呂 悅，張穎慧，孫宇婷，張 良，張 琳*，祖元剛

(1.東北林業(yè)大學化學化工與資源利用學院森林植物生態(tài)學教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150040；2.東北林業(yè)大學化學化工與資源利用學院林業(yè)生物制劑教育部工程研究中心，黑龍江哈爾濱 150040；3.東北林業(yè)大學化學化工與資源利用學院生物資源生態(tài)利用國家地方工程中心，黑龍江哈爾濱 150040；4.黑龍江省林源活性物質(zhì)生態(tài)利用重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150040；5.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院南院，黑龍江哈爾濱 150060)

半夏為天南星科植物半夏[Pinelliaternata(Thunb.)Berit.]的干燥塊莖，具有鎮(zhèn)咳、祛痰、止嘔等作用[1]。有研究報道半夏是有毒的，主要表現(xiàn)為強烈的黏膜刺激性(胃、腸道及咽喉)和肝臟損傷。王麗[2]將半夏總生物堿富集物提取出來，發(fā)現(xiàn)可導致小鼠肝損傷。中醫(yī)藥研究發(fā)現(xiàn)通過炮制可實現(xiàn)中藥的減毒增效[3]。因此半夏生品多外用，臨床上以炮制品(清半夏、姜半夏和法半夏)為主。清半夏為生半夏經(jīng)白礬溶液浸泡所得，毒性低，增強化痰作用；姜半夏為生半夏與生姜、白礬同煮晾干所得，毒性已減，止嘔作用增強；法半夏為生半夏用甘草、石灰和白礬制后得到，燥性較為和緩，常用于消食化痰[4-5]。經(jīng)過不同方法炮制后，半夏毒性明顯降低，但其主要毒性成分及含量還不是很明確。

半夏中所含化學成分種類很多，其中生物堿類化合物被認為是主要有效成分之一，但部分生物堿是有毒性的[6]。Zhai等[7]采用UPLC/Q-TOF-MS/MS對16份生半夏、制半夏進行分析，初步鑒定了溶血磷脂酰膽堿為特征標記物，溶血磷脂酰膽堿可誘導炎癥反應，因此半夏中溶血磷脂酰膽堿的降低是解毒的主要原因之一。據(jù)文獻報道，尿黑酸[8]、原兒茶酸和原兒茶醛[9]被認為是半夏辛辣味本質(zhì)，對黏膜具有強烈刺激性。大黃酚是大黃中蒽醌類化合物，有肝臟毒性以及致癌的風險[10]。有研究表明，半夏經(jīng)炮制后毒性會減弱，這可能與在炮制過程中半夏毒性成分的含量變化密切相關[5]。

目前，半夏的毒性研究主要集中在毒性成分的探析上，但比較炮制前后半夏毒性成分含量變化的研究報道較少。生物堿類成分紫外吸收較弱[11]，常規(guī)方法往往難以達到檢測目的，因此液質(zhì)聯(lián)用法是生物堿類成分測定的首選。該研究通過查閱文獻對半夏炮制品的化學成分進行篩選，篩選得到溶血磷脂酰膽堿、鹽酸麻黃堿、葫蘆巴堿、膽堿、原兒茶酸、原兒茶醛、尿黑酸和大黃酚這8種潛在毒性成分，采用超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)同時測定半夏中8種潛在的毒性成分，并測定其在半夏不同炮制品中的含量，利用主成分分析(PCA)和偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)[12]對炮制前后半夏中毒性成分含量進行分析，探討這些潛在毒性成分含量變化與半夏不同炮制方法之間的相關性，為半夏炮制品的毒性評價和質(zhì)量控制提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器1290-QQQ6460型超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀(美國Agilent公司)；UP-400S超聲波細胞破碎儀(上海熙揚儀器有限公司)；ME104電子天平(梅特勒公司)；SUS 304中藥粉碎機(圣順公司)。

1.2 藥材與試劑生半夏、姜半夏、法半夏、清半夏均購自四川成都康巴高原山珍中藥材基地，經(jīng)國藥集團黑龍江省藥材公司中藥師張軍鑒定均為正品。溶血磷脂酰膽堿(純度≥98%)、苦參堿(純度≥98%，內(nèi)標物)均購自成都德思特生物有限公司；鹽酸麻黃堿(純度≥99%)、野黃芩苷(純度≥98%，內(nèi)標物)均購自中國食品藥品檢定研究院；葫蘆巴堿(純度≥98%)、膽堿(純度≥90%)、原兒茶酸(純度≥98%)、原兒茶醛(純度≥98%)、尿黑酸(純度≥98%)、大黃酚(純度≥98%)均購自上海源葉生物有限公司；甲醇購自J&K Scientific；水為娃哈哈純凈水。

1.3 試驗方法

1.3.1標準品溶液制備。分別精密稱取溶血磷脂酰膽堿、鹽酸麻黃堿、葫蘆巴堿、膽堿、原兒茶酸、原兒茶醛、尿黑酸、大黃酚的標準品各10 mg，加一定量甲醇至10 mL，得濃度為1.0 mg/mL的標準品溶液。取各標準品溶液等量，加甲醇得濃度為2.0 μg/mL的混合標準品溶液，再進一步稀釋到不同濃度。精密稱量野黃芩苷、苦參堿標準品各5 mg，分別制得濃度為1.0 mg/mL，作為內(nèi)標溶液(IS)。取上述配制的不同濃度混合標準品溶液500 μL，加入甲醇490 μL、內(nèi)標溶液10 μL，混均，留存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2樣品溶液制備。將生半夏、姜半夏、法半夏、清半夏粉碎，過篩(60目)，備用。取半夏不同炮制品粉末各5.0 g，精密加入甲醇50 mL，并向其中加入內(nèi)標溶液10 μL，超聲波細胞破碎儀(功率360 W)提取30 min。連續(xù)提取2次，過濾，合并濾液。10 000 r/min離心10 min，取上清液進行UPLC-MS/MS測定。

1.3.3超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用條件。HPLC色譜柱為Waters ACQUITY UPLC HSST3(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)，流動相為甲醇-水溶液，進樣量4 μL，流速0.3 mL/min，柱溫30 ℃。梯度洗脫程序為0～6 min，25%～100%甲醇；6～10 min，100%甲醇。電噴霧離子源(ESI)作為質(zhì)譜離子源，載氣為氮氣。掃描方式為正負離子同時檢測，以多反應檢測(MRM)模式掃描。其他質(zhì)譜條件：干燥氣流量為11.0 L/min，毛細管電壓為3 000 V，離子源溫度為350 ℃，霧化氣壓力為137.9 kPa。8種潛在毒性成分以及內(nèi)標物的MRM質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 8種潛在毒性成分以及內(nèi)標物的主要質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Main mass spectrometric parameters of the 8 poential toxic compounds and IS

1.3.4方法學考察。

1.3.4.1線性關系考察。取不同濃度范圍的各標準品溶液按照“1.3.3”的條件進行UPLC-MS/MS測定(平行測定3次)。以各標準品的濃度與IS(正離子掃描模式的IS為苦參堿，負離子掃描模式的IS為野黃芩苷)濃度的比值為橫坐標(X)、峰面積與IS峰面積的比值為縱坐標(Y)進行線性回歸，計算各標準品的回歸方程、相關系數(shù)和線性范圍。

1.3.4.2檢出限與定量限。將線性范圍最低濃度的標準品溶液進行稀釋，進樣檢測，定量限(LOQ)為信噪比S/N=10時的標準品濃度，檢出限(LOD)為信噪比S/N=3時的標準品濃度。

1.3.4.3精密度試驗。取混合標準品溶液適量，按“1.3.3”的條件連續(xù)進樣6次，得到8種毒性成分的RSD值，檢測儀器精確度。

1.3.4.4重復性試驗。取生半夏樣品6份，按“1.3.2”方法制備樣品溶液，按“1.3.3”的條件測定樣品中各成分的含量，并計算各成分的RSD值，檢測該方法的重現(xiàn)性。

1.3.4.5穩(wěn)定性試驗。取生半夏樣品6份，按“1.3.2”方法制備樣品溶液，室溫存放0、1、2、4、8、12、24 h，按照“1.3.3”的條件測定樣品中各成分的含量，并計算各成分的RSD值，檢查樣品的穩(wěn)定性。

1.3.4.6加樣回收率試驗。取6份含量已知的生半夏粉末，每份約2 g，將相應標準品溶液加至每份樣品中，按“1.3.2”方法制備樣品溶液，按“1.3.3”的條件測定樣品中各成分的含量，并計算各成分的RSD值。

1.3.5半夏生品及其炮制品8種潛在毒性成分的含量測定。取生半夏(SBX)、姜半夏(JBX)、法半夏(FBX)、清半夏(QBX)粉末，按照“1.3.2”方法制備樣品溶液，按照“1.3.3”條件進行測定，記錄峰面積，計算半夏生品及其炮制品中8種潛在毒性成分的含量。

2 結果與分析

2.1 對照品與樣品的色譜圖圖1為半夏標準品和樣品的UPLC-MS/MS的色譜圖。如圖所示，利用梯度洗脫法測定8種毒性成分的分離效果良好，出峰時間適中。在MRM模式下的色譜圖顯示，溶血磷脂酰膽堿、膽堿、葫蘆巴堿、鹽酸麻黃堿、苦參堿、尿黑酸、原兒茶醛、原兒茶酸、大黃酚、野黃芩苷的保留時間分別為7.068、0.642、0.825、0.992、0.822、0.696、1.279、1.182、5.828、2.999 min，各峰分離良好，標準品溶液與樣品溶液目標峰的保留時間吻合，靈敏度高，峰形良好。

注：1.溶血磷脂酰膽堿；2.膽堿；3.葫蘆巴堿；4.鹽酸麻黃堿；5.苦參堿；6.尿黑酸；7.原兒茶醛；8.原兒茶酸；9.大黃酚；10.野黃芩苷。a1～a5、b1～b5為正離子模式；a6～a10、b6～b10為負離子模式。Note：1.Lysophosphatidylcholine；2.Choline；3.Trigonelline；4.Ephedrine hydrochloride；5.Matrine；6.Homogentisic acid；7.Protocatechuic aldehyde；8.Protocatechuic acid；9.Chrysophanol；10.Scutellarin.a1～a5，b1～b5 are positive ion modes；a6～a10 and b6～b10 are negative ion modes.圖1 半夏標準品(a)和樣品(b，生半夏)UPLC-MS/MS色譜圖Fig.1 UPLC-MS/MS chromatogram of Pinellia ternata standard(a)and sample(b，raw Pinellia ternate)

2.2 方法學考察

2.2.1線性關系。按“1.3.4.1”方法操作，結果見表2。從表2可以看出，8種潛在毒性成分在各自范圍內(nèi)具有良好的線性關系(R2≥0.999)。

2.2.2檢出限與定量限。按“1.3.4.2”方法操作，結果見表2。從表2可以看出，溶血磷脂酰膽堿、尿黑酸的定量限均為0.5 ng/mL，檢出限均為0.1 ng/mL；鹽酸麻黃堿和原兒茶酸定量限均為0.5 ng/mL，檢出限均為0.2 ng/mL；葫蘆巴堿定量限為0.4 ng/mL，檢出限為0.1 ng/mL；膽堿、原兒茶醛和大黃酚定量限均為0.3 ng/mL，檢出限均為0.1 ng/mL。

表2 8種潛在毒性成分的回歸方程、決定系數(shù)、線性范圍、定量限和檢出限Table 2 Regression equation，determination coefficient，linear range，quantitative limit and detection limit of 8 poential toxic components

2.2.3精密度試驗。按“1.3.4.3”方法操作，測得溶血磷脂酰膽堿、膽堿、葫蘆巴堿、鹽酸麻黃堿、原兒茶酸、原兒茶醛、尿黑酸和大黃酚的RSD值分別為3.99%、3.02%、4.82%、3.78%、3.67%、6.78%、3.26%、5.66%，均不超過10%，表明該儀器的精密度良好。

2.2.4重復性試驗。按“1.3.4.4”方法操作，測得溶血磷脂酰膽堿、膽堿、葫蘆巴堿、鹽酸麻黃堿、原兒茶酸、原兒茶醛、尿黑酸、大黃酚的RSD值分別為1.74%、5.81%、3.09%、3.68%、2.19%、4.75%、3.64%、7.85%，均不超過10%，表明該方法重復性良好。

2.2.5穩(wěn)定性試驗。按“1.3.4.5”方法操作，測得溶血磷脂酰膽堿、膽堿、葫蘆巴堿、鹽酸麻黃堿、原兒茶酸、原兒茶醛、尿黑酸、大黃酚的RSD值分別為3.94%、5.45%、4.67%、3.12%、3.86%、6.63%、3.76%、4.44%，均不超過10%，表明樣品溶液在室溫下放置24 h基本穩(wěn)定。

2.2.6加樣回收率試驗。按“1.3.4.6”方法操作，測得溶血磷脂酰膽堿、膽堿、葫蘆巴堿、鹽酸麻黃堿、原兒茶酸、原兒茶醛、尿黑酸、大黃酚的RSD值分別為1.83%、2.18%、2.28%、1.25%、2.46%、2.73%、3.90%、2.66%，均不超過10%，表明該方法準確性良好。

2.3 半夏生品及其炮制品中8種潛在毒性成分的含量分析從表3可以看出，總體來看，半夏炮制前后8種潛在毒性成分的總量從高到低依次為生半夏>清半夏>姜半夏>法半夏。而在半夏不同炮制品中，生半夏中的溶血磷脂酰膽堿、膽堿、葫蘆巴堿、原兒茶酸和大黃酚最多，法半夏的最少，溶血磷脂酰膽堿、原兒茶酸和大黃酚的含量順序為生半夏>清半夏>姜半夏>法半夏，鹽酸麻黃堿的含量順序為生半夏>清半夏>法半夏>姜關夏，膽堿、葫蘆巴堿的含量順序為生半夏>姜半夏>清半夏>法半夏，原兒茶醛的含量順序為姜半夏>清半夏>生半夏>法半夏，尿黑酸的含量順序為清半夏>法半夏>姜半夏>生半夏。

表3 半夏生品及其炮制品中8種潛在毒性成分含量測定結果Table 3 Determination results of 8 potential toxic components in raw Pinellia ternata and its processed products 單位：mg/g

2.4 多元統(tǒng)計分析

2.4.1主成分分析(PCA)。主成分分析是一種多變量統(tǒng)計方法，用于分析多個變量之間的相關性[13]。該研究中，PCA被用來分析半夏生品及炮制品之間毒性成分的差異。選取半夏生品及其不同炮制品各5份，按照“1.3.2”方法制備樣品溶液，按照“1.3.3”條件測定半夏生品及其炮制品中溶血磷脂酰膽堿、膽堿、葫蘆巴堿、鹽酸麻黃堿、原兒茶酸、原兒茶醛、尿黑酸、大黃酚的含量。利用Origin 9.1軟件對半夏生品及其炮制品中8種潛在毒性成分含量進行PCA分析，得到Score plot圖(圖2)。

由圖2可知，按照8種潛在毒性成分含量來劃分，半夏生品與其炮制品聚集成4類，表明他們之間存在一定差異性。樣品間相離越遠表示差異性越大，姜半夏(JBX1～JBX5)和清半夏(QBX1～QBX5)分布的距離較小，表明姜半夏與清半夏的毒性成分含量差異較小。

2.4.2偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)。為更好地觀察生品與不同炮制品之間毒性成分的差異，采用監(jiān)督模式識別方法的偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)。根據(jù)PLS-DA篩選出半夏生品及其炮制品潛在標志性差異成分[12]。利用SIMCA軟件對炮制前后半夏的8種潛在毒性成分含量進行PLS-DA。

由PLS-DA得分(圖3)可知，生半夏((SBX1～SBX5)、姜半夏(JBX1～JBX5)、清半夏(QBX1～QBX5)、法半夏(FBX1～FBX5)各自聚為一類，與PCA分析結果一致。FBX和JBX相鄰，表明它們毒性含量差異較小。與PCA結果比較可知，生半夏與其炮制品(JBX、FBX和QBX)明顯區(qū)分，表明生半夏與炮制品的毒性成分特征差異較大。

圖2 半夏生品及其炮制品中含量PCA分析后的Score plot圖Fig.2 Score plot of content in raw and processed Pinellia ternata after PCA analysis

為進一步尋找對上述樣本分類有較大貢獻的成分，該研究以變量重要性投影值(variable importance in projection，VIP)>1.0(即該變量對整體模型的貢獻度高于平均水平)為標準，篩選出膽堿、鹽酸麻黃堿和原兒茶酸3種成分是對半夏生品及其炮制品差異貢獻較大的指標性成分，也可能是半夏炮制后毒性降低的相關成分(圖4)。

圖3 半夏生品及其炮制品的PLS-DA得分Fig.3 PLS-DA score of raw Pinellia ternata and its processed products

圖4 半夏生品及其炮制品中8種毒性成分的VIP值Fig.4 VIP values of 8 toxic components in raw and processed Pinellia ternata

3 結論與討論

該研究建立的UPLC-MS/MS分析方法，能夠同時定量半夏生品及其炮制品中8種潛在毒性成分。試驗過程中曾嘗試過高效液相法測定，但因為溶血磷脂酰膽堿、鹽酸麻黃堿的紫外吸收弱，且梯度洗脫過程中基線不穩(wěn)定，而質(zhì)譜具有靈敏度高、干擾性小等優(yōu)點，所以采用UPLC-MS/MS為檢測方法。在檢測過程中，由于基質(zhì)效應會引起檢測信號發(fā)生變化，所以選擇了合適的內(nèi)標物來提高分析結果的準確度和精密度。另外8種潛在毒性成分性質(zhì)相差極大，其中包括有機酸類和生物堿類，故采用多反應監(jiān)測(MRM)法測定時，選擇正離子檢測和負離子檢測2種模式測定8種潛在毒性成分的MRM離子對，定量離子峰形良好，沒有其他物質(zhì)的影響，能夠精準定量待測物質(zhì)。該研究所建立的方法分離能力強、靈敏度高、定量分析結果可靠、檢出限低，可用于半夏中8種成分的含量測定，為后續(xù)的分析奠定方法學基礎。

該研究對半夏中8種潛在毒性成分進行定量分析，得出8種潛在毒性成分總含量從高到低依次為生半夏>清半夏>姜半夏>法半夏，與高昌琨等[14]研究所得的毒性強弱結果一致，但通過研究證明尿黑酸和原兒茶醛經(jīng)炮制之后含量降低，推測其可能不是半夏中含有的毒性成分。經(jīng)PCA和PLS-DA分析，生半夏與不同炮制品之間毒性成分含量差異較大，膽堿、鹽酸麻黃堿和原兒茶酸是造成樣品間毒性差異的主要成分，可能是生半夏中潛在的毒性成分。該研究所建立的方法簡便、可靠、靈敏度高，結合多元統(tǒng)計分析可用于分析半夏潛在毒性物質(zhì)的基礎，為生半夏炮制減毒的機理提供了可靠的分析方法和理論依據(jù)。