劉 念，姜 鵬，戴凌燕，阮長青，張東杰, ，王長遠(yuǎn)，李志江,

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶 163319；2.黑龍江省雜糧加工及質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心，黑龍江大慶 163319；3.國家雜糧工程技術(shù)中心，黑龍江大慶 163319；4.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江大慶 163319）

高梁（Sorghum bicolorL.Moench）是第五大谷類作物，富含人體所需的多種營養(yǎng)成分及活性物質(zhì)，能夠預(yù)防癌癥、改善心血管疾病、降低糖尿病患病風(fēng)險，具有較高的營養(yǎng)價值和保健功能[1?2]。當(dāng)前，以精細(xì)米面為主食的飲食結(jié)構(gòu)易引起糖尿病、高血壓等多種慢性疾病，“合理搭配，謹(jǐn)和五味”的多元化合理飲食受到越來越多人們的關(guān)注與重視[3]。將高粱與常見主食大米進行復(fù)配后食用，既可提高單一食用大米時的保健價值，又可改善高粱的適口性。

高粱富含人體健康所需的多種不飽和脂肪酸和必需脂肪酸，在膳食中作用突出[4]。食物中的油脂需經(jīng)過消化吸收后才能被人體利用。評估食物消化常用實驗方法為細(xì)胞培養(yǎng)、體內(nèi)消化及體外消化，其中體外消化模型主要是以商品酶或人體消化液提取液為消化酶，模擬人體消化環(huán)境進行食物的體外消化，被廣泛用于食物成分在模擬胃腸道條件下釋放情況、生物可及性、樣品穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)變化等研究，具有靈活性、準(zhǔn)確性和重復(fù)性高等優(yōu)點[5?6]。目前，體外消化法已被證明在預(yù)測體內(nèi)消化結(jié)果方面非常有效，并且與體內(nèi)研究和細(xì)胞研究相比成本低、實驗周期短，不受道德倫理束縛[7?9]。關(guān)于脂質(zhì)體外模擬消化的研究開始較早，二十世紀(jì)七十年代，運用體外實驗將唾液脂肪酶和胰脂肪酶對牛乳脂肪分解的影響結(jié)果進行比較[10]。近年來的研究多為消化液的成分、其他外在添加物及油脂本身結(jié)構(gòu)性質(zhì)對脂肪體外消化的影響。脂肪消化產(chǎn)物主要為游離脂肪酸，脂肪酸檢測方法較多，如氣相色譜法（GC）、高效液相色譜法（HPLC）和近紅外光譜法（NIRS）等，其中GC應(yīng)用最為廣泛[11]。GC主要是依據(jù)各脂肪酸碳鏈長度、雙鍵幾何構(gòu)型的不同，使其在色譜柱固定相中保留的時間不同來進行定性定量分析檢測[12]。但由于油酸和亞油酸等有些脂肪酸保留時間很接近，可采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS），根據(jù)已有的成熟標(biāo)準(zhǔn)譜圖數(shù)據(jù)庫，對未知化合物進行快速檢索和鑒定，具有靈敏度高、檢出限低、分離度好等優(yōu)點[13?14]。

目前，脂肪體外消化研究大多圍繞著純油脂而展開，很少有針對純食物的脂肪消化研究，在高粱膳食脂肪方面研究也鮮有報道[15?16]。本研究考慮食物基質(zhì)等對脂肪消化的影響，對高粱大米復(fù)配米飯整體進行體外模擬消化，探究復(fù)配米飯脂肪的消化產(chǎn)物及氧化穩(wěn)定性，從而根據(jù)其消化的特性指導(dǎo)高粱大米復(fù)配米飯開發(fā)，為高粱等雜糧的食用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

龍米糧1號高粱、龍粳13大米 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供；α-淀粉酶（100 U/g）、胃蛋白酶（30 U/g）、胰蛋白酶（2500 U/g）、脂肪酶（30 U/g）、人工胃液、人工腸液 上海源葉生物科技有限公司；膽鹽 北京索萊寶科技有限公司；游離脂肪酸試劑盒、丙二醛試劑盒 南京建成生物工程研究所；其他試劑無特殊說明均為分析純級。

GL124-1SCN萬分之一天平 德國賽多利斯公司；ZWF-110X50恒溫培養(yǎng)震蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；UV-1500PC紫外可見分光光度計 上海美析儀器有限公司；QL-866渦旋儀 長安科學(xué)儀器；Agilent 7890/5975C氣-質(zhì)聯(lián)用儀 美國安捷倫科技公司；Agilent DB-WAX色譜柱30 m×0.25 mm ID×0.25 μm 美國安捷倫科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品熟化 參考姜鵬等[17]方法，將高粱清洗除雜后于45 ℃溫水中浸泡2 h，待表面水分自然風(fēng)干后，600 W條件下微波8 min，對高粱進行預(yù)熟化。依據(jù)課題組前期所做的不同比例高粱大米復(fù)配米飯食味值實驗的結(jié)果，選擇高粱大米質(zhì)量比1:4復(fù)配米和高粱大米質(zhì)量比1:1復(fù)配米進行實驗。本實驗樣品分為高粱、大米、高粱大米質(zhì)量比1:4復(fù)配米、高粱大米質(zhì)量比1:1復(fù)配米4組，分別記為1-0組、0-1組、1-4組、1-1組。樣品按水米質(zhì)量比1.6:1添加蒸餾水，蒸煮20 min，關(guān)火燜制10 min。

1.2.2 脂肪含量的測定 參照GB 5009.6-2016，稱取熟化樣品5 g，移入濾紙筒內(nèi)后放入索氏抽提器的抽提筒內(nèi)，接收瓶中加入石油醚，于水浴上加熱，抽提5 h?；厥帐兔?，將接收瓶于（100±5） ℃干燥直至恒重。

1.2.3 模擬體外消化過程 根據(jù)食品靜態(tài)體外消化國際共識模擬體外消化過程[18]：

口腔消化：取5 g熟化后樣品，加入4 mL人工唾液（NaCl 0.4 mg/mL、KCl 0.4 mg/mL、Na2S·2H2O 0.005 mg/mL、NaH2PO4·H2O 0.78 mg/mL），100 U/gα-淀粉酶7.6 mg，0.3 mol/L CaCl2溶液25 μL，975 μL蒸餾水，充分破碎食物后，反應(yīng)2 min。

胃消化：在上述模擬口腔消化后的消化液中，依次加入9.1 mL人工胃液，30 U/g胃蛋白酶1.34 g，0.3 mol/L CaCl2溶液5 μL，695 μL蒸餾水，使用1 mol/L HCl溶液將消化液pH調(diào)至3.0，于37 ℃恒溫水浴搖床反應(yīng)2 h。

腸消化：在上述模擬胃消化后的消化液中，分別加入18.5 mL人工腸液，2500 U/g胰蛋白酶1.6 mg，30 U/g脂肪酶2.67 g，100 U/gα-淀粉酶0.08 g，膽鹽20 mg，0.3 mol/L CaCl2溶液40 μL，1.31 mL蒸餾水，使用1 mol/L NaOH溶液將消化液pH調(diào)至7.0，于37 ℃恒溫水浴搖床反應(yīng)2 h。

每個樣品進行3次重復(fù)體外消化，將模擬消化后的胃液、腸液3500 r/min離心10 min，取上清液用于后續(xù)檢測。

1.2.4 脂肪酸種類及含量的測定

1.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)品配制 采用40種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液制成0.5、1、5、10、25、50、100、250、500、1000 mg/L共10個混合標(biāo)準(zhǔn)濃度梯度，其中濃度為各組分的總濃度。40個脂肪酸甲酯的標(biāo)準(zhǔn)品中，各組分濃度占總濃度的比例有2%、4%兩個梯度。其中，30種組分占2%，10種組分占4%。取500 μL混合標(biāo)準(zhǔn)品，加入25 μL濃度為500 ppm的正十九酸甲酯作為內(nèi)標(biāo)，混勻加入進樣瓶，進入GCMS檢測，進樣量1 μL，分流比10:1，分流進樣。

1.2.4.2 脂肪提取 取樣品1 mg或100 μL消化液上清液于2 mL玻璃離心管中，加入1 mL氯仿-甲醇溶液，超聲30 min，取上清液，加入1%硫酸-甲醇溶液2 mL，放在80℃水浴上，甲酯化0.5 h。再加入1 mL正己烷萃取，5 mL純水洗滌，吸取上清液500 μL，加入25 μL正十九酸甲酯作為內(nèi)標(biāo)，混勻加入進樣瓶，進入GC-MS檢測，進樣量1 μL，分流比10:1，分流進樣。

1.2.4.3 氣相色譜條件 樣品采用Agilent DB-WAX毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm ID×0.25 μm）氣相色譜系統(tǒng)進行分離。程序升溫：初始溫度50 ℃，保持3 min，以10 ℃/min升溫至220 ℃，并維持5 min。載氣為氦氣，載氣流速1.0 mL/min。樣本隊列中每間隔一定數(shù)量的實驗樣本設(shè)置一個QC樣本，用于檢測和評價系統(tǒng)的穩(wěn)定性及重復(fù)性。

1.2.4.4 質(zhì)譜分析 采用Agilent 7890/5975C氣-質(zhì)聯(lián)用儀進行質(zhì)譜分析。進樣口溫度280 ℃，離子源溫度230 ℃，傳輸線溫度250 ℃。電子轟擊電離（EI）源，SIM掃描方式，電子能量70 eV。

1.2.5 游離脂肪酸釋放量的測定 取各樣品消化液上清液0.2 mL，按照游離脂肪酸試劑盒說明書進行，于440 nm下測定其吸光度。

1.2.6 過氧化值的測定 參考GB 5009.227-2016，取1 mL上清液，加入3 mL三氯甲烷-冰乙酸混合液，充輕輕振搖使試樣完全溶解。準(zhǔn)確加入1.0 mL飽和碘化鉀溶液，蓋緊瓶蓋，輕輕振搖，暗處放置3 min。取出加入10 mL水，搖勻后立即用0.01 mol/L硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，至溶液透明無色。同時進行空白實驗。

1.2.7 丙二醛含量的測定 取各樣品消化液上清液0.1 mL，按照丙二醛試劑盒說明書進行，于532 nm處測其吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

樣品采用三次平行取樣，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。采用MSD ChemStation軟件提取色譜峰面積及保留時間，利用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS23.0和Origin 8.0進行分析作圖，采用單因素方差分析比較各組間數(shù)據(jù)，t檢驗法分析組間差異顯著性，P<0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 高粱與大米脂肪含量及組成

高粱總脂肪含量為2.81%，大米僅為0.39%，高粱脂肪含量高于大米的脂肪含量。高粱經(jīng)微波蒸煮后總脂肪含量降低至2.38%，大米經(jīng)蒸煮后降至0.35%。與Afify等[19]研究結(jié)果相似，除浸泡處理外，蒸煮、發(fā)芽、微波等處理均會顯著降低高粱中的脂肪含量。Kumar等[20]研究也表明，蒸煮可使大米的脂肪提取率降低2.6%～9.9%。脂肪含量的降低可能是由于在熟化過程中脂質(zhì)發(fā)生降解或形成了脂肪-蛋白質(zhì)、脂肪-淀粉等復(fù)合物[15]。

高粱與大米熟化前后脂肪酸組成及含量如表1所示，高粱和大米中共檢測出30種脂肪酸，主要脂肪酸為亞油酸、油酸、棕櫚酸、亞麻酸和硬脂酸，以上5種脂肪酸占到總脂肪酸含量的95%以上。經(jīng)過熟化后，仍可檢測出30種脂肪酸，并沒有出現(xiàn)新的脂肪酸，各脂肪酸含量均有所降低，這與測定的總脂肪含量變化具有一致性。高粱中飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸含量分別降低23.82%、21.06%、25.07%，大米分別降低25.70%、18.38%、12.93%。研究發(fā)現(xiàn)，高粱經(jīng)蒸煮后，飽和脂肪酸降低33%，不飽和脂肪酸降低30%；高粱經(jīng)微波處理后，飽和脂肪酸降低56%，不飽和脂肪酸降低64%[19]。微波和蒸煮等處理會降低高粱中的脂肪酸含量，本實驗與之相比減少程度較低可能是由于蒸煮時間、微波時間和功率等實驗條件的不同。

表1 高粱與大米熟化前后脂肪酸含量（μg/g）Table 1 Fatty acid content of sorghum and rice before and after maturation (μg/g)

雖然熟化過程中的熱處理會降低高粱和大米中各脂肪酸含量，但各脂肪酸占總脂肪比例變化不明顯。熟化后，高粱和大米主要脂肪酸仍為亞油酸、油酸、棕櫚酸、亞麻酸和硬脂酸，分別占高粱總脂肪酸的51.21%、31.51%、10.63%、4.48%和1.36%，大米的48.55%、24.06%、21.00%、1.54%和2.11%。研究表明，高粱中主要脂肪酸為亞油酸、油酸、棕櫚酸、亞麻酸和硬脂酸，分別為43.33%、37.15%、13.73%、1.55%和1.07%，微波處理后變?yōu)?3.39%、37.12%、13.73%、1.54%和1.07%[21]。大米中主要脂肪酸為油酸、亞油酸、棕櫚酸、硬脂酸和亞麻酸，分別為41.3%、32.4%、19.6%、3.5%和0.8%，經(jīng)蒸煮后變?yōu)?2.0%、31.2%、19.0%、4.6%和0.8%[22]。蒸煮和微波處理對高粱和大米的脂肪酸組成影響不大，主要脂肪酸仍是亞油酸、油酸、棕櫚酸、亞麻酸和硬脂酸。本實驗結(jié)果與其相似，但由于高粱和大米的品種和生長環(huán)境的不同，脂肪酸含量會有變化[4]。

2.2 消化液中游離脂肪酸含量

油脂在胃腸中可被消化酶水解為甘油二酯、甘油一酯和游離脂肪酸等，因此胃腸液中游離脂肪酸的含量可用來反映脂質(zhì)的消化程度[23]。樣品消化后胃腸液中游離脂肪酸含量由圖1所示，腸液中的游離脂肪酸的含量顯著高于胃液（P<0.05），脂質(zhì)在腸中的脂解程度更高。小腸是脂肪消化的主要部位，腸液中脂肪消化酶的含量高于胃液[24]。胃液中，高粱組（0.38 μmol/g）與1:1復(fù)配米組（0.32 μmol/g）的游離脂肪酸含量最高，其次為1:4復(fù)配米組（0.20 μmol/g）和大米組（0.18 μmol/g）。腸液中，高粱組中的游離脂肪酸的含量最高（15.15 μmol/g），其次為1:1復(fù)配米（9.70 μmol/g）和1:4復(fù)配米組（7.89 μmol/g），最低為大米組（5.95 μmol/g）。主要是由于樣品中高粱所占比例增加，脂肪含量增加，消化后的游離脂肪酸的含量也隨之增加。但與此同時，脂肪酸釋放率和消化程度隨著樣品中脂肪含量的增加而降低。經(jīng)胃液消化后，大米組脂肪酸釋放率最高，為2.06%，其次為1:4復(fù)配米和1:1復(fù)配米組，分別為1.17%和1.11%，最低為高粱組，為0.50%。經(jīng)腸液消化后，大米和1:4復(fù)配米組最高，分別為67.71%和46.31%，其次為1:1復(fù)配米組，為33.02%，最低的為高粱組，為30.28%。主要是由于脂肪消化產(chǎn)物的積累會抑制肪酶的活性，游離脂肪酸含量越高則脂肪酶的活性越低，樣品游離脂肪酸釋放率越低[25]。研究者將150、300和850 mg玉米油進行體外腸道消化，結(jié)果顯示850 mg的脂質(zhì)消化程度最低，但其釋放的游離脂肪酸含量最高[26]。此外，本實驗的復(fù)配米脂質(zhì)消化率低于葉展[27]研究的棕櫚油（71.97%）、菜籽油（69.01%）等典型膳食油脂的消化率，主要是由于脂質(zhì)與蛋白質(zhì)、碳水化合物之間存在相互作用，脂質(zhì)分解受固體食物基質(zhì)分解速率和程度的制約[28?29]。

圖1 樣品消化后胃腸液中游離脂肪酸含量Fig.1 Free fatty acid content in gastrointestinal fluid of samples after digestion

2.3 消化產(chǎn)物脂肪酸種類及含量

各組樣品消化后胃液、腸液中脂肪酸種類及含量如表2、表3所示。相比于原樣，樣品消化后脂肪酸種類及組成比例發(fā)生明顯變化。消化前各組樣品中存在的癸酸、十三酸、二十碳三烯酸、二十二碳五烯酸、二十三酸在胃腸液中含量均低于檢測范圍，未被檢測到。四組樣品胃液中脂解主要產(chǎn)物為棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸和芥酸，腸液中主要為棕櫚酸、硬脂酸和亞油酸，消化前樣品中含量較高的油酸和亞麻酸在胃腸液中含量較低。飽和脂肪酸棕櫚酸和硬脂酸的消化率高于不飽和脂肪酸油酸、亞油酸和亞麻酸。研究顯示，豆油乳劑體外消化后各脂肪酸的釋放百分比，其中棕櫚酸和硬脂酸的釋放率也顯著高于亞麻酸、油酸和亞油酸[30]，原因可能是飽和脂肪酸棕櫚酸和硬脂酸主要占據(jù)甘油三酯分子Sn-1和Sn-3位，而不飽和脂肪酸油酸、亞油酸等通常占據(jù)Sn-2位，胰脂肪酶對Sn-1和Sn-3位特異性導(dǎo)致消化過程中棕櫚酸和硬脂酸的釋放量更大。

表2 樣品消化后胃液中脂肪酸種類及含量（μg/g）Table 2 Types and contents of fatty acids in gastric juice after sample digestion (μg/g)

表3 樣品消化后腸液中脂肪酸種類及含量（μg/g）Table 3 Types and contents of fatty acids in intestinal fluid after sample digestion (μg/g)

不飽和脂肪酸代替飽和脂肪酸的攝入，可改善高膽固醇血癥和高甘油三酯血癥，保持人體正常的血脂水平，預(yù)防動脈粥樣硬化，降低冠心病的發(fā)病危險[31]。不飽和脂肪酸中的亞油酸及α-亞麻酸為人體必需脂肪酸，人體無法合成，主要通過食物提供[32]。但食物中的油脂并不能被人體直接利用，必須經(jīng)過胃腸道消化吸收后才可以參與人體代謝[27]。經(jīng)體外胃腸模擬消化后，1:4復(fù)配米組、1:1復(fù)配米組不飽和脂肪酸含量分別為28.50%、34.34%，大米組不飽和脂肪酸含量為21.75%。相比于大米，復(fù)配米組中的不飽和脂肪酸所占比例更高。亞油酸在1:1復(fù)配米組和1:4復(fù)配米組中的含量分別為91.41、59.36 μg/g，顯著高于大米組（27.93 μg/g）（P<0.05）。α-亞麻酸在1:1復(fù)配米組和1:4復(fù)配米組的含量分別為3.05、1.83 μg/g，也顯著高于大米組（0.83 μg/g）（P<0.05）。因此，在等量攝入的情況下，相比于大米，高粱大米復(fù)配米會使人體吸收攝入的不飽和脂肪酸比例和人體必需脂肪酸含量有所提升，改善飲食脂肪酸攝入吸收平衡。

續(xù)表 3

2.4 消化產(chǎn)物的氧化穩(wěn)定性

由于強酸、酶、膽鹽、鹽離子等作用，脂質(zhì)在胃腸道內(nèi)消化過程中易發(fā)生氧化反應(yīng)，其生成的初級和次級代謝產(chǎn)物會被人體吸收進而在體內(nèi)積累，損害正常細(xì)胞和功能，危害人體健康[33?34]。過氧化值（POV）可表示初級氧化產(chǎn)物，丙二醛（MDA）則是次級氧化產(chǎn)物，兩者共同檢測可更全面說明脂質(zhì)在模擬消化過程中的氧化反應(yīng)[35]。

由圖2、圖3可知，1:1復(fù)配米和1:4復(fù)配米組胃液中的POV值和MDA含量均顯著低于高粱組（P<0.05），腸液中的POV值顯著低于高粱組（P<0.05），MDA含量與高粱組差別不顯著。由上述結(jié)果2.3可知，1:1復(fù)配米和1:4復(fù)配米組在胃液中不飽和脂肪酸含量分別為22.53和10.63 μg/g，在腸液中不飽和脂肪酸含量分別為109.57和73.29 μg/g，均顯著低于高粱組在胃腸液中不飽和脂肪酸含量30.20和185.42 μg/g。而脂質(zhì)氧化作用主要是發(fā)生在不飽和脂肪酸共價鍵上的自由基反應(yīng)，復(fù)配米組不飽和脂肪酸含量較高粱組低，POV值也較低[35]。MDA含量差別不顯著可能是由于MDA為次級氧化產(chǎn)物，是以初級氧化產(chǎn)物作為底物進一步氧化分解，而在消化過程中初級氧化產(chǎn)物尚未分解完全[36]。

圖2 樣品消化后胃腸液過氧化值Fig.2 Peroxide value of gastrointestinal fluid after sample digestion

圖3 樣品消化后胃腸液中丙二醛含量Fig.3 Malondialdehyde content in gastrointestinal fluid after sample digestion

總之，在等量攝入的情況下，相比于高粱，高粱大米復(fù)配米會減少人體對脂質(zhì)氧化產(chǎn)物的吸收積累。此外，1:1復(fù)配米和1:4復(fù)配米組腸液中MDA含量、1:4復(fù)配米組腸液POV值與大米組差別不顯著，1:1復(fù)配米組腸液POV值低于大米組，可能是高粱中具有抗氧化性的多酚、單寧等活性物質(zhì)所導(dǎo)致[3]。由此可知，即使復(fù)配米組中不飽和脂肪酸含量高于大米組，但其與大米組在腸中產(chǎn)生的氧化代謝產(chǎn)物含量差別不顯著。所以相比于等量攝入大米，高粱大米復(fù)配米既可提高不飽和脂肪酸攝入量，也不會增加腸中脂質(zhì)氧化產(chǎn)物的吸收積累。

3 結(jié)論

高粱富含人體健康所需的不飽和脂肪酸和人體必需脂肪酸亞油酸和α-亞麻酸。但脂肪并不能被人體直接利用，需經(jīng)過胃腸道消化后才可以被人體吸收代謝，將高粱與大米復(fù)配或單獨進行體外胃腸模擬消化，可為糧食脂肪的體內(nèi)消化提供參考。經(jīng)消化后，1:1復(fù)配米、1:4復(fù)配米不飽和脂肪酸含量為34.34%和28.50%，亞油酸含量為91.41和1.83 μg/g，α-亞麻酸含量為3.05和1.83 μg/g，均顯著高于大米組（P<0.05）。與大米相比高粱復(fù)配米改善了攝入的飲食脂肪酸組成。此外，1:1復(fù)配米、1:1復(fù)配米經(jīng)消化后腸液中POV值為33.83和43.16 nmol/g，均低于高粱組。與高粱相比，高粱復(fù)配米減少了人體對脂質(zhì)氧化產(chǎn)物的吸收積累。因此，高粱復(fù)配米為高粱的食用方法提供一種新思路，本實驗也從攝入脂肪角度為高粱大米復(fù)配米飯開發(fā)研究提供理論依據(jù)。但消化后的脂肪酸還需經(jīng)過腸道吸收后才可進入體內(nèi)，因此要探究復(fù)配米的脂肪對人體作用還需后續(xù)吸收代謝方面研究。