李英基，裴水廷, ，熊 鵬

（1.廣西財(cái)經(jīng)學(xué)院，廣西南寧 530003；2.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530004）

運(yùn)動(dòng)性疲勞是機(jī)體在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中產(chǎn)生的一種正常生理現(xiàn)象，但當(dāng)機(jī)體在較長(zhǎng)時(shí)間一直處于運(yùn)動(dòng)疲勞狀態(tài)下時(shí)，易產(chǎn)生過(guò)度疲勞。過(guò)度疲勞不僅會(huì)使機(jī)體免疫能力下降，還會(huì)導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)臟器官受損，而且這種損傷通常是不可逆的[1]。因此，如何延緩運(yùn)動(dòng)性疲勞的產(chǎn)生和促進(jìn)疲勞后機(jī)體的恢復(fù)是目前健康領(lǐng)域研究的重點(diǎn)。

機(jī)體處于運(yùn)動(dòng)性疲勞狀態(tài)時(shí)，體內(nèi)的肝糖原和肌糖原被大量消耗，血乳酸、血尿素氮等代謝產(chǎn)物大量堆積，同時(shí)生成較多的氧自由基，進(jìn)而破壞機(jī)體穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，導(dǎo)致機(jī)體臟器受損[2]。心臟作為機(jī)體最重要的循環(huán)器官，運(yùn)動(dòng)對(duì)心臟的刺激是雙向的，研究表明適宜、規(guī)律性的運(yùn)動(dòng)一定程度上可以改善心臟的機(jī)能結(jié)構(gòu)，提高心臟泵血能力，而長(zhǎng)期的力竭運(yùn)動(dòng)則會(huì)損傷心肌引起心肌勞損[3]。此外，力竭運(yùn)動(dòng)引起的過(guò)度疲勞會(huì)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而影響心臟正常功能[4]。

多糖是川赤芝（Ganoderma lucidum）具有藥理作用最主要的活性物質(zhì)之一[5]，被證實(shí)具有抗氧化[6]、增強(qiáng)免疫力[7]、抗炎[8]、抑制心肌細(xì)胞凋亡和促進(jìn)心肌增殖[9]等作用。研究發(fā)現(xiàn)，靈芝多糖能提高心肌細(xì)胞活力，增強(qiáng)心肌細(xì)胞在氧化損傷條件下的存活率及增強(qiáng)機(jī)體心臟組織血流灌注[10]，還可提高心肌細(xì)胞的抗氧化酶活性和能量代謝從而預(yù)防心力衰竭的發(fā)生[11]。另有研究表明，心肌細(xì)胞受到外界異常刺激后易導(dǎo)致氧自由基的大量積累，進(jìn)而引起細(xì)胞毒性加重細(xì)胞損傷[12]。目前，靈芝多糖對(duì)心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用雖有一定的研究，然而川赤芝多糖是否能夠改善運(yùn)動(dòng)疲勞誘導(dǎo)的心肌組織損傷還鮮有報(bào)道，對(duì)其具體的作用機(jī)制還不清晰。鑒于此，本研究首先對(duì)川赤芝多糖進(jìn)行純化處理；然后通過(guò)連續(xù)灌胃小鼠多糖水溶液，測(cè)定小鼠力竭游泳運(yùn)動(dòng)時(shí)間和抗疲勞相關(guān)生化指標(biāo)，研究其對(duì)小鼠的抗疲勞效果；最后建立小鼠遞增負(fù)荷游泳運(yùn)動(dòng)疲勞模型，觀察多糖對(duì)疲勞小鼠心臟的保護(hù)作用，通過(guò)檢測(cè)心肌組織中抗氧化酶活性和相關(guān)蛋白表達(dá)情況，探討川赤芝多糖對(duì)運(yùn)動(dòng)疲勞誘導(dǎo)下心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

川赤芝（川圓芝1號(hào)） 來(lái)源于四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，經(jīng)陳秀炳鑒定為川赤芝[13]；SPF級(jí)小鼠 購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)，許可證號(hào)：SCXK桂2020-0002；KH2PO4、乙醇、Tris-HCl、磷酸鹽緩沖液、NaOH、水楊酸、HCl、MgSO4·7H2O等 均為分析純?cè)噭?；一抗（Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3、GAPDH） 北京百奧萊博科技有限公司；一抗（Nrf2、HO-1） 美國(guó)Abcam公司；肝糖原（hepatic glycogen，HG）、肌糖原（muscle glycogen，MG）檢測(cè)試劑盒 南京建成生物工程研究所；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）檢測(cè)試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

Eyelaosb 2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 日本東京理化；Beta 2-8 LSCplus冷凍干燥機(jī) 德國(guó)CHRIST；ELx800酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Tek寶特；LT841Y-2恒溫干燥箱蘇州格瑞達(dá)電子設(shè)備有限公司；CKX41-A32FL/PH熒光倒置顯微鏡 四川中浪科技有限公司；Mini-PROTEAN蛋白電泳儀、Gel Doc XR+化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 川赤芝粗多糖的提取 參考金鑫等[14]的方法，將川赤芝子實(shí)體在60 ℃烘箱中放置0.5 h，然后在45 ℃下烘干至恒重，備用。切片后粉碎，顆粒直徑小于0.5 cm。稱取2000.0 g粉末，加入30 L蒸餾水，100 ℃條件下煎煮，每次煎煮1 h，重復(fù)操作2次，合并濾液，50 ℃烘箱中放置24 h，然后45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至約30 mL，經(jīng)過(guò)3000 Da膜過(guò)濾，向溶液中加入同體積1/3的Sevag試劑（V氯仿:V正丁醇=4:1）混合振蕩后靜置30 min，重復(fù)多次至無(wú)蛋白質(zhì)產(chǎn)生，收集上層液體。除蛋白后的多糖，再經(jīng)過(guò)95%酒精醇沉，經(jīng)5000 r/min離心10 min去上清，冷凍干燥保存。

1.2.2 川赤芝多糖分離純化 稱取干燥后的川赤芝多糖10 g，溶于200 mL無(wú)菌蒸餾水中，將其上樣到DEAE纖維素柱分離，采用0.5 mol/L的NaCl溶液洗脫，洗脫速度控制1.0 mL/min，分管收集，合并洗脫液后上樣Sephadex G-100凝膠柱進(jìn)行分離，用0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液進(jìn)行洗脫，控制5 min/管，收集10管，收集液冷凍干燥后即得到川赤芝多糖純品。多糖純度采用苯酚-硫酸法測(cè)定[15]。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組

1.2.3.1 小鼠力竭游泳試驗(yàn)I組 小鼠游泳試驗(yàn)操作規(guī)程嚴(yán)格遵守廣西財(cái)經(jīng)學(xué)院和廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)提供的指導(dǎo)方案執(zhí)行。24只SPF級(jí)雄性昆明小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，第2周開(kāi)始隨機(jī)將小鼠分為4組，每組6只，分別為空白對(duì)照組（Con-A1）、川赤芝多糖低劑量組（10 mg/mL，GLP-L1）、川赤芝多糖中劑量組（25 mg/mL，GLP-M1）和川赤芝多糖高劑量組（50 mg/mL，GLP-H1），Con-A1組灌胃無(wú)菌生理鹽水。每天按照設(shè)計(jì)方案給小鼠灌胃一次，灌胃體積均為0.1 mL/10 g，連續(xù)灌胃4周，最后一次灌胃結(jié)束2 h后，對(duì)每只小鼠進(jìn)行稱重，在小鼠尾根處系上體質(zhì)量5%的鉛絲，進(jìn)行負(fù)重游泳試驗(yàn)，試驗(yàn)期間確保小鼠一直處于肌肉緊張狀態(tài)直到小鼠頭部沉入水下7 s，記錄小鼠開(kāi)始游泳至力竭時(shí)間。

1.2.3.2 小鼠游泳試驗(yàn)II組 小鼠的分組及灌胃劑量、體積均參照1.2.3.1，分組編號(hào)為：Con-A2、GLPL2、GLP-M2、GLP-H2。連續(xù)灌胃5周，最后一次灌胃結(jié)束2 h后，進(jìn)行60 min無(wú)負(fù)重游泳試驗(yàn)，游泳結(jié)束后立即麻醉小鼠并通過(guò)尾巴靜脈采血，4000 r/min冷凍離心，5 min，上清液血清-20 ℃保存。采血后的小鼠頸椎脫臼處死，取小鼠肝臟和后腿骨骼肌肌肉，按照試劑盒操作處理肝臟和骨骼肌肌肉并保存于?80 ℃超低溫冰箱中。采用試劑盒檢測(cè)肝臟中HG、骨骼肌肌肉中MG和血清中BLA、BUN含量。

1.2.3.3 小鼠游泳疲勞試驗(yàn)III組 將30只SPF級(jí)雄性小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為：空白對(duì)照組（Con-A3）、運(yùn)動(dòng)模型組（M-Con3）、川赤芝多糖低劑量組（10 mg/mL，GLP-L3）、川赤芝多糖中劑量組（25 mg/mL，GLP-M3）、川赤芝多糖高劑量組（50 mg/mL，GLP-H3），試驗(yàn)期間按照設(shè)計(jì)方案給小鼠灌胃1次/d，各組灌胃體積均按照小鼠體質(zhì)量0.1 mL/10 g，連續(xù)灌胃6周，具體的疲勞運(yùn)動(dòng)方案見(jiàn)表1。

表1 小鼠遞增負(fù)荷疲勞模型游泳試驗(yàn)訓(xùn)練方案Table 1 Training program of swimming test in mice model of increasing load fatigue

1.2.4 游泳疲勞試驗(yàn)III組小鼠心臟切片形態(tài)觀察最后一次游泳結(jié)束2 h后，小鼠頸椎脫臼處死，立即解剖取出心臟，用冰上預(yù)冷的PBS溶液清洗2次，再流水沖洗1次，分割成2份，一份用4%的多聚甲醛溶液固定過(guò)夜（16 h），石蠟包埋，切片、HE染色，倒置顯微鏡下觀察心臟組織病變情況。另一份心臟組織?80 ℃保存用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.5 心肌組織抗氧化酶活性和MDA含量測(cè)定分別稱取Con-A3、M-Con3、GLP-L3、GLP-M3和GLP-H3組小鼠心肌組織，按照1:4的比例加入預(yù)冷的PBS，研磨后離心取上清液，BCA法檢測(cè)各組蛋白濃度，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)分別測(cè)定游泳疲勞試驗(yàn)中各組小鼠心肌組織中SOD、CAT、GSH-Px活性和MDA含量。

1.2.6 疲勞模型試驗(yàn)小鼠心肌組織蛋白表達(dá)測(cè)定取方法1.2.5制備的心肌組織蛋白樣品液，取20 μg進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，4%脫脂奶粉4 ℃封閉2 h，加入一抗，4 ℃封閉過(guò)夜（12 h），加入二抗孵育1 h，PBS清洗，ECL試劑顯色，用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)拍照，采用Quantity One軟件分析各條帶灰度值并與GAPDH比較計(jì)算目標(biāo)蛋白的表達(dá)豐度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用Excel 2010整理，SPSS 22.0進(jìn)行組間單因素方差分析，數(shù)據(jù)使用（±s）表示；Graphpad prism 8.0進(jìn)行作圖分析，One-way ANOVA差異顯著分析；R語(yǔ)言3.6.3，Psych程序包計(jì)算相關(guān)性系數(shù)和顯著性差異，用Corrplot程序包畫圖。以P<0.05表示數(shù)據(jù)差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 川赤芝多糖對(duì)小鼠體質(zhì)量和力竭游泳時(shí)間的影響

從表2看知，小鼠經(jīng)過(guò)1周適應(yīng)性喂養(yǎng)后，Con-A1、GLP-L1、GLP-M1、GLP-H1組間小鼠體質(zhì)量均無(wú)顯著差異（P>0.05）；在持續(xù)灌胃的4周中，小鼠的體質(zhì)量組間均無(wú)顯著差異（P>0.05）。可見(jiàn)，川赤芝多糖對(duì)小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育不存在促進(jìn)或抑制作用。

表2 川赤芝多糖對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響Table 2 Effect of Ganoderma lucidum polysaccharide on body weight of mice

力竭游泳時(shí)間的長(zhǎng)短可以直接反映小鼠的運(yùn)動(dòng)耐力，是機(jī)體抗運(yùn)動(dòng)性疲勞最直接指標(biāo)[16]。從圖1中可知，Con-A1組小鼠力竭游泳時(shí)間最短，僅為13.64±1.91 min，GLP-H1組小鼠力竭游泳時(shí)間最長(zhǎng)為25.98±1.53 min；與Con-A1相比，GLP-L1、GLPM1、GLP-H1小鼠的力竭游泳時(shí)間極顯著增加（P<0.01）。綜上可以看出，灌胃川赤芝多糖可以顯著提高小鼠的力竭游泳時(shí)間，且隨著多糖劑量的提高力竭游泳時(shí)間隨之明顯提高，表明川赤芝多糖具有顯著的抗運(yùn)動(dòng)疲勞作用。

圖1 各組小鼠的力竭游泳時(shí)間Fig.1 Exhaustive swimming time of mice in each group

2.2 川赤芝多糖對(duì)小鼠體內(nèi)糖原儲(chǔ)備的影響

肝糖原（HG）和肌糖原（MG）是機(jī)體儲(chǔ)存能量的兩種形式。較多的研究表明，機(jī)體內(nèi)HG和MG儲(chǔ)備量越高，其為機(jī)體耐力運(yùn)動(dòng)提供更持久的能量[17?18]。由圖2可知，Con-A2組小鼠HG和MG含量均最低，分別為7.26和1.22 mg/g；與Con-A2相比，GLPL2、GLP-M2、GLP-H2組小鼠HG和MG均顯著升高（P<0.01），HG分別增加了33.55%、50.73%和66.16%，MG分別增加了64.18%、106.80%和117.21%。可見(jiàn)，川赤芝多糖可以顯著提高小鼠體內(nèi)HG和MG的含量，進(jìn)而表現(xiàn)出顯著的抗疲勞能力。

圖2 小鼠體內(nèi)肝糖原和肌糖原的變化Fig.2 Changes in the HG and MG contents of mice

2.3 川赤芝多糖對(duì)小鼠血乳酸（BLA）和血尿素氮（BUN）含量的影響

機(jī)體在高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)時(shí)體內(nèi)細(xì)胞無(wú)氧呼吸作用增強(qiáng)，會(huì)將葡萄糖分解成大量乳酸，從而引發(fā)肌肉酸痛無(wú)力；當(dāng)體內(nèi)脂肪和碳水化合物消耗殆盡時(shí)，會(huì)通過(guò)蛋白質(zhì)代謝來(lái)獲得足夠的能量，從而導(dǎo)致血清中尿素氮（BUN）的含量升高，使機(jī)體出現(xiàn)疲勞現(xiàn)象[19]。從圖3可知，Con-A2小鼠BLA和BUN含量均最高，分別為9.19和10.40 mmol/L；與Con-A2相比，GLPL2、GLP-M2、GLP-H2組中BLA、BUN含量均極顯著降低（P<0.01），BLA分別降低了18.40%、34.18%、34.53%，BUN分別降低了32.21%、42.09%、42.45%；與GLP-L2相比，GLP-M2、GLP-H2組中BLA均極顯著降低（P<0.01），GLP-M2、GLP-H2組中BUN均顯著降低（P<0.05），此外，GLP-M2與GLP-H2組中BLA、BUN水平不存在顯著差異（P>0.05）。結(jié)果表明，川赤芝多糖可通過(guò)降低小鼠血液中BLA和BUN含量，來(lái)增強(qiáng)小鼠的抗疲勞作用。

圖3 小鼠血乳酸和血尿素氮含量變化Fig.3 Changes of BLA and BUN contents in mice

2.4 川赤芝多糖對(duì)小鼠心肌組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

從表3看知，與空白對(duì)照組（Con-A3）相比，游泳運(yùn)動(dòng)組小鼠心肌組織中MDA含量均顯著升高（P<0.05），抗氧化酶活性均顯著降低（P<0.05），說(shuō)明運(yùn)動(dòng)性疲勞導(dǎo)致心肌細(xì)胞發(fā)生了脂質(zhì)過(guò)氧化，破壞了體內(nèi)氧化和抗氧化平衡；與M-Con3相比，GLP-L3、GLP-M3、GLP-H3組小鼠心肌組織中MDA含量均顯著降低（P<0.05），SOD、CAT和GSH-Px活力均顯著升高（P<0.05），可見(jiàn)，川赤芝多糖對(duì)運(yùn)動(dòng)性疲勞造成的心肌組織損傷具有較明顯的保護(hù)作用，一定程度上能緩解心肌組織內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化和氧化應(yīng)激損傷。

表3 川赤芝多糖對(duì)小鼠心肌組織MDA含量和抗氧化酶活性的影響Table 3 Effects of Ganoderma lucidum polysaccharide on MDA content and antioxidant enzyme activity in myocardial tissue of mice

2.5 小鼠體內(nèi)抗疲勞指標(biāo)與抗氧化指標(biāo)間的相關(guān)性分析

小鼠的力竭游泳時(shí)間與抗疲勞和抗氧化指標(biāo)間的相關(guān)系數(shù)可視熱圖見(jiàn)圖4，熱圖顯示力竭游泳時(shí)間（Time）與HG、MG、SOD、CAT、CSH-Px呈現(xiàn)顯著正相關(guān)性（P<0.01），相關(guān)系數(shù)均大于0.8；力竭游泳時(shí)間與BLA、BUN、MDA呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性，其中與BUN、MDA呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)性（P<0.01），相關(guān)系數(shù)大于0.8，而與BLA的負(fù)相關(guān)性較小。此外，抗疲勞指標(biāo)（HG、MG）與抗氧化酶活性（SOD、CAT、CSHPx）顯著正相關(guān)（P<0.01），而與BUN、MDA呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01）。結(jié)果顯示，提高機(jī)體HG、MG含量和SOD、CAT、CSH-Px活性能提高小鼠的抗運(yùn)動(dòng)疲勞作用，另外降低機(jī)體內(nèi)BUN、MDA含量對(duì)小鼠的抗運(yùn)動(dòng)疲勞同樣起著重要作用。

圖4 力竭游泳時(shí)間與抗疲勞、抗氧化指標(biāo)間的相關(guān)性Fig.4 Relation between exhausting swimming time and indicators of anti-fatigue and antioxidant activity

2.6 川赤芝多糖對(duì)遞增負(fù)荷游泳疲勞小鼠心臟組織結(jié)構(gòu)形態(tài)變化的影響

如圖5所示，Con-A3組小鼠心臟細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞核清晰分明，細(xì)胞排列規(guī)律，未見(jiàn)細(xì)胞間出現(xiàn)明顯擴(kuò)張或擠壓現(xiàn)象，說(shuō)明細(xì)胞未出現(xiàn)腫脹和炎癥；M-Con3組小鼠細(xì)胞間間隙明顯增大，細(xì)胞充血嚴(yán)重（圖5B箭頭1），細(xì)胞排列不規(guī)則，包間間隙處出現(xiàn)嚴(yán)重炎癥浸潤(rùn)（圖5B箭頭2），部分細(xì)胞出現(xiàn)空泡現(xiàn)象（圖5B箭頭3），核仁排列雜亂；GLP-L3組小鼠心臟細(xì)胞組織形態(tài)變化較M-Con3組有一定改善，細(xì)胞空泡現(xiàn)象減少，細(xì)胞皺縮程度減輕（圖5C箭頭1），但仍見(jiàn)有水腫現(xiàn)象（圖5C箭頭2）；GLP-M3組則出現(xiàn)明顯改善，細(xì)胞排列有一定規(guī)律、平整（圖5D箭頭1），細(xì)胞皺縮程度進(jìn)一步減輕，細(xì)胞間縫隙也進(jìn)一步減小（圖5D箭頭2），細(xì)胞水腫、炎癥現(xiàn)象得到明顯好轉(zhuǎn)；GLP-H3組小鼠心臟細(xì)胞組織損傷進(jìn)一步改善，細(xì)胞整體排列較規(guī)則，細(xì)胞核均勻分布，核仁明顯（圖5E箭頭1），細(xì)胞間隙改善顯著（圖5E箭頭2），細(xì)胞活性增強(qiáng)?？梢?jiàn)，川赤芝多糖對(duì)小鼠遞增負(fù)荷疲勞運(yùn)動(dòng)所致心臟損傷具有顯著的改善作用，且隨著劑量增加改善效果更好。

圖5 小鼠的心臟組織病理切片F(xiàn)ig.5 Histopathological section of mice heart

2.7 川赤芝多糖對(duì)小鼠心肌組織中Nfr-2、HO-1蛋白表達(dá)的影響

Keap1-Nrf2/ARE信號(hào)通路是細(xì)胞緩解外界脅迫產(chǎn)生氧化應(yīng)激的主要通路，Nrf2是調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化應(yīng)激最重要的因子，其可以提高下游相關(guān)抗氧化酶的高表達(dá)來(lái)減輕細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，HO-1正是Nrf2/ARE信號(hào)通路下游的一種內(nèi)源性抗氧化蛋白酶，HO-1的高表達(dá)可以提高細(xì)胞抗氧化的能力，進(jìn)而緩解細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)[20]。如圖6所示，與Con-A3組相比，M-Con3組心肌細(xì)胞中Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)極顯著下調(diào)（P<0.01）；與M-Con3組相比，GLP-L3、GLP-M3、GLP-H3組心肌組織中Nrf2和HO-1表達(dá)水平均極顯著提高（P<0.01），GLP-H3組Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)量均最高。結(jié)果表明，遞增負(fù)荷游泳降低了小鼠心肌細(xì)胞中Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)，川赤芝多糖干預(yù)后，Keap1-Nrf2/ARE信號(hào)通路被激活，促進(jìn)了下游抗氧化酶HO-1的表達(dá)，從而提高了細(xì)胞的抗氧化水平。

圖6 心肌組織中Nrf-2和HO-1的蛋白表達(dá)Fig.6 Protein expression of Nrf-2 and HO-1 in myocardial tissue

2.8 川赤芝多糖對(duì)小鼠心肌組織中Bax、Cleaved Caspase-3和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

圖7可知，與Con-A3相比，運(yùn)動(dòng)組（M-Con3、GLP-L3、GLP-M3、GLP-H3）心肌細(xì)胞內(nèi)3種蛋白表達(dá)量均發(fā)生了較明顯的變化，其中促凋亡蛋白（Bax）水平均顯著升高（P<0.01），另外，M-Con3和GLP-L3、GLP-M3組中加速細(xì)胞凋亡蛋白（Cleaved Caspase-3）水平均極顯著升高（P<0.01），抗凋亡蛋白（Bcl-2）水平則極顯著降低（P<0.01），而GLP-H3組Cleaved Caspase-3、Bcl-2蛋白水平與Con-A3不存在顯著差異（P>0.05）；與M-Con3相比，GLP-L3、GLP-M3、GLP-H3細(xì)胞中Bax、Cleaved Caspase-3蛋白水平均極顯著降低（P<0.01），Bcl-2蛋白水平則極顯著升高（P<0.01）；從各組心肌細(xì)胞中Bax/Bcl-2的比值上看，Con-A3的比值最低，其細(xì)胞生長(zhǎng)正常，其次是GLP-H3、GLP-M3、GLP-L3，而M-Con3組中其比值高于2.0，表明M-Con3組心肌細(xì)胞趨于凋亡狀態(tài)?？梢?jiàn)，川赤芝多糖能提高心肌細(xì)胞Bcl-2的表達(dá)，同時(shí)抑制Bax和Cleaved Caspase-3的表達(dá)，且隨著多糖劑量的升高表現(xiàn)出一定的依賴性，結(jié)果表明，川赤芝多糖能夠抑制心肌細(xì)胞凋亡提高細(xì)胞免疫力，從而達(dá)到抗疲勞的目的。

圖7 心肌組織中Bax、Cleaved Caspase-3和Bcl-2蛋白表達(dá)Fig.7 Expression of Bax, Cleaved Caspase-3 and Bcl-2 proteins in myocardial tissue

3 討論

力竭游泳模型被認(rèn)為是衡量機(jī)體抗疲勞能力最有效的試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，力竭游泳時(shí)間長(zhǎng)短可以直接反映出機(jī)體的運(yùn)動(dòng)能力和抗疲勞能力，本研究結(jié)果表明，灌胃川赤芝多糖后顯著延長(zhǎng)了小鼠的力竭游泳時(shí)間（P<0.05），且力竭游泳時(shí)間與多糖劑量呈現(xiàn)較好的依賴關(guān)系，提示川赤芝多糖能夠增強(qiáng)小鼠的抗疲勞能力。另外，大量的研究表明，機(jī)體在高強(qiáng)度或持續(xù)性運(yùn)動(dòng)會(huì)分解體內(nèi)大量的葡萄糖，使血糖水平下降，為補(bǔ)充血糖平衡，儲(chǔ)存的HG、MG會(huì)被分解，當(dāng)HG、MG消耗殆盡時(shí)，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的疲勞感[21?22]，本研究結(jié)果顯示，與Con-A2相比，GLP-L2、GLP-M2、GLP-H2組小鼠HG、MG的含量顯著提高（P<0.05），從而增強(qiáng)了小鼠的抗疲勞作用。此外，機(jī)體在高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)過(guò)程中，骨骼肌會(huì)產(chǎn)生大量的乳酸，同時(shí)，機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)也會(huì)代謝供能產(chǎn)生大量的尿素氮，過(guò)多的乳酸和尿素氮會(huì)滲入血液中，使機(jī)體內(nèi)環(huán)境酸堿平衡被打破，從而加重機(jī)體的疲勞感[23]，BLA、BUN的清除水平與機(jī)體抗疲勞能力呈正相關(guān)，本研究結(jié)果表明，空白對(duì)照組中BLA、BUN水平顯著高于川赤芝多糖組（P<0.05），可見(jiàn)，川赤芝多糖提高了小鼠清除BLA、BUN的能力，從而提高抗疲勞作用。

細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平對(duì)機(jī)體的抗疲勞能力具有重要影響。研究表明機(jī)體處于運(yùn)動(dòng)疲勞狀態(tài)中時(shí)，細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶（SOD、CAT、GSH-Px）的活性會(huì)降低，在補(bǔ)充外源抗氧化劑后，細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性會(huì)明顯升高，機(jī)體的抗疲勞能力得到增強(qiáng)[24]。MDA是細(xì)胞膜脂過(guò)氧化的重要產(chǎn)物，MDA含量大量積累會(huì)嚴(yán)重影響抗氧化酶活性水平，SOD、CAT、GSH-Px屬于心肌細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化酶，能較全面反映細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平，研究證明，長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)性疲勞與心腦血管疾病發(fā)病率呈正相關(guān)[25]。另有研究表明，靈芝多糖的抗疲勞和對(duì)心腦血管的保護(hù)作用均與多糖的強(qiáng)抗氧化和清除自由基的能力有密切關(guān)系，李欣[26]、莫雙瑗[27]均研究發(fā)現(xiàn)靈芝多糖通過(guò)提高小鼠體內(nèi)抗氧化酶的活性來(lái)發(fā)揮抗疲勞作用。本研究結(jié)果顯示，川赤芝多糖組小鼠心肌細(xì)胞內(nèi)MDA含量較模型組均出現(xiàn)了顯著降低（P<0.05），且隨著多糖劑量的增加MDA含量隨之顯著降低（P<0.05），另外，模型組心肌細(xì)胞中SOD、CAT、GSH-Px的酶活性均最低，說(shuō)明模型組小鼠處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。灌胃川赤芝多糖后，心肌細(xì)胞中SOD、CAT、GSH-Px的酶活性均得到明顯提高，進(jìn)一步說(shuō)明川赤芝多糖可有效清除心肌細(xì)胞內(nèi)過(guò)多的氧自由基，降低脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)生的MDA，提高抗氧化酶生物活性。與此同時(shí)，通過(guò)心臟組織的微結(jié)構(gòu)病理?yè)p傷研究，發(fā)現(xiàn)川赤芝多糖可有效改善心臟組織損傷，使細(xì)胞水腫、炎癥現(xiàn)象得到明顯好轉(zhuǎn)，說(shuō)明川赤芝多糖對(duì)運(yùn)動(dòng)性疲勞造成的心肌組織損傷具有較好的保護(hù)作用，川赤芝多糖一定程度上能夠降低心肌組織內(nèi)氧化應(yīng)激水平。本研究結(jié)果與上文提到的相關(guān)學(xué)者的研究報(bào)道結(jié)果相似，這可能是川赤芝多糖保護(hù)心肌細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷的作用機(jī)制之一[28]。

Nrf2信號(hào)通路是機(jī)體對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)通路，機(jī)體在正常的生理狀態(tài)下，大部分Nrf2分子與Keap1結(jié)合成二聚體，此時(shí)Nrf2活性被抑制，當(dāng)細(xì)胞受到外源刺激時(shí)，Nrf2-Keap1結(jié)合的二聚體解離，Nrf2被激活轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核與ARE應(yīng)答元件結(jié)合，啟動(dòng)Nrf2信號(hào)通路，位于該信號(hào)通路的下游抗氧化酶基因（HO-1）被激活，且HO-1受到受其上游啟動(dòng)因子Nrf2蛋白的調(diào)控[29]，可見(jiàn)，Nrf2/HO-1信號(hào)通路在機(jī)體細(xì)胞抵御氧化應(yīng)激起著重要調(diào)節(jié)作用。本研究結(jié)果表明，遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)疲勞使小鼠心肌細(xì)胞中Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)量下降，在通過(guò)川赤芝多糖干預(yù)后，Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)量顯著上升（P<0.05），可見(jiàn)川赤芝多糖能激活心肌細(xì)胞中Nrf2/ARE信號(hào)通路，促進(jìn)下游抗氧化酶HO-1的表達(dá)，從而提高了細(xì)胞抵御氧化應(yīng)激的能力。

徐文等[30]研究認(rèn)為，力竭運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)了小鼠心肌細(xì)胞非正常凋亡，細(xì)胞核形態(tài)結(jié)構(gòu)異常，細(xì)胞凋亡率增加；張龍飛等[31]研究認(rèn)為，過(guò)度疲勞使小鼠心肌細(xì)胞內(nèi)線粒體功能發(fā)生紊亂，心肌細(xì)胞因?yàn)槿毖蛲?。因此，研究認(rèn)為長(zhǎng)期的力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致心肌細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，是運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致心肌結(jié)構(gòu)損傷的直接因素。有研究表明，Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3基因的蛋白表達(dá)水平在細(xì)胞凋亡的功能調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用[32?33]，Bcl-2是一種典型的能夠抑制機(jī)體細(xì)胞凋亡的抗凋亡蛋白，而B(niǎo)ax的功能與Bcl-2恰恰相反，在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)Cleaved Caspase-3蛋白會(huì)迅速被激活，并加速細(xì)胞凋亡，且這種凋亡不能被恢復(fù)[34]。因此，為進(jìn)一步研究川赤芝多糖對(duì)遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)疲勞誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用機(jī)理，檢測(cè)了心肌細(xì)胞中Bax、Bcl-2和Cleaved Caspase-3的蛋白表達(dá)情況，研究結(jié)果顯示，與疲勞模型組相比，川赤芝多糖處理組小鼠心肌細(xì)胞內(nèi)3種蛋白的表達(dá)水平發(fā)生了顯著改變，川赤芝多糖能提高心肌細(xì)胞抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，同時(shí)抑制Bax和Cleaved Caspase-3的表達(dá)，且隨著多糖劑量的升高表現(xiàn)出一定的依賴性，結(jié)果進(jìn)一步表明川赤芝多糖具備改善遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)小鼠的疲勞作用。

4 結(jié)論

綜上，川赤芝多糖能顯著提高小鼠HG、MG含量，并降低BLA、BUN水平，同時(shí)還提高了心肌細(xì)胞中SOD、CAT、GSH-Px的酶活性。川赤芝多糖對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用可能與其激活Nrf2/ARE信號(hào)通路有關(guān)，通過(guò)提高下游抗氧化酶的高表達(dá)來(lái)減輕細(xì)胞的氧化應(yīng)激作用，此外，還可能與提高心肌組織中Bcl-2蛋白表達(dá)量并下調(diào)Bax和Cleaved Caspase-3的蛋白表達(dá)來(lái)抑制心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。本研究為川赤芝多糖的抗疲勞作用機(jī)制提供了一定理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為川赤芝多糖對(duì)提高機(jī)體運(yùn)動(dòng)能力的臨床應(yīng)用提供參考。