葉 茂，沈曉玲, ，陳青舟，夏武強(qiáng)，張 敏，張少恩

（1.杭州南開日新生物技術(shù)有限公司，浙江杭州 311258；2.象山縣水產(chǎn)品質(zhì)量檢測中心，浙江寧波 315700；3.鄭州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測流通中心，河南鄭州 450000）

農(nóng)藥是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的重要生產(chǎn)資料，對保障果蔬等農(nóng)產(chǎn)品優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)具有不可或缺的作用。毒死蜱、氟蟲腈、克百威和多菌靈作為高效、廣譜性殺蟲或殺菌劑被廣泛用于水果、蔬菜的病蟲害防治。然而，近年來隨著農(nóng)藥長期大量的施用，農(nóng)藥殘留及污染問題日益嚴(yán)重，已嚴(yán)重危害人類的健康[1?2]，成為全球關(guān)注的一項(xiàng)重要食品安全指標(biāo)。因此，加強(qiáng)農(nóng)藥殘留檢測，尤其是農(nóng)藥多殘留檢測是十分必要的。農(nóng)藥最大殘留限量（maximum residue limit，MRL）是食品農(nóng)藥殘留評(píng)價(jià)與監(jiān)管的重要依據(jù)[3]，中國、歐盟、日本等許多國際組織和國家均出臺(tái)了相應(yīng)的農(nóng)藥最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)[4?6]，其中GB 2763-2019對果蔬中毒死蜱、氟蟲腈、克百威、多菌靈的MRL規(guī)定如表1所示。

表1 毒死蜱、氟蟲腈、克百威、多菌靈的MRL（部分）Table 1 MRL of chlorpyrifos, fipronil, carbofuran and carbendazim (a part)

隨著科技的不斷發(fā)展，快捷、靈敏、能進(jìn)行多組分分析成為檢測農(nóng)藥殘留的必備條件[7]。目前，農(nóng)藥多殘留檢測方法主要有高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[8?9]、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）[10?11]、及液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）[12?14]等。盡管這些方法具有較高的靈敏度和特異性，但所需儀器復(fù)雜昂貴、操作繁瑣費(fèi)時(shí)、檢測費(fèi)用高，較難應(yīng)用于基層實(shí)驗(yàn)室的大批量樣本檢測[15]。為此，研究開發(fā)快速、靈敏、準(zhǔn)確、簡便的農(nóng)藥多殘留快速檢測技術(shù)，對保護(hù)生態(tài)環(huán)境，保障人類健康有著重要意義。膠體金免疫層析法具有操作方便，檢測時(shí)間短，不需要復(fù)雜儀器判定，定性準(zhǔn)確，裸眼即可觀察結(jié)果等優(yōu)點(diǎn)，是目前應(yīng)用最廣的快速檢測方法[16]。在農(nóng)藥多殘留組分檢測方面，可采用“寬譜”特異性抗體方式，即通過“共性”半抗原設(shè)計(jì)或“多簇”人工抗原設(shè)計(jì)制備寬譜抗體[17]，如Liang等[18]采用3種具有共性結(jié)構(gòu)半抗原免疫動(dòng)物，獲得能夠同時(shí)識(shí)別馬拉硫磷等8種有機(jī)磷類農(nóng)藥的多克隆抗體，但由于抗體特異性不強(qiáng)，不能確定具體的農(nóng)藥品種。另一種方式是通過使用多種特異性抗體進(jìn)行農(nóng)藥多殘留免疫分析，即在試紙條的硝酸纖維素膜上劃多條檢測線，Guo等[19]通過在試紙條硝酸纖維素膜上劃兩條檢測線可同時(shí)檢測水中三唑磷和克百威兩種農(nóng)藥殘留，Wang等[20]運(yùn)用膠體金三線卡對大普通白菜和土壤樣本中吡蟲啉、甲基毒死蜱、水胺硫磷進(jìn)行檢測。

毒死蜱、氟蟲腈、克百威和多菌靈是果蔬中比較常見的農(nóng)藥殘留抽檢不合格項(xiàng)目，目前還未有同時(shí)檢測這四種農(nóng)藥殘留的膠體金免疫層析快速檢測方法的相關(guān)報(bào)道。本試驗(yàn)通過優(yōu)化樣品前處理和膠體金免疫層析檢測條件，構(gòu)建了4個(gè)抗原?抗體組合的農(nóng)藥多殘留檢測的免疫膠體金四線卡，只需對待測樣本進(jìn)行一次前處理就可以在一條試劑卡上同時(shí)檢測毒死蜱、氟蟲腈、克百威、多菌靈四種農(nóng)藥，對指導(dǎo)生產(chǎn)環(huán)節(jié)合理使用農(nóng)藥、市場監(jiān)督、農(nóng)藥殘留超標(biāo)的快速檢測等工作，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

硝酸纖維素膜、樣品墊、金標(biāo)結(jié)合墊、吸水墊 美國Millipore公司；毒死蜱、氟蟲腈、克百威、多菌靈、甲基毒死蜱、丁硫克百威、殺螟硫磷、吡蟲啉、對硫磷、異丙威標(biāo)準(zhǔn)品 中國醫(yī)藥（集團(tuán)）上海化學(xué)試劑公司；氯金酸（HAuCl4?4H2O）、檸檬酸三鈉、羊抗鼠IgG 美國Sigma公司；毒死蜱單克隆抗體、氟蟲腈單克隆抗體、克百威單克隆抗體、多菌靈單克隆抗體、包被抗原 杭州南開日新生物技術(shù)有限公司自制；普通白菜、菜豆、柑橘 杭州市某農(nóng)貿(mào)市場。

MYP11-2恒溫磁力攪拌器 上海梅穎浦儀儀表制造有限公司；紫外-可見分光光度計(jì) 美國賽默飛世爾科技公司；Bio Jet XYZ3000型點(diǎn)膜機(jī)、CM4000型試紙條切割機(jī) 美國BioDot公司；Avanti J-26XP高速冷凍離心機(jī) 美國Beckman公司；DHG-9023A型恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)業(yè)設(shè)備有限公司；Agilent 6890N-59731氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀、Agilent 1260-6460高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司；NK-S101I膠體金讀數(shù)儀 杭州南開日新生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 膠體金免疫層析四線卡制備

1.2.1.1 膠體金溶液制備 采用檸檬酸三鈉還原法[21]制備膠體金溶液。將100 mL 0.01%的氯金酸溶液置于磁力攪拌器上加熱至沸騰后，加入1 mL 0.1%檸檬酸三鈉水溶液，繼續(xù)攪拌煮沸15 min，溶液最終呈透亮的紅色，冷卻至室溫后，用雙蒸水定容至100 mL，4 ℃保存?zhèn)溆?。在可見光范圍?nèi)（400～600 nm）用紫外分光光度儀測定溶液的吸收峰波長和吸光度值[22]。

1.2.1.2 最適標(biāo)記抗體濃度 采用鹽沉淀法和吸光度法進(jìn)行膠體金標(biāo)記單克隆抗體最適標(biāo)記量優(yōu)化[23]。用0.01 mol/L的PB緩沖液（pH7.4）分別將毒死蜱、氟蟲腈、克百威、多菌靈單克隆抗體配制成0.5 mg/mL溶液，15000 r/min 4 ℃離心30 min，去除溶液中的蛋白聚合物。以毒死蜱單克隆抗體為例，取5支小試管，分別加入1 mL膠體金溶液和0.8、1.6、2.4、3.2、4.0、5.0 μg/mL的抗體進(jìn)行標(biāo)記。室溫孵育5 min，測定OD525，向每個(gè)小試管中加入1 mL 10% NaCl溶液，5 min后觀察各管溶液顏色變化并測定OD525。計(jì)算兩次OD525差值，并以此差值作為縱坐標(biāo)，抗體濃度作為橫坐標(biāo)，繪制吸光度差值與相應(yīng)的抗體濃度的關(guān)系曲線，選擇曲線平滑臨界點(diǎn)的抗體濃度作為最適標(biāo)記濃度[24]。

1.2.1.3 T線包被濃度優(yōu)化 C線羊抗鼠IgG包被濃度采用常規(guī)濃度0.2 mg/mL，T線上分別包被毒死蜱、氟蟲腈、克百威、多菌靈人工包被原，依次形成的T1、T2、T3、T4線，抗原濃度分別設(shè)置0.95、0.80、0.65、0.50、0.35 mg/mL五個(gè)濃度，抗體以最適標(biāo)記量進(jìn)行標(biāo)記，分別滴加PBS（0.01 mol/L）緩沖液和0.2 mg/L毒死蜱、0.04 mg/L氟蟲腈、0.04 mg/L克百威、0.1 mg/L多菌靈標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液進(jìn)行檢測，觀察顯色并使用膠體金讀數(shù)儀讀數(shù)。讀數(shù)判定原則：T/C比值?1.0（T線比C線淡或幾乎看不見）為陽性；T/C比值≥1.0（T線比C線深或一樣深）為陰性；若未出現(xiàn)任何色帶或C線未出現(xiàn)，則此試劑卡已失效、過期或操作不當(dāng)，需另做一次測試。

抑制率（Inhibition rate）[25]的計(jì)算公式：

式中：I表示抑制率；Sb表示PBS緩沖液的T/C值；St表示混合標(biāo)準(zhǔn)品的T/C值。

1.2.1.4 四線卡組裝 將制備好的毒死蜱、氟蟲腈、克百威、多菌靈的金標(biāo)單克隆抗體溶液稀釋到最佳標(biāo)記量后等體積混勻，按照噴量3.0 μL/cm，混合包被在四線卡金標(biāo)墊區(qū)域。將處理后的毒死蜱、氟蟲腈、克百威、多菌靈人工包被原和羊抗鼠IgG依次通過點(diǎn)膜儀噴于硝酸纖維素膜上，形成間隔4 mm的T1、T2、T3、T4和C線，37 ℃烘箱干燥8 h。依次將樣品墊、金標(biāo)結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊粘貼于PVC底板上，制成膠體金免疫層析四線卡（圖1）。

圖1 膠體金免疫層析四線卡結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Structure diagram of immune colloidal gold four lines card

1.2.2 樣品前處理?xiàng)l件選擇 本試驗(yàn)所用蔬菜和水果樣品均購自本地農(nóng)貿(mào)市場。普通白菜、菜豆和柑橘每批均購3 kg以上，所有樣品分別取其可食用部分，稱取5.0 g樣品，剪成1 cm2左右的碎片/塊后，放入均質(zhì)機(jī)中攪碎，待用。

1.2.2.1 提取溶劑的選擇 毒死蜱和克百威屬微溶農(nóng)藥，多菌靈和氟蟲腈為難溶農(nóng)藥，在樣品前處理時(shí)采用有機(jī)溶劑進(jìn)行提取，可使農(nóng)藥完全溶解，有利于增加其抑制抗原抗體反應(yīng)的程度。選擇甲醇、乙腈、乙酸乙酯和丙酮四種常用有機(jī)溶劑對比提取效果。分別取勻漿后陰性和添標(biāo)果蔬樣品2.0 g，其中陽性添標(biāo)樣品中毒死蜱、氟蟲腈、克百威和多菌靈添加濃度分別為0.1、0.02、0.02、0.05 mg/L，分別加入5.0 mL提取溶劑，振蕩5 min，室溫下4000 r/min離心1 min，取上清液120 μL用于檢測。每個(gè)樣品重復(fù)三次，用四線卡進(jìn)行檢測，觀察顯色并使用膠體金讀數(shù)儀采集T/C值。

1.2.2.2 提取時(shí)間的選擇 分別取勻漿后陰性和相同添標(biāo)的陽性果蔬樣品，各加入5.0 mL乙腈，分別振蕩3、5、7、10 min。室溫下4000 r/min離心1 min，取上清液120 μL用于檢測。每個(gè)樣品重復(fù)三次，用四線卡進(jìn)行檢測，觀察顯色并使用膠體金讀數(shù)儀采集T/C值。

1.2.3 檢出限 通過在陰性樣本中分別添加毒死蜱、氟蟲腈、克百威、多菌靈標(biāo)準(zhǔn)品的形式，配制毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0、0.025、0.05、0.075、0.1、0.2、0.5、1 mg/kg；氟蟲腈和克百威標(biāo)準(zhǔn)品濃度均為0、0.005、0.01、0.015、0.02、0.05、0.1、0.2 mg/kg；多菌靈標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0、0.01、0.015、0.03、0.05、0.1、0.2、0.5 mg/kg。以優(yōu)化后的檢測條件進(jìn)行測定，記錄顯色結(jié)果。

1.2.4 特異性 首先，為了避免毒死蜱、氟蟲腈、克百威和多菌靈四種免疫試劑之間的交叉反應(yīng)，對其抗原與單抗的交叉反應(yīng)分別進(jìn)行研究評(píng)價(jià)；其次，選擇甲基毒死蜱、丁硫克百威、殺螟硫磷、吡蟲啉、對硫磷、異丙威6種農(nóng)藥進(jìn)行特異性試驗(yàn)。

1.2.5 穩(wěn)定性 本研究采用37 ℃加速試驗(yàn)判定四線卡的穩(wěn)定性。取3個(gè)不同批次的四線卡置于37 ℃恒溫箱中放置8周，分別于每周的第1 d隨機(jī)抽取四線卡，分別準(zhǔn)備陰性樣本和陽性添標(biāo)樣本各5個(gè)，觀察顯色并使用膠體金讀數(shù)儀采集T/C值，按T/C值平均數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.6 與儀器方法比較 用本研究制備的四線卡和儀器方法分別檢測60份果蔬樣品，其中包括添標(biāo)檢測試驗(yàn)和盲樣檢測試驗(yàn)。添標(biāo)試驗(yàn)樣品制備，用乙腈分別將毒死蜱、氟蟲腈、克百威、多菌靈標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行稀釋，將4種農(nóng)藥混合標(biāo)樣分別添加于普通白菜、菜豆、柑橘空白樣品（經(jīng)質(zhì)譜儀檢測，毒死蜱等4種農(nóng)藥的初始?xì)埩袅烤∮趦x器檢測限）中。盲樣均購自本地農(nóng)貿(mào)市場。

四線卡檢測法：稱取果蔬樣品2.0 g，加入5.0 mL乙腈，振蕩提取5 min，室溫下4000 r/min離心1 min，取上清液120 μL用于檢測。

儀器檢測：普通白菜、菜豆、柑橘中毒死蜱等4種農(nóng)藥殘留的前處理與檢測方法參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T761-2008[26]，其中毒死蜱和氟蟲腈采用GCMS[26?27]檢測，克百威和多菌靈采用LC-MS/MS[26,28]檢測。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本研究所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Microsoft Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 膠體金溶液的紫外掃描圖譜

制備的膠體金溶液，肉眼觀察呈均一透亮的紅色。膠體金溶液在400～600 nm范圍內(nèi)的紫外-可見分光光度計(jì)掃描得到吸收光譜圖，如圖2。由圖2可見，該膠體金的最大吸收波長為525 nm，主峰寬度較小，說明膠體金顆粒分布均勻。參考文獻(xiàn)[29]，膠體金粒徑與其吸收光譜有一定關(guān)系，計(jì)算公式為：

圖2 膠體金紫外-可見分光光度計(jì)掃描圖Fig.2 Determination of colloidal gold by spectrophotometry

式中：λmax表示最大吸收波長，nm；φ表示膠體金粒徑大小，nm。

根據(jù)此公式計(jì)算該膠體金的粒徑大小約為24 nm，符合膠體金層析法要求，適合用于標(biāo)記抗體。

2.2 膠體金免疫層析四線卡制備參數(shù)優(yōu)化

2.2.1 最適標(biāo)記抗體濃度 用鹽析實(shí)驗(yàn)并通過測定OD525計(jì)算差值來繪制吸光度差值與相應(yīng)的單克隆抗體濃度的關(guān)系曲線（如圖3所示）。從圖3可以看出，隨著抗體濃度的增加，紫外吸收的減少值在下降，當(dāng)氟蟲腈單克隆抗體濃度增加至2.4 μg/mL，毒死蜱單克隆抗體、克百威單克隆抗體和多菌靈單克隆抗體濃度增加至3.2 μg/mL時(shí)，出現(xiàn)拐點(diǎn)，曲線接近平滑?；诿庖吒偁幮苑磻?yīng)原理，當(dāng)吸光度差值趨于平滑時(shí)，抗體用量越少，在反應(yīng)時(shí)檢測線上包被的抗原與待測物質(zhì)的競爭越激烈，有利于提高四線卡檢測靈敏度。當(dāng)抗體濃度高于該值時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致靈敏度降低；反之，如果濃度低于拐點(diǎn)值，會(huì)導(dǎo)致檢測范圍變窄[30]，因此選擇曲線最開始與x軸相對平行的點(diǎn)即為單克隆抗體的最適標(biāo)記量。因此，毒死蜱、氟蟲腈、克百威、多菌靈四種單克隆抗體的最適濃度分別為3.2、2.4、3.2、3.2 μg/mL。

圖3 吸光度值與相應(yīng)的單克隆抗體濃度的關(guān)系曲線圖Fig.3 Curve of the relationship between the absorbance value and the corresponding monoclonal antibody concentration

2.2.2 檢測線包被濃度優(yōu)化 選擇陰性時(shí)T線和C線顯色明顯且T/C值≈1.0，陽性抑制率較高的檢測線濃度。從圖4中可以看出，隨著檢測線上包被原濃度的下降，裸眼觀察陰性四線卡檢測線顏色逐漸下降，膠體金讀數(shù)儀測定結(jié)果顯示，陰性的T/C 值逐漸減小，抑制率呈先上升然后下降的趨勢。檢測線包被濃度分別為毒死蜱0.65 mg/mL、氟蟲腈0.80 mg/mL、克百威0.65 mg/mL、多菌靈0.5 mg/mL時(shí)，陰性T/C值接近1.0，抑制率相對較高，且裸眼觀察陰性四線卡檢測線顏色較明顯。

圖4 檢測線包被濃度優(yōu)化Fig.4 Optimization of coating concentration of detection line

2.3 樣品前處理?xiàng)l件的確定

2.3.1 提取溶劑 分別用甲醇、乙腈、丙酮和乙酸乙酯作為提取劑對樣本進(jìn)行前處理，樣本回收率結(jié)果見圖5。從圖5可以看出，對于毒死蜱、氟蟲腈和克百威三個(gè)檢測參數(shù)來說，甲醇、丙酮和乙酸乙酯提取的樣本液基質(zhì)干擾較大，T線顯色較淺，相比較乙腈提取的樣本液基質(zhì)干擾較小，對陰性樣品進(jìn)行檢測時(shí)，T線和C線均顯色明顯，樣本添加回收率高于75%；對于多菌靈檢測參數(shù)來說，丙酮和乙酸乙酯提取的樣本液基質(zhì)干擾較大，T線顯色較淺，相比較甲醇和乙腈提取的樣本液基質(zhì)干擾較小，對陰性樣品進(jìn)行檢測時(shí)，T線和C線均顯色明顯，樣本添加回收率均高于75%；綜合而言，乙腈提取效果相對較好，與Desmet等[31]采用的QuEChERS法提取試劑一致。

圖5 樣品前處理提取劑的選擇Fig.5 Selection of extraction solvent for sample pretreatment

2.3.2 提取時(shí)間 使用乙腈作為提取劑，對比分別振蕩3，5，7，10 min的提取效果，結(jié)果見圖6。由圖6可知，當(dāng)提取時(shí)間為3 min時(shí)，毒死蜱、氟蟲腈和克百威的樣品回收率在60%左右，多菌靈的樣品回收率在50%左右，當(dāng)提取時(shí)間延長至5 min時(shí)，毒死蜱的樣品回收率可達(dá)80%，其余三種農(nóng)藥的樣品回收率在70%左右。隨著提取時(shí)間的延長樣品回收率偏差較小，為保證樣品的提取效果和控制提取時(shí)間適用于快速檢測的特點(diǎn)，選擇提取時(shí)間為5 min。

圖6 樣品前處理提取時(shí)間的選擇Fig.6 Selection of extraction time for sample pretreatment

2.3.3 樣品前處理?xiàng)l件的確定 取待測樣品可食用部分，剪成1 cm2左右的碎片/塊，放入均質(zhì)機(jī)中攪碎，稱取2.0 g勻漿樣品于50 mL離心管中，加入5.0 mL乙腈，混勻振蕩5 min，室溫下4000 r/min離心1 min，取上清液120 μL，即為待測液。

2.4 膠體金免疫層析四線卡的性能評(píng)價(jià)

2.4.1 檢出限 在優(yōu)化后的條件下進(jìn)行測試，樣品加樣量為120 μL，觀察試劑板顏色變化，試劑板均在3 min內(nèi)顯示結(jié)果，符合檢測要求。靈敏度檢測結(jié)果如圖7所示，隨著四種農(nóng)藥濃度的降低，檢測線顏色越來越深，當(dāng)T線顏色和C線顏色一致時(shí)，檢測結(jié)果為陰性，四種農(nóng)藥的檢出限分別為毒死蜱0.1 mg/kg、氟蟲腈0.02 mg/kg、克百威0.02 mg/kg、多菌靈0.05mg/kg。

圖7 四線卡檢出限測定Fig.7 Determination of detection limit of quadruple reagent plate

2.4.2 特異性 使用PBS緩沖液將毒死蜱、氟蟲腈、克百威、多菌靈、甲基毒死蜱、丁硫克百威、殺螟硫磷、吡蟲啉、對硫磷和異丙威標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行稀釋，用四線卡進(jìn)行檢測。以甲基毒死蜱為例，使用PBS緩沖液將甲基毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成濃度為0.1、1.0、10.0 mg/kg，分別添加到經(jīng)國家標(biāo)準(zhǔn)確認(rèn)為陰性的普通白菜樣品中，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，按照2.3.3步驟進(jìn)行樣品前處理，將待測液滴加到四線卡樣品墊上，觀察顯色結(jié)果。當(dāng)顯色結(jié)果為陽性時(shí)，參考文獻(xiàn)[25]，計(jì)算交叉反應(yīng)率。

式中：S：交叉反應(yīng)率；y：藥物檢出限濃度，mg/kg；Z：結(jié)構(gòu)類似物檢出時(shí)的濃度，mg/kg。

結(jié)果見表2，丁硫克百威對克百威的交叉反應(yīng)率為20%，對檢測結(jié)果有干擾；異丙威對克百威的交叉反應(yīng)率為2%，甲基毒死蜱對毒死蜱的交叉反應(yīng)率為1%，均小于5%，參考文獻(xiàn)[32]，若交叉反應(yīng)率低于10%時(shí)，可忽略其影響；氟蟲腈和多菌靈的檢測結(jié)果均為陰性。

表2 交叉反應(yīng)率Table 2 Detection of cross-reactivity

2.4.3 穩(wěn)定性 四線卡在37 ℃條件下保存8周，穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果如圖8所示，試劑卡檢測讀數(shù)隨著時(shí)間的延長并沒有發(fā)生明顯變化，肉眼觀察顯色均勻。根據(jù)37 ℃條件下1 d相當(dāng)于室溫下1周計(jì)算，四線卡在室溫下至少可以保存12個(gè)月[21]，在保存期內(nèi)穩(wěn)定性良好。

圖8 四線卡穩(wěn)定性測定Fig.8 Stability determination of four lines card

2.4.4 與儀器方法比較 分別采用四線卡和儀器方法（GC-MS或LC-MS/MS）檢測普通白菜、菜豆、柑橘樣品中毒死蜱等4種農(nóng)藥殘留。添標(biāo)試驗(yàn)結(jié)果如表3所示，四線卡和儀器方法對陰性樣本和陽性添標(biāo)樣品的檢測結(jié)果一致。盲樣試驗(yàn)結(jié)果如表4所示，四線卡檢測結(jié)果未出現(xiàn)假陽性和假陰性，與儀器法的符合率達(dá)100%。結(jié)果表明，四線卡與儀器方法的檢測結(jié)果一致，適用于果蔬樣品中毒死蜱、氟蟲腈、克百威和多菌靈農(nóng)藥殘留的檢測。

表3 四線卡與儀器法添標(biāo)檢測結(jié)果比對Table 3 Comparison of standard addition test results of four lines card and instrumental method

表4 四線卡與儀器法盲樣檢測結(jié)果比對Table 4 Comparison of blind sample test results of four lines card and instrumental method

3 結(jié) 論

本研究采用膠體金免疫層析法，構(gòu)建了4個(gè)抗原-抗體組合的農(nóng)藥多殘留檢測的免疫膠體金四線卡，用于水果和蔬菜中毒死蜱、氟蟲腈、克百威、多菌靈等農(nóng)藥殘留的快速檢測。鑒于樣品前處理時(shí)需要同時(shí)提取四種農(nóng)藥成分，經(jīng)優(yōu)化后選用乙腈作為提取溶劑，提取時(shí)間為5 min，提取結(jié)果滿意，整個(gè)檢測過程約15 min。在優(yōu)化后的條件下對四線卡進(jìn)行性能評(píng)價(jià)，毒死蜱的檢出限為0.1 mg/kg、氟蟲腈為0.02 mg/kg、克百威為0.02 mg/kg、多菌靈為0.05 mg/kg。在特異性方面，除了丁硫克百威對克百威的交叉反應(yīng)率為20%，對檢測結(jié)果有影響，其余藥物的交叉反應(yīng)率均小于5%，不影響檢測結(jié)果，所以，當(dāng)克百威檢測結(jié)果為陽性時(shí)，需要考慮到待測樣品中丁硫克百威的含量情況。在保存期內(nèi)穩(wěn)定性良好，且實(shí)際樣品的檢測結(jié)果與儀器法結(jié)果一致。本研究制備的膠體金免疫層析四線卡操作簡單，可同時(shí)檢測四個(gè)農(nóng)藥指標(biāo)，通量高，成本低，且大大降低了檢測時(shí)間，為果蔬的農(nóng)藥殘留快速檢測工作提供有利保障。