劉彤彤，梁瑞強(qiáng), ，韓偉娜，羅嬌依，曹 進(jìn)，孫姍姍, ，陳 啟

（1.中國食品藥品檢定研究院，國家市場(chǎng)監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（食品質(zhì)量與安全），北京 100050；2.浙江樹人學(xué)院，浙江杭州 310015）

食品過敏原是指食品中天然存在或人工添加，在進(jìn)入人體之后會(huì)引起過敏反應(yīng)的物質(zhì)，通常由蛋白質(zhì)或糖蛋白組成[1]，目前已經(jīng)鑒定出的食物過敏原蛋白超過了380種，而且數(shù)量還在不斷增加[2]。惡心、嘔吐、蕁麻疹和哮喘等癥狀都屬于過敏反應(yīng)，過敏反應(yīng)會(huì)降低個(gè)體生活質(zhì)量，甚至危及生命[3?5]。GB 7718-2011《預(yù)包裝食品標(biāo)簽通則》[6]中鼓勵(lì)食品生產(chǎn)企業(yè)“自愿”標(biāo)識(shí)致敏物質(zhì)來提示消費(fèi)者潛在風(fēng)險(xiǎn)。而新修訂的GB 7718（征求意見稿）中擬將八類致敏物質(zhì)配料由“推薦性標(biāo)示”更改為“強(qiáng)制性標(biāo)示”。因此，基于未來監(jiān)管需求，開發(fā)準(zhǔn)確可靠的過敏原檢測(cè)方法，并進(jìn)行含致敏物質(zhì)的食品風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，對(duì)保障消費(fèi)者安全健康具有十分重要的意義。

食品過敏原檢測(cè)的傳統(tǒng)方法是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay， ELISA）和實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction， qPCR）[7]。ELISA 法依賴于抗體和抗原之間特異性相互作用[8]，而食品中的其他蛋白質(zhì)和抗體可能會(huì)發(fā)生交叉反應(yīng)[9]，且熱加工過程會(huì)破壞目標(biāo)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，從而影響測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性。qPCR法通過測(cè)定與過敏原蛋白相關(guān)的靶向DNA片段，間接得到過敏原的含量，不適用于測(cè)定具有未知基因序列的過敏原[10?11]。

近年來，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法已經(jīng)被廣泛用于食品中過敏原的篩查、定量，具有高靈敏度、高特異性和高通量的優(yōu)勢(shì)[5,12?14]，可以避免免疫測(cè)定中蛋白質(zhì)的變性和交叉反應(yīng)的缺點(diǎn)，通過目標(biāo)肽段直接定量目標(biāo)過敏原蛋白質(zhì)[15?16]。以往利用質(zhì)譜法研究過敏原主要集中在堅(jiān)果、大豆和牛奶蛋白范圍，如：復(fù)雜加工食品（冰激凌、醬汁和巧克力）[17?20]中的大豆和多種堅(jiān)果蛋白；焙烤食品（面包、麥片、餅干和曲奇）[18,20?22]、飲料（紅酒和果汁）[22?23]、水果制品（果醬）[22]和肉制品（香腸、肉餡和漢堡肉餅）[13]中的牛奶蛋白。相比之下，基于質(zhì)譜法檢測(cè)肉制品中蝦過敏原蛋白的研究較少。

蝦過敏原屬于甲殼類過敏原蛋白，已被質(zhì)譜鑒定出的這類蛋白主要包括：肌球蛋白輕鏈（myosin light chain，MLC）、肌鈣結(jié)合蛋白（sarcoplasmic calcium-binding protein，SCP）、磷酸甘油醛異構(gòu)酶蛋白（triosphosphate isomerase，TPI）、精氨酸激酶（arginine kinase， AK）和原肌球蛋白（tropomyosin，TM）[8,23?24]，其中原肌球蛋白（TM）被認(rèn)為是甲殼類的主要過敏原蛋白[24?25]，臨床數(shù)據(jù)證明80%的海鮮過敏患者，都是基于對(duì)TM有極強(qiáng)的敏感性。TM具有高度熱穩(wěn)定性的α-螺旋結(jié)構(gòu)[26]，不易在熱加工中變性，溶于水及鹽溶液，易被提取，因此本研究選定原肌球蛋白作為目標(biāo)過敏原蛋白。

本研究通過測(cè)定篩選出的蝦過敏原蛋白（TM）的特征肽段含量，直接定量蝦過敏原蛋白，并利用內(nèi)標(biāo)肽段補(bǔ)償酶解和基質(zhì)效應(yīng)帶來的影響，最終建立高靈敏度的肉制品中蝦過敏原的篩查和定量方法，并應(yīng)用于實(shí)際肉制品樣品中蝦過敏原含量的測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

西式火腿、肉丸、香腸等20批不同品牌的肉制品 購于京東商城；空白樣品和陽性樣品 購于北京物美超市，空白樣品包括豬肉、牛肉、雞肉、羊肉、鴨肉、黑魚、鯉魚塊，陽性樣品為蝦米；標(biāo)準(zhǔn)品：IR-10 IQLLEEDLER（聚異亮氨酸-谷氨酰胺-亮氨酸-亮氨酸-谷氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-亮氨酸-谷氨酸-精氨酸肽，純度≥96.74%）、IR-10* IQL*（13C6，15N）LEEDLER（L*代表亮氨酸-OH-13C6，15N，純度≥95.43%）、IR-9 IVELEEER（聚異亮氨酸-纈氨酸-谷氨酸-亮氨酸-谷氨酸-谷氨酸-谷氨酸-精氨酸肽，純度≥97.05%）、IR-9* IVEL*（13C6，15N）EEER（純度≥95.40%） 質(zhì)譜純，上海吉爾生化有限公司；胰蛋白酶（≥15000 u/mg）、甲酸、乙腈 質(zhì)譜純，美國賽默飛世爾科技公司；PBS片劑（pH7.2～7.4，1片溶于100 mL超純水得到0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液，0.0027 mol/L氯化鉀和0.137 mol/L氯化鈉） 分析純，北京Solarbio公司；三羥甲基氨基甲烷（tris （hydroxymethyl） methyl aminomethane，THAM） 分析純，美國 Sigma Aldrich公司；鹽酸 分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用水 為Milli-Q超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備 西式火腿、肉丸和香腸等市售樣品，每批樣品在測(cè)定前進(jìn)行絞碎均勻處理；空白樣品肉塊剔除筋膜、攪碎成肉餡，不同種類肉餡同質(zhì)量分?jǐn)?shù)混合后攪拌均勻，高溫蒸熟，冷卻后分裝；陽性樣品烘干干燥后磨碎封裝。所有樣品均保存在實(shí)驗(yàn)室?20 ℃條件下。

1.2.2 樣品前處理 稱取試樣（1.2.1中制備的陽性、空白和市售樣品）5 g（精確至0.001 g） 于50 mL容量瓶中，加入30 mL PBS（10 mmol/L）溶液，充分振蕩，超聲30 min，離心（10000 r/min，15 ℃，10 min）后取上清5 mL，加入5 mL 乙腈，充分振蕩1 min，棄去上清，沉淀用1 mL的PBS溶液復(fù)溶并使用0.45 μm濾膜過濾，準(zhǔn)確移取500 μL上述樣液，加入40 μL內(nèi)標(biāo)（2.5 μmol/L），10 μL胰蛋白酶液（1 mg/mL），加水定容至1 mL，渦旋混勻后置于37 ℃水浴中恒溫16 h，取出加入10 μL 10%的甲酸溶液終止反應(yīng)，混勻后離心（10000 r/min，4 ℃，10 min），取上清供檢測(cè)用。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)品的配制 精確稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品，用Tris-HCl（50 mmol/L）溶液溶解，得到標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：IR-10和IR-9濃度均為20 μmol/L，IR-10*和IR-9*濃度均為10 μmol/L；分別取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，用Tris-HCl（50 mmol/L）溶液稀釋，得到混合標(biāo)準(zhǔn)中間液：IR-10和IR-9濃度為4 μmol/L，IR-10*和IR-9*濃度為2.5 μmol/L；取IR-10和IR-9混合標(biāo)準(zhǔn)中間液適量，加入IR-10*和IR-9*混合標(biāo)準(zhǔn)中間液40 μL、胰蛋白酶液（1 mg/mL）10 μL，用水定容至1 mL混勻，配制成濃度為：0.001、0.01、0.1、0.5、2.0 μmol/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，內(nèi)標(biāo)濃度為100 nmol/L，后續(xù)酶解操作和1.2.2樣品酶解步驟同時(shí)進(jìn)行，取上清進(jìn)樣并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 高分辨質(zhì)譜鑒定特征肽段 陽性樣品（蝦米）經(jīng)1.2.2的處理（不加內(nèi)標(biāo)），取5 μL樣液用于高分辨質(zhì)譜鑒定TM特征肽段。高分辨質(zhì)譜檢測(cè)條件：通過C18毛細(xì)管柱分離，0～7 min經(jīng)Trap柱脫鹽富集，上樣泵流速為5 μL/min。流動(dòng)相A：0.1%甲酸-水溶液，B：0.1%甲酸-（20%水+80%乙腈）溶液，流速為300 nL/min。采用梯度洗脫方式：0～7 min，5%B；7～95 min，5%～70% B；95～100 min，70%～90% B；100～130 min，90%～5% B。質(zhì)譜采用Full MS-ddMS2掃描模式，掃描質(zhì)量范圍300～3000 m/z，一級(jí)MS分辨率70000，二級(jí)分辨率35000，隔離寬度2 m/z，毛細(xì)管溫度250 ℃，噴霧電壓2.1 kV。

1.2.5 液相色譜聯(lián)用質(zhì)譜儀器檢測(cè)條件 空白基質(zhì)、空白基質(zhì)加標(biāo)及市售樣品經(jīng)1.2.2處理后用于UPLC-MS/MS測(cè)定。檢測(cè)條件：色譜柱：ACQUITY UPLC HSS＠T3柱150 mm×2.1 mm×1.8 μm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；流速：0.3 mL/min。流動(dòng)相A：0.1%甲酸-水溶液，流動(dòng)相B：乙腈。線性梯度洗脫程序：0～0.5 min，82% A；0.5～8.0 min，82%～55% A；8.0～8.3 min，55%～18% A；8.3～8.6 min，18% A；8.6～9.0 min，18%～82% A；9.0～11.5 min，82% A。

電噴霧離子源正離子模式；毛細(xì)管電壓：3200 V；脫溶劑氣溫度：500 ℃；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑氣流速：800 L/h；錐孔氣流量：150 L/h；掃描模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）。其他質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)見表1。

表1 質(zhì)譜檢測(cè)和定量過敏原的設(shè)置Table 1 Analytical settings used for detection and quantification of allergens by mass spectrometry (MS)

1.2.6 過敏原蛋白含量計(jì)算

腎臟病變：腎病引起的水腫有急有慢，急性病相對(duì)容易治療，慢性腎病則往往積重難返。故及時(shí)發(fā)現(xiàn)、及時(shí)治療非常重要，必要時(shí)還需腎臟穿刺以明確診斷、指導(dǎo)治療。腎臟病患者的日常飲食亦要加以調(diào)養(yǎng)，癥狀較輕且合并血漿蛋白降低時(shí)，不妨多吃一些高蛋白食物，如魚、蛋和奶等（而中重癥腎病特別是合并尿毒癥的患者則需限制蛋白的攝入）；蘿卜、冬瓜和絲瓜等也有明顯的利尿作用。

式中：X代表樣品中過敏原蛋白含量，mg/kg；δ代表稀釋倍數(shù)；V代表上機(jī)前定容體積，mL ；c代表樣品中目標(biāo)肽段的測(cè)定濃度，μmol/L； M代表過敏原原肌球蛋白（來源Euphausia superba（Antarctic krill），UniprotKB中登記號(hào)為A7VKE0）分子量（32663 g/mol），m代表樣品稱樣量，g。上述計(jì)算公式推導(dǎo)原理：目標(biāo)肽段和對(duì)應(yīng)蝦過敏原蛋白摩爾質(zhì)量n（mol）相等，即：n肽段=n蛋白。

1.3 數(shù)據(jù)處理

方法學(xué)考察中回收率平行測(cè)定6次，樣品平行測(cè)定3次，采用Microsoft Office Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖形繪制，結(jié)果以平均數(shù)表示。特征肽段鑒定的數(shù)據(jù)分析軟件采用Peaks 8.0，設(shè)定FDR<0.01%。在數(shù)據(jù)軟件中采用Uniprot下載來源于蝦米Euphausia superba（Antarctic krill）原肌球蛋白質(zhì)全序列譜庫匹配搜索原始數(shù)據(jù)，TM（A7VKE0）。

2 結(jié)果與分析

2.1 蝦過敏原蛋白中特征肽段及內(nèi)標(biāo)的確定

基于前期蝦過敏原特征肽段篩選工作，選擇和鑒定出能代表蝦過敏原蛋白TM的特征肽段。根據(jù)特異性和相對(duì)強(qiáng)度等選擇標(biāo)準(zhǔn)[27?28]，并參考甲殼類制品過敏原蛋白的研究[29?30]中使用的肽段，本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)陽性樣品確證最終選出IQLLEEDLER和IVELEEER兩個(gè)特征肽段，考慮到實(shí)際的微量檢測(cè)中可能產(chǎn)生假陽性誤判的情況，把響應(yīng)更高的肽段IVELEEER作為定量肽段，肽段IQLLEEDLER作為輔助分析的定性肽段，以減少誤判率。對(duì)陽性樣品進(jìn)行分析，兩個(gè)肽段的二級(jí)質(zhì)譜圖見圖1，結(jié)合三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀的質(zhì)譜條件優(yōu)化，最終確定m/z 1016.8和m/z 242.2作為IQLLEEDLER的子離子，分別對(duì)應(yīng)y8和b2兩個(gè)碎片離子；m/z 917.6和m/z 213.3作為IVELEEER的子離子，分別對(duì)應(yīng)y7和b2兩個(gè)碎片離子。

圖1 Q-Extractive plus Orbitrap高分辨質(zhì)譜中特征肽段IQLLEEDLER和IVELEEER的碎片離子Fig.1 Fragment ions of signature peptides IQLLEEDLER and IVELEEER by Q-Extractive plus Orbitrap HRMS

食物樣品的成分復(fù)雜，常常對(duì)質(zhì)譜分析定量的準(zhǔn)確性和靈敏度產(chǎn)生影響[31?32]。為了提高方法的準(zhǔn)確性，需要引入內(nèi)標(biāo)來減少離子抑制、基質(zhì)效應(yīng)帶來的誤差。本實(shí)驗(yàn)選取特征肽段對(duì)應(yīng)的同位素標(biāo)記肽段IQL*（13C6，15N）LEEDLER和IVEL*（13C6，15N）EEER作為內(nèi)標(biāo)。在樣品酶解過程中，同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)肽段會(huì)釋放出與蝦過敏原特征肽段相似的碎片離子，在UPLC-MS/MS分析中顯示出相似的色譜質(zhì)譜行為，因而可以有效校正誤差。圖2所示為兩條特異性肽段在陽性樣品中的檢出情況，色譜峰完全分離，可以共同監(jiān)測(cè)蝦過敏原的檢出情況。同時(shí)，其對(duì)應(yīng)的同位素內(nèi)標(biāo)具有相同的保留時(shí)間，且儀器響應(yīng)接近，說明同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)肽段IQL*（13C6，15N）LEEDLER和IVEL*（13C6，15N）EEER與各自的蝦過敏原特征肽段的色譜質(zhì)譜行為相似，可以用來提高本方法定量的準(zhǔn)確度。

圖2 特征肽段及其內(nèi)標(biāo)在陽性樣品中的MRM圖Fig.2 MRM chromatograms of signature peptides and its internal peptides in positive samples

2.2 特異性

通過比較陽性樣品中的特征肽段（圖2）、空白基質(zhì)樣品（圖3）和空白基質(zhì)加標(biāo)樣品（圖4）酶解后的質(zhì)譜圖，在1.2.5條件下的出峰情況評(píng)估特異性?？瞻谆|(zhì)加標(biāo)樣品與陽性樣品均在同一時(shí)間出峰（IR 10及其內(nèi)標(biāo)在3.41 min出峰，IR 9及其內(nèi)標(biāo)在2.95 min出峰），同時(shí)空白基質(zhì)中并未檢出任何特征肽段及對(duì)應(yīng)內(nèi)標(biāo)，這表明樣品基質(zhì)對(duì)本實(shí)驗(yàn)篩選出的肽段出峰時(shí)間沒有影響，特征肽段準(zhǔn)確性高且特異性強(qiáng)。

圖3 空白基質(zhì)樣品的MRM圖Fig.3 MRM Chromatograms of blank samples

圖4 空白基質(zhì)加標(biāo)樣品的MRM圖Fig.4 MRM chromatograms of blank sample spiked with standard

2.3 線性關(guān)系、檢出限和定量限

以目標(biāo)肽段與內(nèi)標(biāo)肽段峰面積之比為縱坐標(biāo)，濃度比為橫坐標(biāo)制作線性曲線，肽段IR-9在0.001～2.0 μmol/L范圍內(nèi)，線性方程為y=1.8479x?0.0086，決定系數(shù)R2為1.0000。在空白基質(zhì)提取液中添加低濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，當(dāng)信噪比（signal to noise, S/N）等于3時(shí)，得到檢出限為0.67 mg/kg，S/N等于10時(shí)，得到定量限為2.00 mg/kg。

質(zhì)譜法與其他檢測(cè)蝦過敏原技術(shù)對(duì)比見表2。本方法的定量限比Stella等[29]（3.5 mg/kg）的研究結(jié)果低，與Wang等[30]（1.6 mg/kg）的定量限相近，這可能是由于質(zhì)譜品牌型號(hào)和樣品基質(zhì)不同使得相同肽段的靈敏度有所差異。qPCR和ELISA法雖然也有較高的靈敏度，但均無法實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)多種過敏原類型；電化學(xué)免疫傳感器法的樣品處理過程復(fù)雜，對(duì)操作人員的要求很高，尚無法滿足市場(chǎng)化檢測(cè)需求。相比之下，本方法可彌補(bǔ)上述方法缺陷，且線性范圍寬、靈敏度低，可以完全滿足肉制品中蝦過敏原的定量要求。

表2 與其他檢測(cè)蝦過敏原技術(shù)對(duì)比Table 2 Comparison with other techniques for detecting shrimp allergens

2.4 加標(biāo)回收率和精密度

以空白基質(zhì)作為本底，分別加入三個(gè)濃度水平的特征肽段標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定加標(biāo)回收率，每個(gè)濃度水平測(cè)定6次。如表3所示的結(jié)果可得，IR-9回收率為83.2%～104.5%，低濃度（2.00和5.25 mg/kg）加標(biāo)水平的回收率比高濃度（20.00 mg/kg）的低，但仍在方法回收率偏差范圍之內(nèi)（濃度水平1～10 mg/kg，偏差范圍75%～120%[36]）；精密度較高，范圍為2.63%～7.92%。結(jié)果表明該方法的回收率和精密度良好，均符合CNAS-TRL-011:2020中的要求。

表3 加標(biāo)回收率和精密度（n=6）Table 3 Recoveries and relative standard deviations (n=6)

2.5 樣品測(cè)定結(jié)果

為驗(yàn)證建立方法的適用性，隨機(jī)選取20批市售的、有致敏可能的肉制品作為測(cè)試樣品進(jìn)行分析，包括西式火腿、香腸和肉丸三類。所選的樣品中，有12批樣品的外包裝上標(biāo)識(shí)了可能含有過敏原的提示，剩余8批沒有過敏原提示。所有樣品按照前述方法進(jìn)行處理后測(cè)定，肽段IR-9用于定量計(jì)算，同時(shí)檢出IR-9和IR-10的樣品統(tǒng)計(jì)為陽性樣品。

過敏原標(biāo)識(shí)情況和樣品測(cè)定結(jié)果匯總在表4，結(jié)果顯示，在標(biāo)識(shí)可能有過敏原風(fēng)險(xiǎn)的12批樣品中，4批樣品（編號(hào)1～3和18）蝦過敏原含量在2.3～448.1 mg/kg之間，8批樣品（編號(hào)4、5、7、9、12、13、15和16）未檢出蝦過敏原；在沒有標(biāo)識(shí)過敏原風(fēng)險(xiǎn)的8批樣品中，1批樣品（編號(hào)6）檢出了定量和定性肽段，但計(jì)算值低于定量限；其余7批樣品未檢出蝦過敏原。1和18號(hào)樣品分別是蝦腸和蝦丸，過敏原蛋白含量分別為46.7和448.1 mg/kg；樣品2、3號(hào)有少量檢出，因與1號(hào)樣品是同一生產(chǎn)廠家，懷疑是使用相同生產(chǎn)線清洗不徹底導(dǎo)致；6號(hào)樣品可能也是生產(chǎn)中產(chǎn)生了交叉接觸所致。另外，6號(hào)樣品的檢出結(jié)果雖然未達(dá)到定量限，但其未標(biāo)識(shí)過敏原提示，可能會(huì)對(duì)部分極其敏感的過敏體質(zhì)消費(fèi)者造成危害。這也說明開發(fā)復(fù)雜食品基質(zhì)中過敏原檢測(cè)方法的重要性，可以保護(hù)過敏體質(zhì)消費(fèi)者免受潛在健康風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)便于規(guī)范食品生產(chǎn)企業(yè)整個(gè)供應(yīng)鏈的過敏原管理。

表4 樣品測(cè)定結(jié)果（n=3）Table 4 Determination of allergens in samples (n=3)

此外，目前我國對(duì)于過敏原為推薦性標(biāo)識(shí)要求，可能存在部分生產(chǎn)企業(yè)對(duì)過敏原標(biāo)識(shí)不規(guī)范的情況，這可能也是上述測(cè)定結(jié)果和標(biāo)識(shí)有出入的原因?？傊瑢?shí)際樣品的檢測(cè)結(jié)果說明，本方法適用于肉制品中蝦過敏原的精準(zhǔn)定量，且可靠性高。

3 結(jié)論

本方法采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定肉制品中的蝦過敏原TM，選取特征肽段IVELEEER作為定量肽段， IQLLEEDLER作為輔助分析的定性肽段，在降低假陽性率的同時(shí)提高方法的準(zhǔn)確性；所采用的內(nèi)標(biāo)法可大幅度減少多種混合肉制品樣品基質(zhì)的干擾，提高了方法定量分析蝦過敏原的靈敏度。在市售20種肉制品中進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)揮了高靈敏度的特點(diǎn)，微量檢測(cè)結(jié)果呈現(xiàn)了較強(qiáng)的可靠性。綜上，本方法可用于評(píng)估有致敏風(fēng)險(xiǎn)的肉制品，滿足監(jiān)管部門風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)和企業(yè)自檢自控的品控的需求，維護(hù)和保障消費(fèi)者的安全健康。