周曉琳，王 薇，王玉霞，趙同凱，董艷芳，杜夢(mèng)楊，劉佰霖，王富建，李洪杰

(德州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，山東德州 253015)

真菌是土壤中最為豐富的微生物之一，是農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中主要的分解者，在土壤能量流動(dòng)、養(yǎng)分循環(huán)轉(zhuǎn)化和控制作物病害等方面具有重要作用[1]。土壤真菌對(duì)其生存環(huán)境變化極為敏感，其多樣性和群落組成受耕作、施肥和灌溉等田間管理措施的影響[2]。

為了探討不同施肥下土壤微生物的變化規(guī)律及其相互關(guān)系，揭示減施化肥配施有機(jī)肥對(duì)土壤理化特性與真菌群落的影響，筆者以不同施肥方式為處理，研究有機(jī)肥部分替代化肥與土壤理化特性及真菌群落之間的關(guān)系，為提高耕地土壤微生物學(xué)特性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況試驗(yàn)于2010年10月在德州市德城區(qū)哨馬營(yíng)村進(jìn)行。德州市屬暖溫帶半濕潤(rùn)季風(fēng)氣候，年平均氣溫12.9 ℃，年降水量547.5 mm。供試土壤為非石灰性潮土，pH 8.3，有機(jī)質(zhì)含量20.3 g/kg，全氮1.2 g/kg，全磷0.83 g/kg，全鉀20.8 g/kg，有效磷(P2O5)37.4 mg/kg，速效鉀282 mg/kg。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)共設(shè)置6個(gè)處理，分別是不施肥對(duì)照(CK)、常規(guī)氮磷鉀肥(NPK)、豬糞3 000 kg/hm2+70%NPK(NPKM)、豬糞6 000 kg/hm2+50%NPK(ONPK)、秸稈還田+100%NPK(NPKJ)、秸稈還田+100%NPK+秸稈腐熟劑150 kg/hm2(NPKF)。每處理重復(fù)4次，隨機(jī)區(qū)組排列，共24個(gè)小區(qū)，小區(qū)面積為50 m2(10 m×5 m)。試驗(yàn)地冬小麥-夏玉米輪作種植，一年兩作，小麥品種為濟(jì)麥22。玉米品種為鄭單958，除氮肥2次追施外(尿素底肥1.3 kg，返青追肥和拔節(jié)期追肥2次追肥均為0.98 kg)，其余肥料均一次性底肥施入。供試氮肥為尿素(N 46%)，磷肥為過(guò)磷酸鈣(P2O516%)，鉀肥為硫酸鉀(K2O 50%)；豬糞為江陰市聯(lián)業(yè)生物科技有限公司生產(chǎn)，豬糞養(yǎng)分含量為氮磷鉀總養(yǎng)分5%，有機(jī)質(zhì)45%。經(jīng)折算，豬糞施用量分別為3 000和6 000 kg/hm2。各小區(qū)施肥量見(jiàn)表1。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1土壤樣品采集。于2021年10月20日玉米收獲后用土鉆進(jìn)行采土樣，供試土樣為每個(gè)小區(qū)0～20 cm土層土壤。每個(gè)小區(qū)隨機(jī)采9個(gè)樣點(diǎn)充分混勻，四分法保留1 kg左右土壤樣品，每個(gè)小區(qū)3次重復(fù)，樣品-70 ℃保藏。

1.3.2土壤微生物數(shù)量及土壤養(yǎng)分測(cè)定方法。采用稀釋涂布計(jì)數(shù)法對(duì)土壤微生物計(jì)數(shù)[3]測(cè)定土壤中真菌數(shù)量。真菌用馬丁氏培養(yǎng)基。對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行30 min的21 ℃滅菌，倒平板備用，平板接種后，放置在30 ℃恒溫箱倒置培養(yǎng)，5 d后統(tǒng)計(jì)真菌數(shù)目。pH采用pH計(jì)測(cè)定；全氮含量采用重鉻酸鉀-硫酸消化法測(cè)定；土壤有機(jī)質(zhì)含量采用重鉻酸鉀容量法測(cè)定；速效磷含量采用碳酸氫鈉法測(cè)定；速效鉀含量采用醋酸銨-火焰光度計(jì)法測(cè)定[4]。

表1 各試驗(yàn)小區(qū)施肥量Table 1 Fertilization amount of each test area 單位：kg

1.3.3土壤真菌高通量分析。使用PowerSoil DNA Isolation Kit土壤DNA提取試劑盒(Mo Bio Laboratories)從樣本中提取真菌總DNA，-80 ℃下儲(chǔ)存。使用 New England Biolabs公司的NEB Next Ultra TM DNA Library Prep Kit for Illumina試劑盒構(gòu)建文庫(kù)，然后進(jìn)行Qubit定量和文庫(kù)檢測(cè)，最后使用MiSeq進(jìn)行上機(jī)測(cè)序[5]。對(duì)有效數(shù)據(jù)進(jìn)行OTUs(Opera-tional Taxonomic Units)聚類和物種分類分析，并將OTU和物種注釋結(jié)合，從而得到每個(gè)樣品的OTUs和分類譜系的基本分析結(jié)果。采用Mothur軟件計(jì)算細(xì)菌的Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)[6]。

1.4 數(shù)據(jù)分析采用Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析和作圖，用DPS 7.5進(jìn)行差異顯著性分析。用Canoco4.5軟件對(duì)土壤細(xì)菌相對(duì)豐度和基本理化性質(zhì)作冗余分析(Redundancy analysis，RDA)，分析相關(guān)關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施肥方式對(duì)魯西北高產(chǎn)農(nóng)田土壤養(yǎng)分的影響從表2可以看出，NPK處理pH最低，NPKM處理與ONPK處理pH差異不顯著，但均高于NPK處理。不同施肥處理的有效磷、速效鉀含量隨施肥處理中有機(jī)肥比例增加而增加，NPK處理最低，ONPK處理最高，其中ONPK處理有效磷含量較CK和NPK處理分別提高2.16倍和35.3%，速效鉀含量較CK和NPK處理分別提高34.9%和10.8%，全氮含量較CK和NPK處理分別提高了42.4%和21.0%，有機(jī)質(zhì)含量較CK和NPK處理分別提高了55.2%和33.9%。說(shuō)明有機(jī)肥對(duì)提高土壤有效磷、速效鉀、全氮、有機(jī)質(zhì)有明顯效果。

2.2 不同施肥方式對(duì)土壤真菌數(shù)量和多樣性的影響由表3可知，ONPK處理真菌數(shù)量最高，較CK和NPK處理分別增加了90.1%和1.11倍，NPKJ、NPKM處理真菌數(shù)量次之，分別比對(duì)照增加了75.4%和65.8%，說(shuō)明施用有機(jī)肥和秸稈還田能夠顯著提高土壤中可培養(yǎng)真菌的數(shù)量。

表2 不同施肥方式對(duì)魯西北高產(chǎn)農(nóng)田土壤養(yǎng)分的影響Table 2 Effects of different fertilization treatments on soil nutrients of high-yield farmland in northwest Shandong

Chaol豐富度指數(shù)和 Shannon多樣性指數(shù)能進(jìn)一步確定施肥對(duì)土壤微生物的影響。二者可以較好地反映土壤中微生物種群的豐富度和多樣性[7]。由表3可知，NPK處理真菌豐富度指數(shù)最大，比對(duì)照提高了6.1%，其次是ONPK和NPKM處理，分別比對(duì)照提高了5.1%和4.0%，NPKJ、NPKF豐富度指數(shù)較低，可能是秸稈還田對(duì)真菌豐富度有影響；NPKF、ONPK處理物種多樣性指數(shù)最大，分別比對(duì)照提高了4.0%和3.3%。說(shuō)明施用有機(jī)肥和秸稈還田能夠顯著提高土壤中可培養(yǎng)真菌的數(shù)量，且對(duì)真菌多樣性影響較大。

表3 不同施肥方式對(duì)土壤真菌數(shù)量和多樣性的影響Table 3 Effects of different fertilization methods on the number and diversity of soil fungi

2.3 不同施肥方式對(duì)土壤真菌門水平多樣性的影響由圖1可知，各施肥處理優(yōu)勢(shì)菌群為子囊菌門(Ascomycota)(49.1%～62.9%)、接合菌門(Zygomycota)(18.9%～38.5%)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)(5.9%～8.6%)、壺菌門(Chytridiomycota)(2.1%～3.4%)。各施肥處理真菌相對(duì)豐度比不施肥對(duì)照均有所增加。其中CK和NPK真菌在門水平極為相似，NPKF和NPKJ在P-Necocallimastigomycota處有差別，NPKM與ONPK門水平非常相似。

圖1 各處理土壤細(xì)菌門水平的群落結(jié)構(gòu)Fig.1 Community structure at the level of soil bacterial phyla in each treatment

2.4 不同施肥方式對(duì)土壤真菌結(jié)構(gòu)的影響非度量多維定標(biāo)方法(NMDS)是一種非線性模型排序方法，克服了線性模型的不足。主要是將多維空間中的研究對(duì)象簡(jiǎn)化到低維空間進(jìn)行定位、分析和分類，同時(shí)保持對(duì)象之間原有的關(guān)系[8]。

由圖2可知，NPKF、NPKJ處理相纏較大，說(shuō)明秸稈還田處理的真菌群落特征相似程度一致，ONPK與NPKM處理有一定相似性。其他處理群落分布獨(dú)立，表明不同施肥處理間差異較大，由此可知，真菌群落分布特征與不同施肥處理具有相關(guān)性，其中真菌群落NPKF、NPKJ處理相似性最高，其次ONPK與NPKM較為相似，CK、NPK處理真菌群落差異較大。

圖2 各處理土壤細(xì)菌基于差異OTU的NMDS分析Fig.2 NMDS analysis of soil bacteria in each treatment based on difference OTU

注：T1.CK；T2.NPK；T3.NPKM；T4.ONPK；T5.NPKJ；T6.NPKF。圖3 不同施肥方式土壤真菌OTU水平上主成分分析(PCA)Fig.3 Principal component analysis(PCA)of different fertilization methods on OTU level of soil fungi

2.5 不同施肥方式土壤真菌OTU水平上主成分分析(PCA)基于玉米季ITS真菌的高通量測(cè)序結(jié)果，在OTU水平上的PCA分析見(jiàn)圖3。結(jié)果顯示，施肥對(duì)土壤真菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了明顯的影響。各處理與CK處理菌落結(jié)構(gòu)差異顯著，NPKM和ONPK相似，NPKJ和秸稈還田+氮磷鉀+秸稈腐熟劑(NPKF)處理相似，CK和NPK處理分別與其他處理差異顯著。說(shuō)明有機(jī)替代對(duì)土壤真菌群落結(jié)構(gòu)有明顯改善，且有機(jī)替代比例不同真菌群落結(jié)構(gòu)也明顯不同；與NPK相比秸稈還田對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)的影響最大，增施秸稈腐熟劑對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)的影響較小。

2.6 不同施肥方式高產(chǎn)農(nóng)田土壤養(yǎng)分和真菌的相關(guān)性為了研究土壤養(yǎng)分和真菌群落之間的關(guān)系，通過(guò)冗余分析探討了土壤養(yǎng)分指標(biāo)與細(xì)菌群落之間的關(guān)系。由圖4可知，CK受土壤pH影響較為明顯，因此其土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與其他處理差異顯著；但NPKJ、NPJF和NPKM、ONPK真菌群落結(jié)構(gòu)多樣性與土壤化學(xué)性質(zhì)相關(guān)性低于NPK，說(shuō)明全量氮磷鉀肥能顯著影響真菌群落結(jié)構(gòu)。

注：T1.CK；T2.NPK；T3.NPKM；T4.ONPK；T5.NPKJ；T6.NPKF。圖4 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性狀的RDA分析Fig.4 RDA analysis of soil bacterial community structure and soil physical and chemical properties

3 討論

3.1 不同施肥方式對(duì)高產(chǎn)農(nóng)田土壤養(yǎng)分含量的影響劉彥伶等[9]研究發(fā)現(xiàn)，施用有機(jī)肥顯著提高土壤養(yǎng)分含量，特別是有機(jī)肥替代50%化肥配施提升最為明顯。柴彥君等[10-11]研究結(jié)果表明，有機(jī)肥中大量的腐殖酸對(duì)土壤改良具有重要作用，特別是對(duì)土壤速效磷、速效鉀等速效養(yǎng)分含量的提高具有重要作用。其中有機(jī)肥替代50%化肥(ONPK)處理顯著提高了土壤速效鉀、速效磷、全氮、有機(jī)質(zhì)的含量，分別比NPK處理提高了10.8% 、35.3%、21.0%和33.9%。說(shuō)明有機(jī)肥施用可以改善土壤養(yǎng)分狀況，這可能是施用有機(jī)肥提高了土壤微生物活性，土壤有機(jī)碳庫(kù)增加，土壤有機(jī)質(zhì)的轉(zhuǎn)化加快，進(jìn)而增加了土壤中速效養(yǎng)分含量[12]。

3.2 不同施肥方式對(duì)高產(chǎn)農(nóng)田土壤真菌群落多樣性的影響土壤微生物代謝所需養(yǎng)料包括有機(jī)肥、秸稈，使得土壤微生物豐富度和多樣性得到提高[13-16]。Chen 等[17]、Francioli 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，有機(jī)肥的施用可顯著提高土壤細(xì)菌群落的多樣性，對(duì)真菌群落多樣性的影響不顯著，這與該研究結(jié)果有所不同。該研究結(jié)果表明，施用有機(jī)肥和秸稈還田能夠顯著提高土壤中可培養(yǎng)真菌的數(shù)量。其中ONPK處理真菌數(shù)量最高，較CK和NPK處理分別增加了90.0%和1.11倍，NPKJ、NPKM處理真菌數(shù)量次之，分別比對(duì)照增加了75.4%和65.8%。

Alpha多樣性指數(shù)分析表明，NPK處理真菌豐富度指數(shù)最大，比對(duì)照提高了6.1%，其次是ONPK和NPKM處理，分別比對(duì)照提高了5.1%和4.0%，NPKJ、NPKF豐富度指數(shù)較低，可能是秸稈還田對(duì)真菌豐富度有影響；NPKF、ONPK處理物種多樣性指數(shù)最大，分別比對(duì)照提高了4.0%和3.3%。同時(shí)，CK、NPKM、ONPK、NPKF處理的真菌多樣性仍保持較高水平。親緣關(guān)系顯示，NPKM和ONPK、NPKJ和NPKF親緣關(guān)系較近，而CK、NPK的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

4 結(jié)論

經(jīng)過(guò)連續(xù)11年的施肥，發(fā)現(xiàn)作物病原真菌在無(wú)肥對(duì)照土壤中數(shù)量較大，有機(jī)肥施用后有效抑制了土壤中真菌的種群密度。這與武曉森[19]研究結(jié)果一致。相比于單施化肥，配施秸稈還田土壤有機(jī)質(zhì)和堿解氮分別提升9.20%和12.03%。綜上所述，有機(jī)替代和秸稈還田在維持糧食產(chǎn)量的同時(shí)，能夠有效提高土壤微生物代謝活性，能有效維持土壤微生態(tài)平衡性，減少土壤養(yǎng)分的流失，提高了土壤可持續(xù)利用的能力。