趙康云，樸春紅 ，張思維，王金夢，覃亞娟，徐 飛，陳小愛，張彥軍,

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科與工程學(xué)院，吉林長春 130118；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所，海南萬寧 571533；3.國家重要熱帶作物工程技術(shù)研究中心，海南萬寧 571533；4.海南省特色熱帶作物適宜性加工與品質(zhì)控制重點實驗室，海南萬寧 571533）

胡椒堿（Piperine，PIP）是胡椒中引起辣味的主要成分。胡椒果實中胡椒堿的含量為1%～10%不等，根據(jù)胡椒品種、成熟度、生長條件和加工方式而定[1]。胡椒作為一種中藥，具有抑制癲癇、止痛、風(fēng)濕和發(fā)燒的作用[1?2]，而胡椒中發(fā)揮主要功效的活性物質(zhì)是胡椒堿，胡椒堿的其他有益作用已有較多報道，具有抗炎、護(hù)肝和抗焦慮的功效[3?5]。此外，胡椒堿還可以提高不同藥物的生物利用度和治療潛力[6]，然而，由于胡椒堿的低水溶性（18 °C時為40 mg·L?1）和較差的溶出度，其生物利用度受到極大限制[7]。為了提高胡椒堿的生物利用度，研究人員采用淀粉凝膠和親水材料等將胡椒堿負(fù)載到各種載體上[8]。Anissian等[9]將胡椒堿負(fù)載到殼聚糖納米顆粒上用于治療癲癇癥，該研究表明，與游離胡椒堿相比，負(fù)載胡椒堿的殼聚糖納米粒子對癲癇發(fā)作的行為體征具有更顯著的抑制作用。

淀粉是一種非常重要且普遍的天然生物聚合物，存在于大多數(shù)植物的果實和根莖中。不同來源的淀粉中直鏈淀粉和支鏈淀粉比例影響著淀粉的各種特性[10]。直鏈淀粉和長支鏈淀粉具有很強(qiáng)的疏水性客體小分子容納能力，形成左螺旋結(jié)構(gòu)[11]，包合物主要通過葡萄糖殘基和客體小分子上的氫鍵或范德華力等非共價相互作用結(jié)合。淀粉顆粒在亞糊化溫度下會發(fā)生膨脹，冷卻到室溫又恢復(fù)原狀而不會破壞淀粉顆粒結(jié)構(gòu)的物理改性，稱為膨脹淀粉（Swelled starch，SS）或亞糊化淀粉（Sub-gelatinization starch，SS）。亞糊化淀粉是一種綠色、經(jīng)濟(jì)的物理改性淀粉方法，可用于食品和制藥等行業(yè)。最近，亞糊化淀粉因其高負(fù)載率和緩釋能力，作為負(fù)載小分子的優(yōu)勢日漸凸顯[12]。有文獻(xiàn)報道，將葉黃素封裝在亞糊化玉米淀粉中，提高了葉黃素穩(wěn)定性和緩釋消化[13]。將生物活性客體化合物封裝在亞糊化玉米淀粉中的詳細(xì)研究仍非常有限，其結(jié)構(gòu)和特性還需進(jìn)一步闡明。

亞糊化法制備復(fù)合物具有工藝簡單、綠色和高生物相容性等優(yōu)點，在未來食品和醫(yī)藥領(lǐng)域有廣闊應(yīng)用前景。因此，本研究制備亞糊化玉米淀粉與胡椒堿形成復(fù)合物，考察亞糊化玉米淀粉（Sub-gelatinization corn starch，SCS）與胡椒堿復(fù)合物的構(gòu)效關(guān)系。通過多種方法對復(fù)合物形態(tài)結(jié)構(gòu)和對淀粉特性的影響進(jìn)行表征，以期提高胡椒堿水溶性，為胡椒堿在淀粉基食品中的應(yīng)用提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米淀粉（純度98%） 上海源葉生物有限公司；胡椒堿（純度98%）、KBr（光譜純） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；無水乙醇等試劑 均為國產(chǎn)分析純。

DF-101S恒溫水浴磁力攪拌器 鄭州市亞榮儀器有限公司；高速冷凍離心機(jī) 美國Beckman Coulter公司；TechMaster快速黏度分析儀 瑞典Perten儀器公司；Phenom ProX臺式顯微能譜一體機(jī) 荷蘭Phenom-World科學(xué)儀器有限公司；Nicolet 6700衰減全反射傅立葉變換近紅外光譜儀 美國Thermo公司；Mastersizer 3000 激光粒度分析儀 英國Malvern儀器有限公司；TA. XT plus質(zhì)構(gòu)分析儀 英國Stable Micro System公司；SmartLab 3KW X射線衍射儀日本理學(xué)株式會社；TA Q2000差示掃描量熱儀 美國TA儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 亞糊化玉米淀粉-胡椒堿復(fù)合物的制備 亞糊化玉米淀粉-胡椒堿復(fù)合物（SCS-PIP）根據(jù)Li等[13]的方法稍修改后制備。即100.00 mL蒸餾水中加入10.00 g淀粉（干基），在60 ℃恒溫水浴磁力攪拌1 h，然后將200.00 mg胡椒堿溶于5.00 mL乙醇，完全溶解后逐滴加入淀粉溶液中，避光繼續(xù)在同等溫度下恒溫水浴磁力攪拌1 h。得到的復(fù)合物離心（2500 r/min）棄去上清液，用乙醇洗滌離心兩次，以去除淀粉表面游離的胡椒堿，保留上清液，再用蒸餾水洗滌離心，棄去上清液，將沉淀冷凍干燥，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 胡椒堿負(fù)載率

1.2.2.1 胡椒堿標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 參考Shao等[14]方法并稍加改動，準(zhǔn)確稱取一定量的胡椒堿標(biāo)準(zhǔn)品，用乙醇溶液作為溶劑，配制濃度為0、10、20、30、40、50 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，在300～400 nm范圍內(nèi)用全波長掃描儀掃描測定，確定最大吸收波長為342 nm，以吸光度為縱坐標(biāo)，胡椒堿濃度為橫坐標(biāo)，回歸方程為y=0.06323x?0.0215，R2=0.99987。

1.2.2.2 胡椒堿負(fù)載率測定 合并1.2.1節(jié)乙醇離心液，用全波長掃描儀在342 nm波長處測定吸光度值，計算胡椒堿溶液中游離含量，乙醇溶液作為空白，根據(jù)式（1）計算胡椒堿負(fù)載率。

式中：LE（Loading efficiency），胡椒堿負(fù)載率，%；m，加入的胡椒堿質(zhì)量，mg；m1，游離胡椒堿質(zhì)量，mg。

1.2.2.3 胡椒堿及其復(fù)合物的溶解性測定 取兩支相同的試管加入等量蒸餾水，分別稱取200.00 mg胡椒堿和200.00 mg亞糊化玉米淀粉-胡椒堿復(fù)合物置于試管中，在漩渦振蕩儀上振蕩均勻，觀察兩者的溶解性。

1.2.3 顆粒形貌觀察 將少量樣品用雙面導(dǎo)電膠固定在樣品臺上，抽真空噴金，放在掃描電子顯微鏡上觀察在10 kV的加速電壓下觀察樣品，樣品在5000×放大倍數(shù)下進(jìn)行拍照。

1.2.4 粒徑分布分析 采用激光粒度分析儀濕法測定樣品的粒徑，加入樣品的量根據(jù)遮光度數(shù)值來定，分散均勻后開始測定，粒徑分布按照體積加權(quán)平均（D[4,3]）來計。

1.2.5 糊化曲線的測定 使用快速糊化粘度分析儀分析淀粉樣品的糊化特性。分別準(zhǔn)確稱取2.00 g天然玉米淀粉、亞糊化玉米淀粉和復(fù)合物樣品置于空的快速糊化粘度測定儀鋁罐中，水分含量12%，加入20.00 mL蒸餾水，攪拌混勻成懸浮液，安裝到RVA上，按照AACC標(biāo)準(zhǔn)程序1進(jìn)行測定。

1.2.6 熱特性測定 稱取約3.00 mg樣品和6.00 μL蒸餾水置于鋁坩堝中，壓片密封，用空坩堝作為對照。溫度范圍25～110 °C，升溫速率10 °C/min，氮氣流速100 mL/min，記錄升溫曲線。

1.2.7 短程有序性 樣品與溴化鉀粉末按照1:100混合，在研缽中研磨，進(jìn)行壓片。置于紅外光譜儀中分析，用溴化鉀壓片為背景，波長范圍4000～400 cm?1，分辨率4 cm?1，掃描64次。在1200～800 cm?1范圍內(nèi)傅里葉自去卷積，半峰寬19，增強(qiáng)因子1.9，并計算在1052和1022 cm?1處的吸光度比值。

1.2.8 X射線衍射分析 用X射線衍射儀測定淀粉晶型結(jié)構(gòu)和相對結(jié)晶度。將樣品先進(jìn)行水分平衡，用Cu-Kα銅靶（40 kV，20 mA）對淀粉進(jìn)行了測定，掃描范圍為4°～40°，掃描速度是5°/min，步長為0.02°。得到的結(jié)果用MDI Jade 6.5軟件進(jìn)行處理，通過比較結(jié)晶峰下的面積與結(jié)晶區(qū)和非晶區(qū)的總面積來定量估算淀粉的相對結(jié)晶度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組試驗均重復(fù)三次，使用Origin 8.5軟件對數(shù)據(jù)處理繪圖，IBM SPSS26進(jìn)行統(tǒng)計分析，選擇單因素ANOVA檢驗，顯著水平為P?0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 胡椒堿負(fù)載率與溶解性

圖1是PIP和SCS-PIP分散在水中，漩渦振蕩后的照片，胡椒堿不溶于水，懸浮在表面（圖1A），因為18 ℃時，胡椒堿在水中的溶解度僅為40 mg·L?1。為了克服胡椒堿水溶性的局限，將胡椒堿負(fù)載到淀粉顆粒上，根據(jù)公式（1）計算得到胡椒堿的負(fù)載率為39.45%。如圖1B所示，SCS-PIP完全分散在水中，這是由于形成復(fù)合物后，具有高度親水性、粒徑小和比表面積大等優(yōu)點，負(fù)載PIP的SCS-PIP復(fù)合物有效改善了胡椒堿單體難溶于水的問題。

圖1 胡椒堿及其復(fù)合物溶解性照片F(xiàn)ig.1 Solubility photographic images of piperine and complexes

2.2 顆粒形貌與粒徑分布

天然玉米淀粉、亞糊化玉米淀粉和亞糊化玉米淀粉-胡椒堿復(fù)合物的顆粒形貌和粒徑分布如圖2和表1所示。天然玉米淀粉顆粒保持完整，粒徑為15.20 μm，經(jīng)亞糊化處理后的玉米淀粉顆粒膨脹，觀察到表面略有脹裂，粒徑為25.80 μm，顯著大于天然玉米淀粉（P<0.05）。Thakur等[15]得出結(jié)論，玉米淀粉吸水膨脹主要發(fā)生在60 ℃，這與本研究觀察到亞糊化玉米淀粉顆粒脹裂相符合。亞糊化玉米淀粉負(fù)載胡椒堿形成復(fù)合物的顆粒表面附著有胡椒堿結(jié)晶，粒徑達(dá)到81.90 μm，顯著大于天然玉米淀粉和亞糊化玉米淀粉（P<0.05），表明胡椒堿的加入對玉米淀粉粒徑有顯著影響，抑制了玉米淀粉顆粒在冷卻階段的恢復(fù)，使淀粉顆粒內(nèi)部空間容納一部分胡椒堿。Ma等[16]研究表明，濕熱處理可以改變淀粉表面通道結(jié)構(gòu)。亞糊化復(fù)合后表面附著的胡椒堿是因為玉米淀粉在亞糊化溫度下吸水膨脹，胡椒堿進(jìn)入淀粉顆粒內(nèi)部，冷卻后大部分已經(jīng)進(jìn)入里面，只有少部分裸露在外，用乙醇溶液洗滌離心兩次依舊存在，表明這些胡椒堿與玉米淀粉已經(jīng)結(jié)合，SEM只能看到顆粒表面狀態(tài)，胡椒堿是否對淀粉內(nèi)部結(jié)構(gòu)也有影響，進(jìn)一步通過其他表征方式探究。

圖2 天然玉米淀粉（A. NCS）、亞糊化玉米淀粉（B. SCS）和亞糊化玉米淀粉-胡椒堿復(fù)合物（C. SCS-PIP）的掃描電鏡圖（5000×）和粒徑分布圖（D）Fig.2 SEM images (5000×) of natural corn starch (A. NCS),sub-gelatinization corn starch (B. SCS) and sub-gelatinization corn starch-piperine complexes (C. SCS-PIP) and granule size distributions (D)

表1 NCS、SCS和SCS-PIP粒徑分布Table 1 Granule size distribution of NCS, SCS and SCS-PIP

2.3 糊化特性

天然玉米淀粉、亞糊化玉米淀粉和亞糊化玉米淀粉-胡椒堿復(fù)合物的糊化特性如圖3和表2所示。亞糊化玉米淀粉的峰值粘度、谷值粘度、最終粘度、糊化溫度和糊化時間顯著（P<0.05）高于天然玉米淀粉的，崩解值249.33 cP和回生值206.33 cP顯著降低（P<0.05）。糊化溫度和糊化時間的增加是淀粉結(jié)晶區(qū)域的增加，亞糊化處理顯著（P<0.05）提高了玉米淀粉的熱穩(wěn)定性，這是由于亞糊化的淀粉顆粒中無定形區(qū)域的有序性增強(qiáng)所致[17]。峰值粘度升高可歸因于顆粒膨脹和直鏈淀粉滲出以及淀粉鏈間相互作用的增強(qiáng)，谷值粘度升高可能是亞糊化處理后限制了一個分子的羥基與另一個分子的親和力，在RVA冷卻過程中抑制淀粉顆粒的直鏈淀粉重新排布，最終粘度也升高。試驗發(fā)現(xiàn)胡椒堿的加入可顯著（P<0.05）降低峰值粘度、谷值粘度、最終粘度和糊化時間，而崩解值和回生值顯著（P<0.05）升高。一方面淀粉與胡椒堿結(jié)合限制了淀粉顆粒糊化過程的膨脹，淀粉鏈與胡椒堿之間分子間和分子內(nèi)氫鍵的增加降低了峰值粘度。另一方面，雖然直鏈和支鏈都可以與胡椒堿相互作用，但通常支鏈淀粉與胡椒堿形成簡單的結(jié)合，這是由于胡椒堿的加入增大了支鏈淀粉分支點的空間位阻，影響了淀粉顆粒的重組，進(jìn)而影響到峰值粘度[18]。這與Gelders等[19]研究的直鏈淀粉與脂肪酸的糊化特性趨勢一致，但與Zhang等[20]研究淀粉、蛋白質(zhì)和游離脂肪酸的結(jié)果不同，這是因為添加客體物質(zhì)不同，與淀粉的相互作用不同。崩解值和回生值的增加，是因為加熱階段胡椒堿進(jìn)入淀粉內(nèi)部，與淀粉分子形成復(fù)合物，使得崩解值增加，而冷卻階段，由于分子間相互作用和空間位阻的影響，抑制了淀粉顆粒的重組，終值粘度增加，同時回生值增加[18]。在RVA加熱過程中，淀粉和部分負(fù)載胡椒堿的直鏈淀粉解離，冷卻過程中直鏈淀粉、胡椒堿和支鏈淀粉形成新的直鏈淀粉-胡椒堿復(fù)合物和直鏈淀粉-支鏈淀粉網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

表2 NCS、SCS和SCS-PIP糊化特性Table 2 Gelatinization characteristics of NCS, SCS and SCS-PIP

圖3 NCS、SCS和SCS-PIP糊化特性曲線Fig.3 NCS, SCS and SCS-PIP pasting characteristics curves

2.4 熱特性

淀粉的熱特性對淀粉基體系的進(jìn)一步加工非常重要，差示掃描量熱法的To、Tp、Tc、Tc-To和ΔH參數(shù)如表3所示。玉米淀粉亞糊化處理后To、Tp和Tc均顯著（P<0.05）增大，而Tc-To和ΔH的值減小。亞糊化處理提高了淀粉的熱穩(wěn)定性，胡椒堿的加入抑制了淀粉顆粒的加熱膨脹，糊化起始溫度升高，糊化溫度范圍變窄，天然玉米淀粉與亞糊化玉米淀粉和亞糊化玉米淀粉-胡椒堿復(fù)合物的?H值從11.11 J/g降至7.82 J/g，?H值的變化反映了在加熱和糊化過程中融化的雙螺旋含量的變化[21]，這與前面糊化特性相符合，De等[22]報道的馬鈴薯淀粉也有類似的結(jié)果。亞糊化處理的玉米淀粉保留了晶體顆粒的完整性，熱特性的改變可能是直鏈淀粉與支鏈淀粉相互作用增強(qiáng)，抑制了淀粉膨脹，延緩淀粉糊化，紅外譜圖中氫鍵的增強(qiáng)也證明了這一點。未發(fā)現(xiàn)胡椒堿的吸熱峰，因為胡椒堿的熔融溫度（135℃）高于淀粉的糊化溫度，淀粉的糊化不會影響到胡椒堿的分解，而胡椒堿的加入對淀粉的糊化產(chǎn)生影響，?H值與負(fù)載小分子的數(shù)量和復(fù)合物的結(jié)晶度有關(guān)[23]。Zhang等[24]在亞糊化玉米淀粉與油酸復(fù)合物研究中得出結(jié)論，亞糊化處理是一種有效促進(jìn)亞糊化淀粉與更多極性或非極性組分復(fù)合的有效方法。

表3 NCS、SCS和SCS-PIP的熱特性Table 3 Thermal properties parameters of NCS,SCS and SCS-PIP

2.5 短程有序性

圖4顯示了天然玉米淀粉、亞糊化玉米淀粉和亞糊化玉米淀粉-胡椒堿復(fù)合物的紅外光譜圖，可以看到并沒有新的化學(xué)鍵或官能團(tuán)產(chǎn)生，說明亞糊化玉米淀粉-胡椒堿復(fù)合物中玉米淀粉和胡椒堿之間不存在共價相互作用。圖4A中3380 cm?1附近的吸光度是氫鍵的變化[25]，歸因于亞糊化處理的淀粉分子間和分子內(nèi)氫鍵的增強(qiáng)，胡椒堿的加入使得一部分淀粉分子內(nèi)氫鍵變成與胡椒堿之間的氫鍵，這也證實了胡椒堿與淀粉之間更有可能是氫鍵和疏水作用等非共價相互作用結(jié)合的。R1052/1022表示淀粉的短程有序性，表4總結(jié)了天然玉米淀粉、亞糊化玉米淀粉和亞糊化玉米淀粉放-胡椒堿復(fù)合物在1052和1022 cm?1處的吸光度比，與天然玉米淀粉相比，亞糊化處理和加入胡椒堿增加了淀粉短程有序程度，表明亞糊化狀態(tài)下加入胡椒堿會影響淀粉的短程有序結(jié)構(gòu)，但胡椒堿的加入沒有顯著影響，因為在亞糊化狀態(tài)下淀粉的可逆膨脹將胡椒堿物理截留以及非共價相互作用[26]。Wang等[27]研究不同溫度處理玉米淀粉的結(jié)構(gòu)變化中，有著相同的結(jié)果，對照組與50和60 ℃短程有序性無差異，70～90 ℃時產(chǎn)生顯著性差異。羅明昌等[28]在使用淀粉包埋亞麻籽油研究中發(fā)現(xiàn)，在60 ℃時復(fù)合物的短程有序性與對照組相比也沒有發(fā)生變化。

圖4 NCS、SCS和SCS-PIP傅里葉變換紅外光譜圖Fig.4 FTIR spectra of NCS, SCS and SCS-PIP

2.6 X射線衍射分析

普遍認(rèn)為，淀粉的結(jié)晶區(qū)主要由支鏈淀粉組成，無定形區(qū)由直鏈淀粉組成。根據(jù)XRD分析，淀粉結(jié)晶結(jié)構(gòu)可分為A、B、C和V型，A型淀粉在15°、17°、18°和23°處有四個明顯的特征峰[29]。如圖5所示，天然玉米淀粉、亞糊化玉米淀粉和亞糊化玉米淀粉-胡椒堿復(fù)合物均為A型結(jié)晶，表明亞糊化處理淀粉和亞糊化淀粉負(fù)載胡椒堿不會改變淀粉的晶型結(jié)構(gòu)。表4中經(jīng)亞糊化處理后玉米淀粉的相對結(jié)晶度從23.52%下降到22.98%，但是加入胡椒堿后相對結(jié)晶度升高到28.15%，這與糊化特性結(jié)果相一致。與Zhang等[24]玉米淀粉-油酸復(fù)合物結(jié)果不同，這是因為淀粉先亞糊化處理，在沸水浴中與油酸復(fù)合，最終淀粉完全糊化，失去原有結(jié)晶狀態(tài)，而本試驗全程都是在亞糊化溫度下進(jìn)行，淀粉顆粒與水分子可逆結(jié)合，淀粉發(fā)生膨脹，未破壞淀粉顆粒結(jié)構(gòu)。

圖5 NCS、SCS和SCS-PIPX射線衍射圖Fig.5 X-ray diffraction patterns of powder NCS, SCS and SCS-PIP

表4 NCS、SCS和SCS-PIP短程有序性和相對結(jié)晶度Table 4 Short-range ordering and relative crystallinity of NCS,SCS and SCS-PIP

3 結(jié)論

本研究采用亞糊化法制備了亞糊化玉米淀粉-胡椒堿復(fù)合物，并對復(fù)合物的負(fù)載率、形態(tài)、結(jié)構(gòu)和熱特性進(jìn)行了表征。胡椒堿的負(fù)載率為39.45%，與游離胡椒堿相比，亞糊化玉米淀粉-胡椒堿復(fù)合物在水溶液中具有更好的分散性，從而提高了胡椒堿的水溶性。亞糊化處理使淀粉顆粒膨脹，粒徑從15.20 μm增大到25.80 μm，與胡椒堿形成復(fù)合物的粒徑達(dá)到81.90 μm。亞糊化處理淀粉的峰值粘度從1555.33 cP增加到1709.67 cP，但是胡椒堿的加入又使峰值粘度降低到1249.33 cP，因為膨脹的淀粉有利于胡椒堿的進(jìn)入，從而增大了亞糊化玉米淀粉空間位阻。紅外光譜中未出現(xiàn)新的化學(xué)鍵或官能團(tuán)，但觀察到氫鍵增強(qiáng)，表明亞糊化處理增強(qiáng)了淀粉分子內(nèi)氫鍵，胡椒堿的加入與淀粉分子間產(chǎn)生氫鍵相互作用，胡椒堿與淀粉的結(jié)合是非共價相互作用。亞糊化處理的玉米淀粉保留了其結(jié)晶結(jié)構(gòu)，與胡椒堿復(fù)合后限制了玉米淀粉的糊化，?H值從11.11 J/g降至7.82 J/g，顯著（P<0.05）降低了玉米淀粉的凝膠焓，說明胡椒堿改變了淀粉與水的相互作用。本研究結(jié)果揭示了淀粉與胡椒堿相互作用，亞糊化玉米淀粉-胡椒堿復(fù)合物提高了胡椒堿的水溶性，該方法工藝簡單、綠色，制備的亞糊化玉米淀粉-胡椒堿復(fù)合物為提高胡椒堿的生物利用度提供新思路，為淀粉-胡椒堿藥物緩釋的開發(fā)提供理論參考。目前胡椒堿的負(fù)載率為39.45%，接下來計劃進(jìn)一步提高負(fù)載率，開展復(fù)合物穩(wěn)定性和緩釋相關(guān)評價研究。