尹雪蓮，白 雪，朱 凱，戴志遠(yuǎn),2,

（1.浙江工商大學(xué)海洋食品研究院，浙江杭州 310012；2.浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310012）

蝦是重要的漁業(yè)資源，自2013年以來，我國蝦養(yǎng)殖和產(chǎn)量呈逐年上升趨勢，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2020年蝦總產(chǎn)量達(dá)630.73萬噸，位居世界前列[1]。蝦的副產(chǎn)物，頭、殼和尾等部位，占整蝦重量的50%～60%[2]，因此在加工過程中會產(chǎn)生大量加工廢棄物[3]。目前，僅有少部分用作養(yǎng)殖業(yè)飼料，絕大部分沒有得到有效處理和利用，帶來資源浪費(fèi)與環(huán)境負(fù)擔(dān)[4]。通過酶解副產(chǎn)物以回收其中的蛋白質(zhì)資源是當(dāng)前較流行的副產(chǎn)物高值化利用的方法[5?6]。酶解法需要添加外源性的酶，成本較高。與此同時(shí)，蝦消化系統(tǒng)中內(nèi)源性酶卻并未得到有效利用，造成資源浪費(fèi)。有報(bào)道指出，蝦副產(chǎn)物的自溶產(chǎn)物具有抗氧化和抑菌活性，是活性肽的優(yōu)良來源[7?8]。

抗凍肽（antifreeze peptide，AFP）是具有熱滯活性和冰晶生長抑制能力的優(yōu)秀水產(chǎn)制品抗凍劑[9]。從酶解產(chǎn)物中尋找抗凍肽一直是研究熱點(diǎn)。其中Chen等[10]報(bào)道了羅非魚鱗片水解物對嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）的低溫保護(hù)作用；Du等[11]從雞皮膠原中篩選出具有冰晶生長抑制作用的AFPs。一般來說，鑒定和表征AFPs的流程包括原料酶解、從水解物的復(fù)雜產(chǎn)物中分離純化和定性分析等步驟[12]，費(fèi)力且低效。近年來，隨著高通量質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，多肽組學(xué)（peptidomics）技術(shù)成為分析水解液中復(fù)雜多肽產(chǎn)物的有效方法[13]。此法被廣泛應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品副產(chǎn)物的高值化加工[14?15]。研究人員已成功從辣椒種子[16]和乳清[17]中制備得到具有抑菌、抗氧化和ACE抑制活性的肽。已有部分研究在蝦副產(chǎn)物中提取油脂產(chǎn)物，但蝦副產(chǎn)物也是蛋白質(zhì)的良好來源，相關(guān)技術(shù)還未成熟，基于此，本文通過蝦副產(chǎn)物的自溶反應(yīng)，研究了自溶過程中酶解產(chǎn)物的多肽組成變化，利用活性預(yù)測平臺從中篩選抗凍肽序列，旨在為海洋副產(chǎn)物的高值化利用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鷹爪蝦 購于舟山國際水產(chǎn)城，冰盒保險(xiǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室；三氯乙酸、鄰苯二甲醛、絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)品（98%）、四硼酸鈉、二硫蘇糖醇 均為國產(chǎn)分析純，中國國藥集團(tuán)；A045-3型BCA蛋白定量試劑盒南京建成生物科技有限公司。

Freeze Zone冷凍干燥機(jī) 美國Labconco公司；粉碎機(jī) 永康市紅太陽機(jī)電有限公司；紫外燈 蘇州國牛燈具有限公司；恒溫水浴鍋 上海力辰儀器科技有限公司；SORVALL LYNX 4000離心機(jī)、Evolution 60S紫外測定儀 美國Thermo公司；RE-3000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器公司；T18高速分散機(jī) 德國IKA集團(tuán)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 自溶產(chǎn)物制備 鷹爪蝦流水解凍，采集蝦頭、外骨骼、腹足、蝦尾等副產(chǎn)物，使用去離子水清洗。隨后凍干至水分含量低于10%并粉碎成粉末。將副產(chǎn)物粉末與水按照1:3（w/w）的比例調(diào)配成勻漿。自溶處理前，為提高內(nèi)源性蛋白酶活性，將勻漿倒入30 cm×20 cm的瓷盤中，勻漿厚度5 mm，隨后至于253.7 nm紫外燈照射20 min（高度25 cm）[18?19]。自溶反應(yīng)在原始pH（7.81～7.83）和50 ℃水浴條件下進(jìn)行，分別自溶處理0.5、1、1.5、2、3、4、5、6 h，隨后將酶解產(chǎn)物95 ℃水浴加熱20 min用于對內(nèi)源酶滅活。在10000 r/min、4 ℃條件下離心收集15 min，并用雙層濾紙抽濾上層清液，得到最終自溶產(chǎn)物。冷凍干燥72 h即可得酶解物粉末，裝入封口袋密封并置于?18 ℃保存。

1.2.2 TCA可溶性肽含量測定 參考Nikoo等[7]的方法測定不同處理時(shí)間的酶解物中TCA可溶性肽含量，并略作修改。1 mL自溶產(chǎn)物與9 mL 5% TCA溶液混合并振蕩30 s，隨后4 ℃，10000 r/min下離心10 min，收集上清。采用BCA蛋白定量試劑盒測定上清液中TCA可溶性肽含量。

1.2.3 水解度（DH）測定 采用OPA法[20?21]測定不同自溶處理時(shí)間酶解物的DH值，略作修改。取0.3 g自溶產(chǎn)物溶于去離子水，并定容至100 mL，制得樣品溶液；取7.620 g四硼酸鈉，200 mg SDS，160 mg OPA，176 mg DTT和4 mL乙醇溶于水中，并定容至150 mL，制得OPA溶液。400 mL樣品溶液（Asample）、0.9516 mmol/L絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（Astandard）和去離子水（Ablank）中分別加入3 mL OPA溶液，孵育2 min，隨后于340 nm波長處測定吸光度。DH值（%）按照以下公式計(jì)算：

式中：h=（serine-NH2-b）/a meqv/g protein；htot是每個(gè)蛋白質(zhì)當(dāng)量的肽鍵摩爾數(shù)；對于蝦肉蛋白，htot=8，b=0.4，a=1[22]。

Serine-NH2表示絲氨酸氨基的毫摩爾數(shù)：

式中：X表示樣品重量；P表示樣品蛋白含量。

1.2.4 多肽組學(xué)分析

1.2.4.1 還原烷基化 在進(jìn)行LC-MS/MS分析之前，樣品需要先經(jīng)過還原烷基化處理。將100 mL 20 mg/mL樣品-ddH2O溶液與100 mL 20 mmol/L DTT溶液混勻，隨后于56 ℃水浴中1 h。之后加入200 mL 100 mmol/L碘乙酰胺溶液并室溫避光孵育40 min以完成烷基化。45 ℃真空旋蒸去除溶劑并用2～20 mL 0.1%甲酸溶解。

1.2.4.2 LC-MS/MS分析 液相色譜條件：進(jìn)樣量5 mL；色譜柱150 mm×15 cm C18-AQ反向納米柱；流動相：A：0.1%甲酸水溶液、B：0.1%甲酸乙腈溶液；流速600 nL/min；梯度洗脫：0～3 min 4%～8%B相、3～89 min 8%～28% B相、89～109 min 28%～40%B相、109～110 min 40%～95% B相、110～120 min 95%B相。

質(zhì)譜條件：一級質(zhì)譜，Resolution：70000、AGCtarget：3e6、MaxinumIT：40 ms、Scanrange：300～1800 m/z；二級質(zhì)譜，Resolution：17500、AGCtarget：1e5、MaxinumIT：60 ms、TopN：20、NCE/steppedNCE：27。

1.2.4.3 多肽序列分析 分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)并通過Max Quant（1.6.2.10）軟件比對目標(biāo)蛋白數(shù)據(jù)庫。參數(shù)設(shè)定如下：固定修飾：carbamidomethylation（C）；可變修飾：oxidation（M），Acetyl（Protein N-term）；酶：Unspecific；遺漏酶切位點(diǎn)：2；一級質(zhì)譜誤差：20 ppm；二級質(zhì)譜誤差：20 ppm；肽段/碎片離子質(zhì)量數(shù)：Monoisotopic；顯著性閾值：0.01。選擇其中高置信度的肽段進(jìn)行基于UniProt蛋白庫（https://www.uniprot.org/）的下游蛋白鑒定分析。

1.2.5 多肽理化性質(zhì)預(yù)測 基于序列信息，通過ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）分析多肽的理化性質(zhì)，包括序列長度、理論等電點(diǎn)、分子量、電荷以及不穩(wěn)定指數(shù)；通過ProtScale（https://web.expasy.org/protscale/）計(jì)算總平均疏水指數(shù)（grand average of hydropathicity，GRAVY）。

1.2.6 多肽抗凍活性預(yù)測 使用抗凍活性預(yù)測平臺Cryoprotect（http://codes.bio/cryoprotect/）進(jìn)行活性預(yù)測。

1.2.7 同源模型建立 多肽的結(jié)構(gòu)模型由I-TASSER（https://zhanggroup.org/I-TASSER/）構(gòu)建；同源模型（Homology models）由SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）建立。

1.2.8 酶切模擬 通過模擬肽被水解釋放的過程，可了解該肽的來源。蛋白水解模擬（胰蛋白酶和糜蛋白酶）由PeptideCutter（https://web.expasy.org/peptide_cutter/）構(gòu)建。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，ANOVA分析采用最小顯著性差異法（LSD），顯著性差異水平設(shè)定為P<0.05，并標(biāo)注顯著性差異。以上各組實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3組平行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 自溶過程中DH和TCA可溶性肽含量變化

不同自溶處理時(shí)間會顯著影響酶解產(chǎn)物中多肽的組成，通常表現(xiàn)為DH和TCA可溶性肽含量的變化[23?24]。

如圖1所示，酶解物的DH隨酶解時(shí)間增加不斷上升。最初0.5 h DH為21.2%，隨著酶解時(shí)間的增加，DH不斷上升，直至6 h達(dá)到51.7%。其中3 h后的增長明顯變緩。Cao等[25]也報(bào)道蝦頭的自溶反應(yīng)在最初的3 h基本結(jié)束，最終的DH為45%。如圖2所示，類似的情況也在TCA可溶性含量變化中發(fā)現(xiàn)：肽含量在0～3 h迅猛增長而在3～6 h相對穩(wěn)定。蝦消化系統(tǒng)中含有內(nèi)源性胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶，可對副產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)進(jìn)行水解，從而產(chǎn)生短肽和游離氨基酸，這可能是DH和TCA可溶性肽含量增加的主要原因[22]。然而酶解過程中底物蛋白濃度的降低和酶的受熱變性可能是增長減緩的原因之一[7]。

圖1 蝦副產(chǎn)物酶解過程中DH變化Fig.1 Changes of DH during autolysis

圖2 蝦副產(chǎn)物酶解過程中TCA可溶性肽含量變化Fig.2 Changes of TCA-soluble peptide content during autolysis

2.2 自溶過程中肽組分變化

根據(jù)2.1中DH隨自溶處理時(shí)間的變化趨勢，選取自溶時(shí)間0.5 h（A-0.5）和3 h（A-3）的酶解產(chǎn)物作為LC-MS/MS分析對象，總離子流色譜如圖3所示。

結(jié)果表明，兩次分析均在120 min內(nèi)完成，其中A-0.5中檢出1301條肽段，A-3中檢出197條。這說明，隨著時(shí)間的增加，副產(chǎn)物蛋白和長鏈肽被不斷酶解，產(chǎn)生短肽和游離氨基酸。直觀表現(xiàn)為組分中肽分子量的變化。A-0.5中大于1600 Da的肽占據(jù)了絕大部分（69.5%）。而在A-3中未檢出大于1600 Da的肽，1000～1600、600～1000和<600 Da的肽含量則明顯增加，分別為79.2%、16.8%、4.0%（圖4）。這表明，隨著酶解的進(jìn)行，長鏈肽會被水解，產(chǎn)生短鏈肽和游離氨基酸。通常來說，低分子量的短肽具有高生物活性的概率高于長鏈肽[26]，因此，為獲得含有更大比例低分子量短肽的酶解產(chǎn)物和防止進(jìn)一步酶解發(fā)生，選擇3 h的酶解產(chǎn)物進(jìn)行抗凍肽篩選。

圖4 分子量分布Fig.4 Distribution of molecule weight

此外，通過對酶解物中肽來源的蛋白質(zhì)進(jìn)行研究，可明確副產(chǎn)物中的主要蛋白種類。如表1所示，A-3中肽主要來源于8類蛋白，包括血藍(lán)蛋白、肌動蛋白、肌球蛋白重鏈、肌動蛋白輕鏈、胰蛋白酶、木糖異構(gòu)酶、肌漿蛋白和其它。其中蝦血藍(lán)蛋白和肌動蛋白含量（39.61%和36.56%）明顯高于其他6種蛋白，說明這兩種蛋白很可能是鷹爪蝦副產(chǎn)物中的主要蛋白。

表1 酶解產(chǎn)物肽的源蛋白Table 1 Source protein of peptide obtained by enzymatic digestion

2.3 抗凍肽篩選與活性預(yù)測

為縮小篩選范圍，從所獲得的197條肽中選出26條具有高置信度的肽序列。肽段的序列長度、所帶電荷、親/疏水氨基酸組成都會影響肽的抗凍活性[27?28]。如表2所示，26條序列長度為7～14個(gè)氨基酸（amino acid，AA），這被認(rèn)為是抗凍肽的合適長度[29]。肽段所帶電荷取決于組成其AA側(cè)鏈所帶的電荷，如Asp、Glu、Lys、Arg、His，這些AA使得肽更親水[30]。而含有更多極性的AA，如Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln，肽具有更高的GRAVY值。此外，根據(jù)報(bào)道，不穩(wěn)定系數(shù)（instability index）大于40的肽段通常擁有較低的體外穩(wěn)定性[31]，不能作為抗凍肽，因此排除在篩選范圍外。

表2 蝦副產(chǎn)物肽段的理化性質(zhì)檢測Table 2 Physicochemical characterization detection of shrimp by-products peptides

利用抗凍肽活性預(yù)測平臺Cryoprotect對篩選所得序列進(jìn)行活性預(yù)測，預(yù)測結(jié)果如表3所示。7個(gè)肽序列，QVHPDTGISS、GYGCARPNYPGV、TTG EVCDSGDGVTH、EQICINFCNEK、DEYEESGPGI VH、DIDNDGFLDK 和DIDNNGFLDK被認(rèn)定為“AFP”。其二級結(jié)構(gòu)如圖5所示?；诨钚灶A(yù)測結(jié)果的抗凍肽篩選簡化了一般分離純化和表征的程序，提高了效率。但以上7種肽抗凍活性仍需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖5 蝦副產(chǎn)物中7種肽的二級結(jié)構(gòu)Fig.5 Secondary structures of seven peptides in shrimp byproducts

表3 蝦副產(chǎn)物抗凍活性預(yù)測結(jié)果Table 3 Prediction of antifreeze activity of shrimp by-products

2.4 酶切模擬

通過建立模型和酶切模擬可進(jìn)一步了解7種肽所處源蛋白位置和酶解位點(diǎn)。如圖6所示，7條序列分別來自于組蛋白H2B（A0A3R7PKU8）、胰蛋白酶（A0A6N0C4I7）、肌動蛋白2（A0A3R7Q5M8）、肌球蛋白重鏈type 2（K4Q2S1）、肌動蛋白1（A0A3R7N 633）、肌漿鈣結(jié)合蛋白β鏈（P02635）和肌漿鈣結(jié)合蛋白（A0A3R7SPI4）水解所得。EQICINFCNEK位于K4Q2S1蛋白（SI為68.71%）的Glu，475–Lys，485，水解位點(diǎn)為：Phe，474–Glu，475（C端）（糜蛋白酶，80.8%）和Lys，485–Leu，486（C端）（胰蛋白酶，94.7%）。DEYEESGPGIVH的源蛋白A0A3R7N633擁有85.07%序列置信度（sequence identity），證明其具有良好的同源性。

圖6 源蛋白的同源模型Fig.6 Homology models for source proteins

選擇蝦副產(chǎn)物中主要的內(nèi)源性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶作為水解酶，對7種肽的源蛋白進(jìn)行酶切模擬，模擬的結(jié)果如表4所示。序列1：QVHPDTGISS是由A0A3R7PKU8在261，Lys的羧基端肽鍵被胰凝乳蛋白酶（100%概率）水解和272，Lys的氨基端肽鍵被胰凝乳蛋白酶（100%概率）水解所得；而序列3：TTGEVCDSGDGVTH的產(chǎn)生極有可能發(fā)生了二次酶解，即首次酶解產(chǎn)生了TTGEV CDSGDGVTHF，隨后164，Phe的氨基端肽鍵被胰凝乳蛋白酶（72.6%概率）水解使得TTGEVCDSG DGVTH游離出來。同理可知其它序列的產(chǎn)生過程。

表4 酶切模擬結(jié)果Table 4 Result of hydrolysis simulation

3 結(jié)論

本文基于蝦副產(chǎn)物的自溶反應(yīng)研究了過程中酶解產(chǎn)物的多肽組成變化，并基于活性預(yù)測平臺篩選得到7條抗凍肽序列。自溶處理的0～3 h，酶解物的DH和TCA可溶性肽含量急劇增加，分別達(dá)49.8%和26.1 mg/g，隨后增長速度變緩。在A-0.5中檢出1301條肽段，A-3中檢出197條；A-0.5中大于1600 Da的肽含量達(dá)到69.5%，而A-3中肽以600～1600 Da為主。A-3中肽主要來源于血藍(lán)蛋白、肌動蛋白、肌球蛋白重鏈、肌動蛋白輕鏈、胰蛋白酶、木糖異構(gòu)酶、肌漿鈣結(jié)合蛋白和其它8等類蛋白?；诨钚灶A(yù)測平臺Cryoprotect，篩選QVHPDTGISS、GYGCAR PNYPGV、TTGEVCDSGDGVTH、EQICINFCNEK、DEYEESGPGIVH、DIDNDGFLDK 和DIDNNGFL DK7個(gè)序列為抗凍肽。通過酶切模擬可知7條序列分別來自于組蛋白H2B（A0A3R7PKU8）、胰蛋白酶（A0A6N0C4I7）、肌動蛋白2（A0A3R7Q5M8）、肌球蛋白重鏈type 2（K4Q2S1）、肌動蛋白1（A0A3 R7N633）、肌漿鈣結(jié)合蛋白β鏈（P02635）和肌漿鈣結(jié)合蛋白（A0A3R7SPI4）的水解?？箖鲭膶ξr肉有顯著抗凍效果，且抗凍活性與濃度正相關(guān)；兩種抗凍肽擁有良好的冰親和力，這有利于抗凍肽對冰晶起到吸附-抑制作用，這是一種高準(zhǔn)確性的鑒定方法。但以此方法獲取高純度的活性肽需要消耗的成本較高，未來還需開發(fā)一種更簡單、低經(jīng)濟(jì)的合成方法。