石學(xué)梅，李婉萌，林 劍

（煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東煙臺(tái) 264000）

藜麥中蛋白質(zhì)含量可達(dá)到11%～19%，高于傳統(tǒng)作物水稻和玉米，可作為一種能夠提供高蛋白質(zhì)和低熱量的主食替代品[1]，亦可代替大豆蛋白應(yīng)用于食品加工[2]。目前，藜麥蛋白的提取方法包括：鹽溶法[3]、濕法研磨[4]、有機(jī)溶劑提取法[5]、堿溶酸沉法[5]、反膠束萃取技術(shù)[6]、膜分離法[3]和酶解法[7]等，其中用于提取藜麥蛋白最為廣泛的方法是堿溶酸沉法，但這些方法普遍存在高耗能、高廢水等缺點(diǎn)。

酸漿法是指利用酸漿中的微生物提取淀粉的一種方法，在植物淀粉提取、粉絲生產(chǎn)方面已有廣泛的應(yīng)用，其分離淀粉的主要機(jī)理是依靠酸漿中微生物對(duì)淀粉的凝聚作用及金屬離子與有機(jī)酸對(duì)淀粉的沉降作用[8]，在生產(chǎn)中酸漿可取代其他化學(xué)試劑，作為一種良好的天然絮凝劑，從而減少生產(chǎn)過程對(duì)環(huán)境的污染，降低生產(chǎn)能耗。在酸漿法沉降其他植物源淀粉的應(yīng)用實(shí)例基礎(chǔ)上，利用酸漿法沉降藜麥淀粉[9?11]，進(jìn)而分離提取出藜麥蛋白的可行性較高。

酸漿是植物淀粉乳在微生物自然發(fā)酵過程中形成的一種有微酸氣味的乳白色或淡黃色液體，在淀粉生產(chǎn)過程中可以加快淀粉的沉降速度，促進(jìn)淀粉與蛋白質(zhì)、纖維等雜質(zhì)的快速分離[5,12]，在生產(chǎn)中酸漿可作為一種良好的天然微生物絮凝劑。大量的研究表明，酸漿中對(duì)淀粉的沉淀作用主要與微生物活性和酸漿pH有關(guān)。盧光瑩等[13]、鄭瑋等[14]研究證明酸漿中起主要作用的微生物是乳酸乳球菌，且其對(duì)淀粉的沉降能力受到某些陽離子的影響[15]；吳企禾[16]、季子非[17]等研究證明野生酵母菌也能結(jié)合并沉淀甘薯淀粉，將乳酸鏈球菌和酵母菌混合作用于沉降甘薯淀粉，效果比使用單一菌株更佳。目前，我國(guó)在酸漿法分離淀粉方面已有許多成功的經(jīng)驗(yàn)，利用酸漿法生產(chǎn)甘薯淀粉的技術(shù)在我國(guó)的河北、四川、山東、河南等地使用廣泛[18]，但酸漿是自然發(fā)酵產(chǎn)物，其生產(chǎn)的過程易受微生物種類、原料、氣候、操作方法等外界因素的影響[19?20]，在無法實(shí)現(xiàn)一切條件穩(wěn)定可控的情況下，利用酸漿法大規(guī)模生產(chǎn)品質(zhì)穩(wěn)定的產(chǎn)品難以實(shí)現(xiàn)，因此研究酸漿中的微生物類群對(duì)有效提升酸漿法的生產(chǎn)效率起關(guān)鍵性作用。

本研究用平板分離法，以淀粉絮凝率和產(chǎn)乳酸量為指標(biāo)，從自然發(fā)酵的藜麥酸漿中分離篩選出四株乳酸細(xì)菌，根據(jù)其形態(tài)學(xué)特征、生理生化實(shí)驗(yàn)以及16S rDNA基因序列分析對(duì)篩選出的菌株進(jìn)行鑒定，并應(yīng)用于藜麥蛋白的提取，以藜麥蛋白提取率為指標(biāo)，對(duì)其在藜麥蛋白中的提取特性進(jìn)行分析，為漿法提取藜麥蛋白的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甘薯酸漿水 煙臺(tái)麥特爾生物科技有限公司提供；藜麥 山引2號(hào)，原產(chǎn)地南美，煙臺(tái)大學(xué)作物分子育種&基因組學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供；蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖、氯化鈉、鹽酸、氫氧化鈉、無水乙醇、過氧化氫國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酵母粉 安琪酵母股份有限公司；乳酸、谷氨酸-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液 濟(jì)南延和生物科技有限公司；瓊脂粉、硫酸鎂、硫酸錳、檸檬酸氫二銨、無水碳酸鈣 天津光復(fù)科技發(fā)展有限公司；磷酸氫二鉀 天津市科密歐化學(xué)有限公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒 天根生化科技有限公司；2×Taq Plus Master Mix 諾唯贊生物科技股份有限公司。

FA1004N電子分析天平 奧豪斯國(guó)際貿(mào)易有限公司；FJ300-SH高速分散均質(zhì)機(jī) 上海標(biāo)本模型廠；SW-CJ-1FD雙人單面潔凈工作臺(tái) 蘇潔凈化設(shè)備有限公司；SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱 上海森信有限公司；WYS-100C生物顯微鏡 尼康映像儀器有限公司；ALLegre臺(tái)式高速離心機(jī) 美國(guó)貝克曼公司；TU-1810超微量分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；C1000凝膠成像儀 美國(guó)Bio-Rad；T100PCR儀 美國(guó)Biometra；B1-BP PowerPac Basic電泳儀美國(guó)Invitrogen；SBA-40E生物傳感分析儀器 濟(jì)南延和生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 自然發(fā)酵藜麥酸漿的制備工藝 麥籽粒反復(fù)洗滌、45 ℃烘干→粉碎至100目→以料液比1:20 g/mL比例加去離子水→均質(zhì)形成藜麥粉乳→加入10%（v/v）的初始酸漿→雙層紗布過濾，棄上清→沉淀加去離子水調(diào)整醪液濃度為10%（v/v）→靜置沉淀20～26 h→過濾，棄沉淀→藜麥酸漿[21]

1.2.2 菌株的分離篩選 取藜麥酸漿樣1 mL，使用0.9%的無菌生理鹽水對(duì)其進(jìn)行10倍梯度稀釋，取10?4、10?5、10?6稀釋度的酸漿水各100 μL，分別注入滅菌后的MRS碳酸鈣固體培養(yǎng)基中搖勻，待培養(yǎng)基凝固后，倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。菌落形成后，觀察平板上形成的菌落狀態(tài)，在無菌環(huán)境下，挑取產(chǎn)生鈣溶解圈的單菌落劃線接種到MRS固體培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)48 h，反復(fù)劃線純化3代以上。根據(jù)菌落形態(tài)的差異最終挑選出16株菌株，將其轉(zhuǎn)接于MRS斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)至長(zhǎng)出菌落。將初步篩選出的菌株在MRS液體培養(yǎng)基中活化后，使用無菌生理鹽水將菌懸液濃度調(diào)至1×109CFU/mL，然后按照1%的接種量接入滅菌后的MRS液體培養(yǎng)基中，在37 ℃厭氧條件下培養(yǎng)24 h得到純菌發(fā)酵液，以上操作做兩組平行樣品分別用于菌體產(chǎn)酸能力的測(cè)定和菌體對(duì)藜麥淀粉沉淀能力的測(cè)定，以發(fā)酵液中乳酸產(chǎn)量和淀粉絮凝率[22]為指標(biāo)，篩選出產(chǎn)乳酸能力強(qiáng)，淀粉絮凝率高的優(yōu)良菌株。

1.2.3 純菌發(fā)酵液中乳酸含量的測(cè)定 使用生物傳感分析儀測(cè)定純菌發(fā)酵液中的乳酸含量。取5 mL純菌發(fā)酵液，使用0.2 mm水系濾膜過濾后，取10 μL過濾后的發(fā)酵液測(cè)定乳酸含量。

1.2.4 藜麥淀粉絮凝率的檢測(cè)方法 在25 mL量筒中加入體積為20 mL，濃度為5%（v/v）的藜麥醪液，再加入2 mL空白液體培養(yǎng)基，使用玻璃棒快速攪拌均勻后，靜置沉淀30 min，取量筒18 mL處的溶液，在600 nm處測(cè)定吸光值記為A；保持其他條件不變的情況下，將加入2 mL空白液體培養(yǎng)基改為加入2 mL純菌發(fā)酵液，并在600 nm處測(cè)定吸光值記為B，絮凝率計(jì)算公式為[21,23]：

式中：A表示空白液體培養(yǎng)基下的淀粉絮凝率，%；B表示純菌發(fā)酵液下的淀粉絮凝率，%。

1.2.5 菌株的鑒定

1.2.5.1 菌株的形態(tài)學(xué)觀察 將篩選出的優(yōu)良菌株接種于MRS固體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)1～2 d，觀察菌落的生長(zhǎng)情況，包括：溶鈣圈、菌落的形態(tài)、質(zhì)地、邊緣情況、色澤、大小、透明度等特征，挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。

1.2.5.2 菌株的生理生化鑒定 參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》對(duì)篩選出的純菌株進(jìn)行過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)、運(yùn)動(dòng)性實(shí)驗(yàn)、H2S生成實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、明膠液化實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)、精氨酸產(chǎn)氨實(shí)驗(yàn)、葡萄糖產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)和糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

1.2.5.3 菌株的分子生物學(xué)鑒定 將菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使用天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取菌體DNA，并進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；以提取的DNA為模板，采用細(xì)菌通用引物（正向引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGG CTCAG-3'，反向引物1492R：5'-GGTTACCTTGTTA CGACTT-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s；57 ℃退火30 s；72 ℃延伸2 min，循環(huán)30次；72 ℃修復(fù)延伸10 min，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送至上海生工生物有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知菌株進(jìn)行BLAST比對(duì)，并利用MEGA 11.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.6 菌株QSL12在藜麥蛋白分離提取中的應(yīng)用

1.2.6.1 接種量對(duì)藜麥蛋白分離提取的影響 菌株活化后，取2 mL菌液再次接種至MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃擴(kuò)大培養(yǎng)12 h，使用無菌生理鹽水將菌懸液濃度調(diào)至1×109CFU/mL備用。確定初次沉淀醪液濃度50 g/L，初次沉淀時(shí)間30 min，二次沉淀醪液濃度120 g/L、二次沉淀時(shí)間20 h，發(fā)酵溫度26 ℃條件下[24]，分別按照6%、7%、8%、9%、10%（v/v）的比例加入菌懸液制備酸漿，將其用于藜麥淀粉與蛋白的分離，以蛋白質(zhì)提取率為指標(biāo)，探究不同的接種量對(duì)藜麥蛋白提取的影響。

1.2.6.2 發(fā)酵溫度對(duì)藜麥蛋白分離提取的影響 確定初次沉淀醪液濃度50 g/L，初次沉淀時(shí)間30 min，接種量7%（v/v），二次沉淀醪液濃度120 g/L、二次沉淀時(shí)間20 h條件下，分別在18、22、26、30、34 ℃進(jìn)行發(fā)酵制備酸漿，將其用于藜麥淀粉與蛋白的分離，以蛋白質(zhì)提取率為指標(biāo)，探究不同的發(fā)酵溫度對(duì)藜麥蛋白提取的影響[25]。

1.2.7 指標(biāo)測(cè)定 淀粉含量測(cè)定：參照國(guó)標(biāo)GB 5009.9-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中淀粉的測(cè)定》[26]；蛋白質(zhì)含量測(cè)定：參照國(guó)標(biāo)GB 5009.5-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》[27]，蛋白質(zhì)提取率計(jì)算公式如下：

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)平行3次，使用Excel和SPSS22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式表示[28?29]，使用Origin2021進(jìn)行作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離篩選

按照1.2.2所述實(shí)驗(yàn)方法，將16株菌株的菌液按1%的接種量轉(zhuǎn)接至MRS液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后測(cè)定發(fā)酵液中乳酸產(chǎn)量，結(jié)果如圖1所示。

圖1 發(fā)酵液產(chǎn)乳酸量Fig.1 Fermentation solution lactic acid production

由圖1可以看出，發(fā)酵液所有菌株均有乳酸生成，其中QSL8菌株和QSL9菌株產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，其乳酸產(chǎn)量分別可以達(dá)到11.86±0.12和12.13±0.21 g/L。

按照1.2.4實(shí)驗(yàn)方法，得出16株菌株的藜麥淀粉絮凝率如圖2所示。

圖2 S1～S16菌株對(duì)藜麥淀粉沉淀能力比較Fig.2 Comparison of the ability of S1～S16 strains to precipitate quinoa starch

由圖2可知，所有菌株對(duì)藜麥淀粉均有沉降能力，其中菌株QSL4和QSL12對(duì)藜麥淀粉的絮凝率最高，分別達(dá)到77.81%±0.75%和77.64%±0.94%。部分純菌發(fā)酵液沉降藜麥淀粉的過程如圖3所示。由圖3可知，在較短的時(shí)間里，純菌發(fā)酵液對(duì)藜麥淀粉有明顯的沉降效果，且菌株QSL4對(duì)藜麥淀粉的沉降速度略高于菌株QSL12。

圖3 菌株QSL4和QSL12的純菌發(fā)酵液沉淀淀粉的過程Fig.3 Starch precipitation process of sterile fermentation liquid of strains QSL4 and QSL12

綜合產(chǎn)酸能力和藜麥淀粉絮凝率兩個(gè)指標(biāo)，最后篩選出QSL4、QSL8、QSL9、QSL12四株優(yōu)良菌株進(jìn)行鑒定。

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 菌株的形態(tài)特征 四株菌株在MRS-CaCO3固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)如圖4所示，細(xì)胞形態(tài)如圖5所示。

圖4 菌株的菌落形態(tài)Fig.4 Colony morphology of the strain

圖5 菌株的細(xì)胞形態(tài)（100×10）Fig.5 Cell morphology of strain (100×10)

由圖4～圖5可知，菌落形態(tài)均為中央隆起、邊緣整齊、表面光滑、乳黃色或乳白色，大小約0.3～1.5 mm之間，經(jīng)革蘭氏染色后，均為革蘭氏陽性菌，在顯微鏡下菌體呈球狀或短桿狀。詳細(xì)菌株特征結(jié)果見表1。

表1 菌株特征Table 1 Strain characteristics

2.2.2 菌株生理生化鑒定 參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，對(duì)四株菌株進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2，初步判斷四株菌株為腸球菌屬（Enterococcus）。

表2 四株菌株的生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Physiological and biochemical characterization of four strains

2.2.3 菌株分子生物學(xué)鑒定

2.2.3.1 菌株DNA的提取及16S rDNA序列擴(kuò)增參照細(xì)菌DNA提取試劑盒說明書提取基因組DNA，產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。分別以提取的四株菌的DNA為模板，利用通用引物27F和1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖6所示，PCR產(chǎn)物條帶分子量均在1500 bp左右，且條帶明亮無明顯拖尾。

圖6 四株菌株的16S rDNA PCR電泳圖Fig.6 Electrophoresis of the PCR amplification of 16S rDNA gene of the four strains

2.2.3.2 菌株16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 測(cè)序結(jié)果表明，QSL4的16S rDNA序列共2689 bp，QSL8的16S rDNA序列共2366 bp，QSL9的16S rDNA序列共2444 bp，QSL12的16S rDNA序列共2547 bp。將堿基序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已知堿基序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，部分比對(duì)結(jié)果見表3。

表3 菌株的同源相似性分析Table 3 Homology similarity analysis of strains

結(jié)果表明：四株菌的同源性均可達(dá)到98%以上，可以判定其屬于同種。結(jié)合菌株形態(tài)學(xué)特征、生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及16S rDNA序列比對(duì)可以判定菌株SQL4為屎腸球菌（Enterococcus Faecium）、SQL8為耐久腸球菌（Enterococcus durans）、SQL9為蒙氏腸球菌（Enterococcus mundtii）、SQL12為乳腸球菌（Enterococcus lactis）。根據(jù)同源性比對(duì)結(jié)果，利用MEGA 11.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖7所示。

圖7 四株菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.7 Phylogenetic tree of four strains

2.2.4 分離菌株在藜麥蛋白分離提取中的應(yīng)用

2.2.4.1 接種量對(duì)藜麥蛋白分離提取的影響 按照1.2.6.1所述方法，探究不同接種量對(duì)藜麥蛋白提取的影響，結(jié)果如圖8所示。

圖8 接種量對(duì)蛋白提取率的影響Fig.8 Effect of inoculated volume on protein extraction rate

由圖8可知，當(dāng)接種量在6%～7%范圍內(nèi)時(shí)，蛋白質(zhì)提取率隨接種量增加而提高，接種量為7%時(shí)，菌株QSL12的蛋白質(zhì)提取率最大，達(dá)到60.23%，接種量較低時(shí)，微生物生長(zhǎng)速度慢，增加接種量可以縮短微生物生長(zhǎng)延滯期，提高蛋白質(zhì)提取率，但當(dāng)接種量高于7%時(shí)，隨著接種量的持續(xù)增加，蛋白質(zhì)提取率逐漸降低，結(jié)合混合液中的pH（圖9），推測(cè)可能是因?yàn)殡S著接種量的增加，酸漿pH過低而影響藜麥蛋白的溶解度[25]。因此，提取藜麥蛋白的最適接種量為7%。

圖9 接種量對(duì)pH的影響Fig.9 Effect of inoculated volume on pH

2.2.4.2 溫度對(duì)藜麥蛋白分離提取的影響 按照1.2.6.2所述方法，探究不同溫度對(duì)藜麥蛋白提取的影響，結(jié)果如圖10所示。

由圖10可知，在一定條件下，當(dāng)溫度為18～26 ℃時(shí)，蛋白質(zhì)提取率隨溫度的升高而增加，特別是菌株QSL12，當(dāng)溫度為26 ℃時(shí)，蛋白質(zhì)提取率達(dá)到最大值62.39%，這是由于隨著溫度的升高，蛋白質(zhì)的分子構(gòu)象會(huì)發(fā)生微變，有利于蛋白質(zhì)分子間的相互作用；隨后隨著溫度不斷升高，蛋白質(zhì)提取率顯著降低，酸漿發(fā)酵的過程也是菌株生長(zhǎng)代謝的過程，一方面溫度會(huì)影響菌體生長(zhǎng)及菌體細(xì)胞中各種酶的活性，進(jìn)而影響菌體功能，另一方面溫度過高會(huì)造成部分蛋白質(zhì)變性[30]。因此，提取藜麥蛋白的最適溫度為26 ℃。

圖10 溫度對(duì)蛋白提取率的影響Fig.10 Effect of temperature on the quality of sour liquid

3 討論與結(jié)論

藜麥中的蛋白含量高于其它傳統(tǒng)作物，且氨基酸組成比例均衡，含有8種必需氨基酸，尤其富含優(yōu)質(zhì)植物蛋白所需的組氨酸和賴氨酸，具有抗衰老、抗氧化[31]、降低膽固醇[32]等生物學(xué)功能，藜麥蛋白作為一種優(yōu)質(zhì)植物蛋白，對(duì)人體健康有著關(guān)鍵作用[2,33]，但其新型產(chǎn)品的開發(fā)有待加強(qiáng)。酸漿法作為一種應(yīng)用廣泛的傳統(tǒng)分離方法，巧妙地利用微生物的絮凝作用分離物質(zhì)，比其他分離提取方法污染小且耗能低，但一直以來，我國(guó)在工業(yè)化生產(chǎn)中對(duì)酸漿法的應(yīng)用始終局限于豆類、薯類淀粉以及粉絲的生產(chǎn)[22,34]，并且無法實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)品質(zhì)穩(wěn)定的產(chǎn)品。

本研究從自然發(fā)酵的藜麥酸漿中分離篩選出4株對(duì)藜麥淀粉有較高絮凝活性的產(chǎn)乳酸細(xì)菌，根據(jù)形態(tài)學(xué)特征、生理生化實(shí)驗(yàn)以及16S rDNA序列比對(duì)分析對(duì)其進(jìn)行鑒定，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明：菌株QSL4為屎腸球菌（Enterococcus faecium）、QSL8為耐久腸球菌（Enterococcus durans）、QSL9為蒙氏腸球菌（Enterococcus mundtii）、QSL12為乳腸球菌（Enterococcus lactis）。選取菌株QSL12應(yīng)用于藜麥蛋白的提取中，通過單因素實(shí)驗(yàn)，對(duì)其在藜麥蛋白中的提取特性進(jìn)行分析，結(jié)果表明：當(dāng)接種量為7%，發(fā)酵溫度為26 ℃時(shí)，菌株QSL12對(duì)藜麥蛋白的提取效果最好，可以達(dá)到60.23%和62.39%，均高于堿提酸沉法52.13%。研究結(jié)果為酸漿法提取藜麥蛋白的深入研究奠定基礎(chǔ)。且研究分離出的乳腸球菌屬于乳酸菌中的腸球菌屬，目前，腸球菌在干酪發(fā)酵劑、益生菌、微生態(tài)制劑的開發(fā)方面有著十分重要的探究?jī)r(jià)值[35?37]，腸球菌的研究為制備標(biāo)準(zhǔn)化酸漿，實(shí)現(xiàn)酸漿法提取植物蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義，進(jìn)一步拓展了酸漿法的應(yīng)用領(lǐng)域。