～15%A；1.5～4.5 min，15%～30%A；4.5～7 min，30%～60%A；7～11 min，60%～70%A；11～12 min，70%～100%A；12～13 min，100%A；13～13.5 min，100%～5%A；13.5～16 min，5%A；體積流量0.3 mL/min，進樣量1 μL，柱溫40 ℃；進樣量2 μL。5-HMF 的檢測波長283 nm。

（2）質譜條件：采用電噴霧離子源（ESI），正、負離子同時采集，鞘氣體積流量40 arb，輔助氣體積流量5 arb，噴霧電壓3.2 kV，毛細管溫度320 ℃，輔助氣加熱溫度350 ℃，高壓環(huán)形離子導入裝置電壓（S-Lens RF Level）為50。檢測模式采用全掃描/數據依賴二級掃描（Full MS/dd-MS2），掃描范圍為m/z100～1000，一級質量分辨率為70 000 FWHM，二級分辨率17 500 FWHM，碰撞能量為30 eV。

2.4.4 數據采集與處理 采用 Compround Discoverer 3.3 軟件對質譜數據進行峰提取、峰匹配、保留時間對齊、碎片離子采集及峰面積歸一化等處理，再結合mz-Cloud、Chemspider 數據庫進行成分鑒定和匹配。將處理的數據導入SIMCA 14.1軟件進行主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）。統(tǒng)計學分析采用SPSS 26.0 軟件。

2.4.5 差異性成分分析 運用SIMCA 14.1 軟件分析，將數據Par 標準化后，去除離群值，得到正、負離子模式下生黃芪和蜜炙黃芪的 PCA 圖、OPLS-DA 圖和S-plot 圖，由圖5 可知，黃芪組和蜜炙黃芪組可明顯區(qū)分，說明2 組之間的非糖小分子成分存在差異。以VIP＞1，t檢驗（P＜0.05），分子離子的相對質量偏差在±5×10-6以內，mz-Cloud數據庫成分鑒定匹配得分大于70%為標準來篩選黃芪和蜜炙黃芪之間的顯著性差異成分，再結合相關文獻，最后共鑒定出20 個差異性成分（圖6、表3），其中黃酮類成分6 個，皂苷類成分8 個。表3 中的差異倍數（fold change）大于1 表示與黃芪相比，蜜炙黃芪中的含量水平上調，小于1 表示水平下調。將鑒定出的20 個差異性成分的峰面積歸一化數據進行熱圖分析，結果見圖7。

圖7 黃芪和蜜炙黃芪的差異成分熱圖分析Fig.7 Heat map analysis of differential components in AR and HAR

表3 黃芪和蜜炙黃芪中非糖小分子差異性成分Table 3 Differential non-sugar small molecules of AR and HAR

圖5 正、負離子模式下黃芪和蜜炙黃芪的PCA 圖(A、D)、OPLS-DA 圖(B、E)、S-plot 圖(C、F)Fig.5 PCA plot(A、D)、OPLS-DA plot(B、E)、S-plot diagram(C、F)of AR and HAR in postive ion mode and negative ion mod

圖6 正(A、C)、負(B、D)離子模式下黃芪(A、B)和蜜炙黃芪(C、D)的TIC 圖Fig.6 TIC chromatograms of AR(A、B)and HAR(C、D)in postive ion mode(A、C)and negative ion mode(B、D)

2.4.6 代表性成分含量測定 采用外標一點法計算樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素、黃芪甲苷和5-HMF 的含量。由表4 可知黃酮類成分和皂苷類成分在黃芪和蜜炙黃芪中含量差異較大。與黃芪相比，蜜炙黃芪中的黃酮類成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、芒柄花苷含量明顯降低（P＜0.05、0.01），皂苷類成分黃芪甲苷顯著增加（P＜0.01）。呋喃醛衍生物5-HMF 在黃芪中未檢測到，在蜜炙黃芪中的含量顯著升高（P＜0.001）。

表4 黃芪和蜜炙黃芪中代表性非糖小分子成分的含量比較(±s，n = 12)Table 4 Comparison of representative non-sugar small molecules of AR and HAR(±s，n = 12)

表4 黃芪和蜜炙黃芪中代表性非糖小分子成分的含量比較(±s，n = 12)Table 4 Comparison of representative non-sugar small molecules of AR and HAR(±s，n = 12)

樣品 質量分數/(mg·g-1)毛蕊異黃酮葡萄糖苷 芒柄花素 芒柄花苷 黃芪甲苷 5-HMF黃芪 146.29±4.38 311.15±8.03 69.67±2.40 111.29±4.60 0蜜炙黃芪 94.02±5.11** 242.94±7.76* 55.07±2.91* 280.53±9.18** 676.10±23.47***

3 討論

本研究結合糖組學（UPLC-PDA、HPLC-ELSD、HPGPC-ELSD）和代謝組學（UHPLC-Q-Orbitrap HRMS）技術，分析比較了黃芪和蜜炙黃芪中的糖類組分和非糖小分子組分的差異。

黃芪多糖部位通過色譜分析發(fā)現含有重均Mw分別為3.64×106、4.25×103、623 的3 種多糖，蜜炙黃芪多糖部位含有重均Mw分別為2.34×106、4.03×103、642 的3 種多糖，說明黃芪多糖中Mw最大的組分（Mw＝3.64×106）的重均Mw要大于蜜炙黃芪中Mw最大的多糖組分（Mw＝2.34×106），同時黃芪和蜜炙黃芪多糖中Mw最大組分的多分散系數分別為5.098、7.742，說明相比于蜜炙黃芪，生品黃芪該組分更加均一，其原因可能為炮制過程中高Mw多糖裂解成較小Mw的多糖[23-24]，導致Mw降低，同時組分更加不均一。蜜炙黃芪中重均Mw為642 的多糖組分占比要大于生品黃芪，重均Mw為4.03×103的多糖組分占比要小于生品黃芪，其原因可能為炮制過程中的加熱因素對重均Mw為4.03×103的多糖影響較大，其發(fā)生降解，導致相對分子質量降低；而重均Mw為2.34×106的多糖變化較小。

通過分析發(fā)現，與黃芪相比蜜炙黃芪中果糖含量升高了5 倍，葡萄糖含量升高了2 倍。其原因為蜂蜜本身含有大量的果糖、葡萄糖和少量的蔗糖。而蜜炙黃芪中蔗糖的含量顯著降低，可能存在以下兩方面的原因，一方面為炮制所用蜂蜜為煉蜜，在煉蜜過程中其少量的蔗糖已經發(fā)生了水解、糖基化以及美拉德反應，另一方面為黃芪炮制過程中存在的水分和加熱因素使蔗糖水解為果糖和葡萄糖，并發(fā)生了糖基化和美拉德反應[25]，產生了5-HMF 等呋喃醛衍生物[10,12]，使蔗糖降解，最終導致蜂蜜中少量蔗糖的引入不足以抵消其炮制過程中的轉化和降解。查閱文獻發(fā)現[26-27]，煉蜜隨著時間的延長和溫度的增加，5-HMF 的含量也隨之增加[28]，果糖較之于葡萄糖和蔗糖，更易轉化為5-HMF，因此加蜜炮制后5-HMF 的含量會更高[29]。現代研究結果表明，5-HMF具有保護肝細胞[30]、抗炎和抗氧化[31]等作用。

查閱文獻發(fā)現多糖作為黃芪中的重要生物活性成分，通過降低血糖、改善胰島素抵抗、抑制胰島β細胞凋亡等機制預防和治療糖尿病及其并發(fā)癥[32-34]。對于蜜炙黃芪中多糖類組分在炮制過程中發(fā)生的Mw、Mw分布以及含量的變化，會對黃芪的功效產生何種影響還需要進一步深入的研究。糖類組分中的蔗糖在機體中經蔗糖酶水解生成單糖，可使血糖升高，可能引發(fā)胰島素抵抗，對各器官組織產生毒性作用，導致糖尿病及并發(fā)癥的發(fā)生[35-36]。研究發(fā)現，蔗糖比單體果糖和葡萄糖更能引起嚴重的糖脂代謝異常[37]。本實驗結果表明，黃芪蜜炙后蔗糖含量下降，而果糖和葡萄糖含量明顯上升。果糖不僅是一種提供熱量的己糖，還可能潛在影響機體行為和參與某些代謝途徑[38]，包括中樞系統(tǒng)、肝臟代謝、炎癥反應、腸道微生物群和骨骼肌基因表達等[39]。對于非糖類組分，蜜炙黃芪中毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、芒柄花苷等多種黃酮及其苷類成分含量下降，而黃芪甲苷、異黃芪皂苷II、大豆皂苷Bb 等多種皂苷類成分含量上升。其原因可能是炮制過程中黃酮類成分結構發(fā)生了轉化導致其含量降低，而炮制使皂苷類成分更易煎出因此含量上升。

本課題組前期研究表明黃芪中的多糖和皂苷類成分能明顯促進機體物質能量代謝[20]。但多糖作為大分子化合物，空間構型復雜，本實驗對多糖部分的研究還無法充分闡釋黃芪蜜炙后多糖結構改變的機制以及其與藥效的關系。因此，黃芪蜜炙后具有顯著差異性的糖類組分和非糖類組分在整體上對蜜炙黃芪藥效的影響還需要進一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突