邢瑞霞，朱金潔，祁顯濤，謝傳曉，劉昌林，江海洋

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽合肥 230036；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京 100081)

玉米是在全球廣泛種植的主要糧食作物之一，也是重要的飼料作物和重要的工業(yè)原料。高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、適宜的生育期、適應(yīng)機(jī)械化一直都是國內(nèi)外玉米育種的主要目標(biāo)。生育期作為玉米重要的農(nóng)藝性狀，其改良工作也一直是玉米育種工作的研究熱點(diǎn)。玉米起源于熱帶的墨西哥西南部，由大芻草馴化而來，對光周期敏感，并需要在短日照條件才能開花[1]，利用基因編輯技術(shù)減少玉米植株對光周期的敏感性及改良玉米的開花期在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上有著重要意義。適當(dāng)縮短生育期不僅能夠擴(kuò)大其種植范圍，提高復(fù)種指數(shù)，而且可以有效降低遭遇抽雄揚(yáng)花期的高溫危害、灌漿后期早霜危害、成熟期雨季穗發(fā)芽以及晚期病蟲害等的概率。

ZmCCT10(Zm00001eb418700)位于玉米的10號染色體，屬于玉米中的CCT家族，與水稻光周期反應(yīng)調(diào)節(jié)因子Ghd7同源，同源性在36%左右，其編碼的蛋白質(zhì)含有保守的CCT結(jié)構(gòu)域，作為轉(zhuǎn)錄因子微量調(diào)節(jié)開花開關(guān)基因ZCN8的表達(dá)，進(jìn)而影響玉米生育期[2-5]。筆者以基因編輯ZmCCT10基因玉米T6代純合突變體系以及親本KN5585自交系為試驗(yàn)材料，在短日照(海南)、長日照(北京)地區(qū)進(jìn)行種植，通過對植株開花期及其他農(nóng)藝性狀的觀察，研究ZmCCT10突變對于生育期的影響，以期為進(jìn)一步探索通過改良開花期進(jìn)而達(dá)到穩(wěn)產(chǎn)、增產(chǎn)的目的提供了新方法。

1 材料與方法

1.1 供試材料ZmCCT10基因來自玉米本身的內(nèi)源基因，通過基因測序獲得轉(zhuǎn)化受體KN5585的CDS序列后，進(jìn)行sgRNA的設(shè)計(jì)，構(gòu)建CRISPR/Cas9敲除載體，通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化后獲得轉(zhuǎn)基因材料，經(jīng)過多代自交獲得不含有轉(zhuǎn)基因元件的基因編輯材料，繁殖至T6代ZmCCT10-1IT及ZmCCT10-1IA株系；親本對照自交系KN5585，由未米生物科技(江蘇)有限公司提供。

1.2 Cas9基因編輯敲除載體構(gòu)建以KN5585為背景材料，其基因序列與B73略有差別。通過測序獲得ZmCCT10的CDS序列后，在http://crispr.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR2/CRISPR?tdsourcetag=s_pctim_aiomsg網(wǎng)站中設(shè)計(jì)sgRNA，為保證編輯效率，一般選擇5′G—NGG3′的sgRNA，再利用https://www.gramene.org/網(wǎng)站進(jìn)行BLAST后選取特異性較高的sgRNA，構(gòu)建可以通過胚熒光篩選的單sgRNA-Cas9敲除的基因編輯載體。

基因編輯基礎(chǔ)載體CPB-Cas9(已連入Ubiquitin啟動子驅(qū)動的Cas9表達(dá)盒)由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院謝傳曉課題組提供，加入熒光篩選系統(tǒng)快速辨別籽粒陰陽性。熒光篩選系統(tǒng)采用胚特異性啟動子ZmESP啟動RFP熒光蛋白。

1.3 轉(zhuǎn)化鑒定與基因型鑒定將構(gòu)建好的基因編輯敲除載體送至未米生物科技(江蘇)有限公司進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)基因材料。收獲的種子經(jīng)過熒光篩選后，挑選陽性籽粒進(jìn)行種植，進(jìn)行ZmCCT10靶基因突變鑒定獲得轉(zhuǎn)基因材料，并將突變的材料進(jìn)行自交，從收獲的籽粒中選擇選陰性籽粒進(jìn)行種植，直至獲得純合無轉(zhuǎn)基因元件的突變體材料。

待T6代ZmCCT10-1IT及ZmCCT10-1IA株系成長到3葉期，采用CTAB法提取其葉片DNA后進(jìn)行Cas9 PCR檢測、Bar PCR檢測及Bar試紙條檢測，確定ZmCCT10-1IT及ZmCCT10-1IA為無轉(zhuǎn)基因元件株系，再進(jìn)行靶基因檢測，PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序，利用SnapGene及DNAMAN進(jìn)行序列比對確定其基因型。所需檢測引物序列見表1，檢測程序見表2。

表1 檢測所用引物序列Table 1 Primer sequence used for detection

表2 檢測PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序Table 2 Procedure for PCR reaction

1.4 純合材料表型調(diào)查方法將穩(wěn)定且純合的無轉(zhuǎn)基因ZmCCT10-1IT、ZmCCT10-1IA株系以及親本對照KN5585種植在短日照的海南樂東黎族自治縣、長日照的北京南口中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)基地2個地區(qū)，經(jīng)緯度分別為109.17°E，18.7°N和116.2°E，40.2°N，并調(diào)查花期和植株農(nóng)藝性狀，具體調(diào)查指標(biāo)及方法見表3，探究ZmCCT10基因?qū)τ谟衩咨诘挠绊憽?/p>

表3 表型調(diào)查指標(biāo)及方法Table 3 Phenotypic survey indicators and methods

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)取樣本量的平均值，經(jīng)過Excel整理及初步分析后，用SigmaPlot 14.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)差異顯著采用經(jīng)典T檢驗(yàn)計(jì)算，**表示P<0.01極顯著差異，*表示P<0.05顯著差異，P>0.05表示無顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cas9基因編輯敲除載體圖譜U6啟動單sgRNA的熒光敲除載體圖譜如圖1所示，命名為CPB-Cas9-ZmCCT10。用E35S啟動子Bar的表達(dá)，可在真核生物中檢測是否含有該載體；UBI強(qiáng)啟動子啟動作為編輯器的Cas9，保證Cas9蛋白的高表達(dá)；胚特異性啟動子ZmESP啟動RFP表達(dá)，陽性籽?？稍诓ㄩL為520 nm的綠色激發(fā)光下配以LUV-50A紅色眼鏡進(jìn)行觀察，陽性籽粒會發(fā)出明亮的紅光，陰性籽粒則不發(fā)光；U6-2啟動sgRNA。

圖1 CPB-Cas9-ZmCCT10載體圖譜Fig.1 Vector of CPB-Cas9-ZmCCT10

2.2 無轉(zhuǎn)基因元件鑒定以及基因型鑒定將構(gòu)建好的載體送至未米生物科技(江蘇)有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)化，T0獲得42個植株，經(jīng)過轉(zhuǎn)基因元件Bar和Cas9檢測后，獲得23株陽性植株，占比54.76%，獲得5種轉(zhuǎn)化事件，挑選其中2種移碼突變材料繼續(xù)進(jìn)行生育期研究。根據(jù)其突變類型將這2種株系分別命名為ZmCCT10-1IT株系及ZmCCT10-1IA株系。在后代中，分離出無轉(zhuǎn)基因元件且含有目標(biāo)突變的純合突變單株，自交繁種。選用T6代遺傳穩(wěn)定的無轉(zhuǎn)基因元件材料。

將所需檢測植株進(jìn)行轉(zhuǎn)基因元件檢測以及靶基因檢測，圖2a為Bar檢測及試紙條檢測結(jié)果，以載體轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌作為陽性對照，野生型作為陰性對照，水作為空白對照，對目標(biāo)植株進(jìn)行Bar檢測，陽性植株檢測出符合大小的目的條帶，陰性植株及陰性對照、空白對照均未檢測出條帶，鑒于Bar檢測容易出現(xiàn)污染，同時使用Bar試紙條進(jìn)行蛋白水平的檢測，2種檢測結(jié)果一致；圖2b為Cas9檢測結(jié)果，對照同Bar檢測，陽性植株檢測出符合大小的目的條帶，陰性植株及陰性對照、空白對照均未檢測出條帶；圖2c為靶基因檢測結(jié)果，以載體質(zhì)粒作為陰性對照、水作為空白對照以及野生型作為陽性對照，2種突變體株系均檢測符合大小的目的條帶。

將測序后的靶基因序列利用DNAMAN及SnapGene進(jìn)行比對，確定突變株系的突變類型，如圖3a所示，ZmCCT10-1IT株系在PAM上游第4位發(fā)生了一個加1T的插入；如圖3b所示，ZmCCT10-1IA株系在PAM上游第4位發(fā)生了一個加1A的插入，均引起移碼突變。根據(jù)檢測得到的序列，利用DNAMAN軟件對靶基因蛋白進(jìn)行預(yù)測，如圖4a和4b所示，2種移碼突變均能夠引起蛋白的提前終止。

注：a.Bar檢測及試紙條檢測圖;b.Cas9檢測圖。1.陽性對照，載體農(nóng)桿菌；2.陰性對照，野生型親本KN5585；3.空白對照，ddH2O；4、5.陽性ZmCCT10-1IT株系植株；6、7.陰性ZmCCT10-1IT株系植株；8、9.陽性ZmCCT10-1IA株系植株；10、11.陰性ZmCCT10-1IA株系植株。c.ZmCCT10靶基因檢測膠圖；1.陰性對照，載體質(zhì)粒；2.空白對照，ddH2O；3.陽性對照，野生型親本KN5585；4、5.ZmCCT10-1IT株系；6、7.ZmCCT10-1IA株系。Note:a.Bar test and strip test chart, b.Cas9 test chart.1.Positive control, vector agrobacterium;2.Negative control, wild type parent KN5585;3.Blank control, ddH2O;4,5.Positive ZmCCT10-1IT strain plants;6,7.Negative ZmCCT10-1IT plant;8,9.Positive ZmCCT10-1IA strain plants;10,11.Negative ZmCCT10-1IA strain plants.c. ZmCCT10 target gene detection gel map; 1. Negative control, vector plasmid; 2. Blank control, ddH2O; 3. Positive control, wild type parent KN5585; 4,5. ZmCCT10-1IT strain; 6,7. ZmCCT10-1IA strain.圖2 轉(zhuǎn)基因成分檢測Fig.2 Detection of transgene elements

注：a.ZmCCT10-1IT株系與野生型比對結(jié)果圖；b.ZmCCT10-1IA株系與野生型對比結(jié)果圖；WT為野生型，親本KN5585；紅色框內(nèi)為sgRNA。Note:a.The comparison result between ZmCCT10-1IT strain and wild type;b.The comparison result between ZmCCT10-1IA strain and wild type;WT is wild type,parent KN5585;the red box shows sgRNA.圖3 靶基因序列比對Fig.3 Comparison of sequence alignment of target gene

2.3 純合突變體株系ZmCCT10-1IT和ZmCCT10-1IA對開花期的影響將陰性純合突變株種植到海南和北京，種植模式為4 m行長,17株，株間距25 cm，行間距60 cm，按每行成活情況觀察各株系抽雄期、散粉期、吐絲期等與開花相關(guān)的表型，并進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。如圖5a、5b、5c所示，在海南短日照地區(qū)，ZmCCT10-1IT株系與野生型相比，抽雄期提前3 d，散粉期提前4 d，吐絲期提前2 d，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明差異極顯著；ZmCCT10-1IA株系與野生型相比，抽雄期提前1 d，散粉期與野生型一致，吐絲期推遲1 d，抽雄期和吐絲期差異顯著。

如圖5d、5e、5f所示，在北京長日照地區(qū)，ZmCCT10-1IT株系與野生型相比，抽雄期提前2 d，差異極顯著，散粉期提前2 d，差異顯著，吐絲期提前3 d，差異極顯著；ZmCCT10-1IA株系與野生型相比，抽雄期提前1 d，差異顯著，散粉期提前3 d,差異顯著，吐絲期提前5 d，差異呈極顯著。由此可知，無論是在短日照還是在長日照地區(qū)，ZmCCT10基因?qū)τ谟衩椎拈_花期均有影響，敲除該基因能有效提前花期，且在長日照地區(qū)更為明顯，說明ZmCCT10在長日照條件下充當(dāng)玉米的開花抑制因子。

農(nóng)藝性狀是該研究考察的另一大重點(diǎn)。如圖6a、6b、6c所示，在海南短日照地區(qū)，ZmCCT10-1IT株系與野生型相比，株高降低18.6 cm，去雄株高降低15.2 cm，穗位高降低24.3 cm，差異均達(dá)極顯著水平；ZmCCT10-1IA株系與野生型相比，株高降低9.4 cm，去雄株高降低10.9 cm，穗位高降低0.8 cm，且均呈極顯著相關(guān)。如圖6d、6e、6f所示，在北京長日照地區(qū)，ZmCCT10-1IT株系與野生型相比，株高降低21.7 cm，去雄株高降低21.5 cm，穗位高降低22.8 cm，且差異均呈極顯著；ZmCCT10-1IA株系與野生型相比，株高降低16.3 cm，差異極顯著，去雄株高降低17.0 cm，差異顯著，穗位高降低8.7 cm，差異極顯著。植株整體表型如圖7所示。

注：a.ZmCCT10-1IT株系與野生型比對結(jié)果；b.ZmCCT10-1IA株系與野生型對比結(jié)果；WT為野生型，親本KN5585；紅色框內(nèi)為突變后sgRNA結(jié)合位置。Note:a.ZmCCT10-1IT strain and wild type comparison result diagram;b.Comparison results of ZmCCT10-1IA strain and wild type;WT is wild type,parent KN5585;the red box shows the binding site of sgRNA after mutation.圖4 預(yù)測蛋白比對Fig.4 Comparison of prediction protein

注：WT為野生型；*表示與WT相比差異顯著(P<0.05)，**表示在WT相比差異極顯著(P<0.01)。Note:WT is wild type；* indicates significant difference compared with WT (P<0.05),** indicates extremely significant difference compared with WT(P<0.01).圖5 海南和北京開花期統(tǒng)計(jì)分析Fig.5 Statistical analysis of flowering time at Hainan and Beijing

3 結(jié)論與討論

注：WT為野生型；*表示與WT相比差異顯著(P<0.05)，**表示與WT相比差異極顯著(P<0.01)。Note:WT is wild type；* indicates significant difference compared with WT(P<0.05),** indicates extremely significant difference compared with WT(P<0.01).圖6 海南和北京植株水平農(nóng)藝性狀統(tǒng)計(jì)分析Fig.6 Statistical analysis of agronomic traits at Hainan and Beijing

圖7 植株比較Fig.7 Plant comparison

開花期的探索一直是人類認(rèn)識植物、了解植物繁衍生息最直觀的方式之一，是植物從營養(yǎng)生長向生殖生長發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)變的重要標(biāo)志，同時是決定植物對環(huán)境因素適應(yīng)性的最重要性狀之一[6-7]。植物開花期的改良一直是擴(kuò)大生產(chǎn)，提高土地利用率的有效手段。ZmCCT10是水稻光周期反應(yīng)調(diào)節(jié)基因Ghd7的同源基因，受晝夜調(diào)控，包含一個CCT蛋白結(jié)構(gòu)域，有研究表明該結(jié)構(gòu)域在玉米的開花調(diào)控中起著重要作用[8]。另外，也有研究表明ZmCCT10在長日照的條件下作為開花抑制因子調(diào)節(jié)玉米開花[4，9]，在其上游的調(diào)控基因ZmCOL3 則可以通過激活 ZmCCT10 的表達(dá)來抑制開花時間[8]。在早花玉米中，在 ZmCCT10啟動子中檢測到一個類似 CACTA 的轉(zhuǎn)座因子，該轉(zhuǎn)座因子可明顯縮短植株的開花時間[9-10]。另外，與ZmCCT10同源的CCT家族基因ZmCCT9同樣受晝夜調(diào)控，負(fù)調(diào)控成花素基因ZCN8的表達(dá)，從而導(dǎo)致植株在長日照下推遲開花[11-12]。2018年有研究表明，利用基因編輯技術(shù)敲除ZmCCT9后，可導(dǎo)致玉米在長日照下提早開花，同時能夠增強(qiáng)植株對于高緯度地區(qū)的適應(yīng)性[11]。有研究表明，ZmMADS69 抑制開花抑制因子 ZmRap2.7 的表達(dá)，從而促進(jìn)ZCN8的表達(dá)并導(dǎo)致早期開花[13]。ZMM4基因可有效促進(jìn)玉米成花轉(zhuǎn)變，并且過表達(dá)ZMM4可以促使轉(zhuǎn)基因植株比野生型更早開花[14]。

該研究結(jié)果表明，在長日照條件下ZmCCT10作為開花抑制因子調(diào)節(jié)玉米開花，利用基因編輯技術(shù)敲除ZmCCT10后，可有效促使玉米在長日照下提早開花并出現(xiàn)矮化等優(yōu)良性狀，為提高玉米抗倒伏、早熟等方面奠定了基礎(chǔ)。